Journal of Experimental & Clinical Assisted Reproduction, 2005; 2: 7-7 (más artículos en esta revista)

Una comparación de polarizado y no polarizado humanos endometrial monocapa cultura de los sistemas de desarrollo de embriones murinos

BioMed Central
Mohamad Reza Baghaban Eslami Nejad (bagesla@yahoo.com) [1], Mojtaba Rezazadeh Valojerdi (MR_valojerdi@Modares.ac.ir) [1], Said Kazemi Ashtiani (Kazemi@royaninstitute.org) [1]
[1] Departamento de Embriología, Instituto Royan, Teherán, Irán
[2] Departamento de Anatomía de la Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Tarbiat Modarres, Teherán, Irán

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Resumen
Antecedentes

Co-cultivo de embriones con diversas células somáticas se ha sugerido como un enfoque prometedor para mejorar el desarrollo del embrión. A pesar de los numerosos informes acerca de los efectos beneficiosos de las células epiteliales del tracto genital femenino en el desarrollo del embrión en un sistema de co-cultivo, se sabe poco sobre el efecto de estas células cuando se cultivaron bajo una condición polarizada sobre el crecimiento del embrión. Nuestro estudio evaluó los efectos de las células in vitro polarizada pre-embrión en desarrollo.

Métodos

Humanos tejido endometrial uterino se obtuvo de especímenes extirpados en la histerectomía total realizado por indicaciones benigna. Células epiteliales fueron rápidamente aisladas y cultivadas, ya sea en la matriz extra celular-gel (ECM-Gel) recubiertos filtro millipore inserciones (polarizado) o superficies de plástico (no polarizado). La naturaleza epitelial de las células cultivadas en plástico fue confirmada mediante inmunohistoquímica, y la polarización de las células cultivadas en ECM-Gel fue evaluada por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Uno o dos células de embriones de una etapa superovulated NMRI ratón y luego fueron volcadas en la cultura, ya sea con polarizado o no polarizado células y medio solo. Se determinaron las tasas de desarrollo de todos los embriones diario y estadísticamente comparados. Al final del período de cultivo, trophectoderm (TE) y la masa celular interna (ICM), de ampliación de los blastocistos de cada grupo se examinaron microscópicamente.

Resultados

Endometrial células epiteliales cultivadas en ECM-Gel tenía una forma altamente polarizada columnar en oposición a la forma aplanada de las células cultivadas sobre una superficie de plástico. Los dos embriones de células cultivadas en monocapa polarizada tuvieron una mayor tasa de desarrollo que los de las células no polarizado. No hubo diferencia estadísticamente significativa; aún, los blastocistos de la monocapa polarizada, en comparación con el grupo no polarizado, tuvo una media significativamente mayor número de células. El desarrollo de una sola célula de embriones en el polarizado y no polarizado grupos no mostraron diferencias estadísticamente significativas.

Conclusión

Polarizado células podría mejorar el desarrollo in vitro de embriones a partir de la etapa de dos células más en términos de calidad (el aumento de celularidad blastocisto) que en términos de tasa de desarrollo.

Antecedentes

El desarrollo de los embriones in vivo se alimentan de las células y el líquido de la trompa de falopio y el endometrio uterino [1, 2]. In vitro de embriones cultura priva a las células del entorno de la madre, donde están bañadas en un entorno siempre cambiante de líquido que contiene una serie de proteínas específicas de los iones y el proceso reproductivo [3, 4]. Aunque los embriones de mamíferos pueden ser cultivadas in vitro, in vivo el desarrollo es superior en términos de tasa de desarrollo [5 - 7], el número de células [6], diversos parámetros bioquímicos y la supervivencia después de la transferencia de embriones [8, 9]. Los intentos de mejorar las condiciones de cultivo in vitro modificando la composición de electrolitos y energía sustratos han tenido un éxito limitado [1, 10]. Para resolver este problema, y en contraste con la utilización de un medio por sí solo, una serie de sistemas de co-cultivo de células que imitan el entorno de embryotrophic el aparato genital se han elaborado en el que pueden desarrollar embriones a la incubación de blastocistos y blastocistos etapas [11 - 16] . Aunque los efectos beneficiosos de los sistemas de co-cultivo han sido formuladas por una serie de investigadores, el mecanismo de acción de las células co-cultura no ha sido completamente aclarada. Varios investigadores han propuesto que la cultura co-optimizar los sistemas de cultivo in vitro en condiciones de secretar embryotrophic sustancia (s) en el medio de cultivo [17] y la eliminación de embriotóxico material del mismo [18]. Alimentación de la célula del embrión y del contacto también es necesaria para permitir que las conexiones entre el celular y la zona de alimentación de las células para la transferencia de la transferencia de tales embryotrophic factor (s) [19]. Para preparar un sistema de co-cultivo, las células epiteliales por lo general se cultivan en una superficie de plástico, en forma de monocapa; embriones son cultivados en el mismo. Varios estudios han demostrado que la cultura durante el procedimiento realizado en superficies de plástico, las células epiteliales perder polaridad y función diferenciada (como la secreción polarizada) en varios días [20 - 23]. Además, el cultivado células pierden su forma cúbica, y no ser plana para mantener sus cruces laterales, incluida la salida apretada y desmosomas. En contraste con la pérdida de la polaridad se produzcan durante convencionales de cultivo de células epiteliales de las superficies de plástico, numerosos estudios han demostrado la retención de la polaridad estructural y función diferenciada, cuando el cultivo condición imita dos aspectos de la conservación in situ de células epiteliales medio ambiente: baso-lateral de alimentación y contacto Con una matriz extra celular-[24 - 27].

Hasta la fecha, varios informes han demostrado que la polaridad retención de las células epiteliales en la cultura (en comparación con las células no polarizado) puede mejorar la motilidad y capacidad fecundante de los espermatozoides co-cultivadas en el mismo [28 - 30]. Hay poca información, sin embargo, en cuanto a cultura de la co-polarizada células y embriones. El objetivo de nuestra investigación era observar polarizado humanos en células endometriales ECM-Gel y para evaluar sus efectos frente a los de los convencionales no polarizado sobre monocapas murino pre-embrión desarrollo.

Métodos
Cultivo de células

Tejido endometrial humano se obtuvo de los pacientes en la fase secreta (de acuerdo a todo el espesor del endometrio y la apariencia histológica de los tejidos) en la histerectomía en el Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital Arash (Teherán, Irán) para benigna indicaciones. El uso de tejido endometrial de la investigación fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Royan (Teherán, Irán). Los centros de tejidos extirpados fue inmediatamente después de la histerectomía y se enjuaga en Hank equilibrado de solución de sal para eliminar la sangre y los desechos antes de ser picada en pequeños trozos de aproximadamente 1 mm 3. Una pequeña porción de cada muestra se fijó en solución de Karnovsky TEM. Fragmentos de tejido fueron digeridos por 0,25% de colagenasa tipo I en un MEDM / HAM 's-F12 (Sigma, EE.UU.), que contiene 100 UI / ml de estreptomicina (Sigma, EE.UU.), 100 UI / ml de penicilina (Sigma, EE.UU.), y el 10% de calor Suero de ternera fetal inactivado (FCS, Gibco, Reino Unido). Después de 1,5 horas, la mayoría de las glándulas se disociarse de los tejidos circundantes y flotaba en el digestate producido por la enzima colagenasa a 37 ° C. El digestate también contenía células del estroma libre y fragmentos sin digerir. La unidad técnica de la sedimentación por gravedad ayudó a aislar las glándulas endometriales de los otros componentes. En primer lugar, la digestate fue trasladado en una de 13 ml tubo de plástico (Falcon, EE.UU.), y después de su volumen fue reconstituido a 12 ml con MEDM / HAM 's-F12, el tubo fue puesto patas arriba a resuspender la digestate. Los fragmentos de endometrio fueron pildoradas por que se les permita establecerse en virtud de la gravedad normal de ~ 1 min, y los pellets que contienen materiales sin digerir posteriormente fueron descartados. Los sobrenadantes de haber sido transferido a otro tubo, las glándulas fueron separados de las células libres, en condiciones normales de la gravedad, bañada por centrifugación (10 min 75 g, × 2) y resuspendido en un medio que contiene 100 UI / ml de estreptomicina, 100 UI / ml de penicilina , El 5% FCS, 10 μ g / ml de factor de crecimiento epidérmico (Sigma, EE.UU.) y 10 μ g / ml, ácido retinoico (Sigma, EE.UU.). A continuación, que se distribuyeron en un filtro de 12 mm de diámetro en las inserciones millicell CM (Millipore, EE.UU.), previamente recubierto con ECM-Gel (Sigma, EE.UU.). Revestidos filtros fueron preparados por la adición de 0,1 ml de 1:4 diluido ECM-Gel en MEDM / HAM 's-F12 a insertar cada uno, seguido por el secado bajo una campana de flujo laminar. Los filtros fueron almacenados en condiciones estériles a 4 ° C. El ECM-Gel revestidos inserciones fueron colocados en un pozo en un nivel de 24 y placa de cultivo de tejidos (poliestireno de plástico, Falcón, EE.UU.), que contiene una MEDM HAM's-F12 medio. Densidad de siembra óptima se logra cuando las glándulas que abarca aproximadamente el 30% de la superficie que les permite explante en monocapas de moda. Las culturas suelen ser confluente después 7d. Alícuotas de la glándula suspensión también fueron cultivadas en paralelo en un pozo de 24-así poliestireno plato antes de las placas se colocaron en una incubadora. El medio se reemplazó cada 3 días.

La microscopía electrónica de transmisión

Las culturas en ECM-gel y el tejido material se fijó para el 1 h fijador de Karnovsky a temperatura ambiente y, a continuación, fijador y se eliminó la cultura y el tejido lavado con 0,1 M OsO 4 (Sigma, EE.UU.) en buffer fosfato 0,1 M × 1 H a 20 ° C. El ECM-Gel recubiertos de filtro, que contiene células epiteliales glandulares, fue cortada del millicell insertar con un bisturí y sometidos en paralelo con el tejido material clasificado a la deshidratación de etanol antes de ser incorporados en Araldite (Araldite 2005, Sigma, EE.UU.).

Las células fueron cultivadas en procesado de plástico de la misma manera que utilizan para las células cultivadas en ECM-Gel y de los materiales de los tejidos, pero fueron incorporados de otra manera. En primer lugar, los bloques de plástico que encaja con Araldite se llenaron, y, a continuación, el plástico que contiene las células cultivadas fueron colocadas en los bloques y se coloca a 60 ° C × 18 hrs. Luego, el plástico se ha retirado y se mantuvo dentro de las células de la superficie de la resina en los bloques. Semi-secciones delgadas (0,3 μ m) se hicieron y teñidas con azul de toluidina, mientras que los ultra-delgadas secciones (70-100 nm) se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron usando un microscopio electrónico de transmisión (Ziess TM 900, Alemania) .

Inmunohistoquímica

Un procedimiento de tinción inmunohistoquímica utilizando Dako Envision + sistema de peroxidasa (Dako, Dinamarca) se utilizó con el fin de demostrar la presencia de cytokratin 7. El procedimiento se realizó de conformidad con el método propuesto por el fabricante. En pocas palabras, la peroxidasa endógena se inhibió por incubando las células cultivadas en Termanox coverslip con peroxidasa bloque durante 5 minutos, y luego fueron lavados con agua destilada y se coloca en la solución de lavado. A continuación, la monocapa se incubó, además, con el ratón anticuerpos contra cytokratin 7 en una concentración de 1:15 durante 15 minutos. Después de eso, se superpone con peroxidasa polímero conjugado con la etiqueta de cabra anti-ratón immunoglubins en Tris-Hcl buffer, que contiene proteína transportadora y un agente anti-microbiano durante 30 minutos antes de ser lavadas. El último paso fue una incubación con DAB + sustrato-cromógeno solución durante 10 minutos, seguido de Hematoxylin counterstaining. El control negativo fue monocapa en mancha procedimiento sin anticuerpos, y el control positivo fue de endometrio sección congelada. La mayoría (~ 95%) de las células epiteliales fueron aislados.

Embrión y compañeros de la cultura especificaciones

Mujeres NMRI 6 a 8 semanas de edad, los ratones sometidos a la inducción de la ovulación mediante la inyección de 10 UI de gonadotropina menopáusica humana (HMG, Organon, Holanda), seguido por 48 h después de la inyección de 10 UI de gonadotropina coriónica humana (HCG, Organon, Holanda) . El total de mujeres acoplado con machos de la misma cepa. Ratones con tapones vaginales se consideraron embarazadas y sacrificado por dislocación cervical 20-22 hy 44-48 h post-hCG para uno y dos de células de embriones, respectivamente. Los embriones fueron enrojecimiento de la oviducto con MEDM / HAM 's-F12, que se complementaron con 5 mg / ml de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma, EE.UU.). Morfológicamente normal de los embriones fueron lavados y se agruparon en fresco MEDM / HAM 's F12 medio antes de su uso.

Paralelamente a los ratones superovulación y de recogida de embriones, polarizado y no polarizado epiteliales se prepararon monocapas en placas de 24-así como se ha descrito anteriormente. El día 7 después de la iniciación de la cultura, cuando se convirtió en monocapas confluentes, el medio fue reemplazado con MEDM / HAM 's-F12, que contiene 5 mg / ml de BSA. 24 h más tarde, una o dos células de embriones se cultivaron en el monocapas. En este estudio, el polarizado y no polarizado grupos fueron considerados como grupo experimental I (exp I) y el grupo experimental II (exp II), respectivamente, y el medio por sí sola fue designado como el grupo de control (con). Cada co-cultura experimento se repitió 5 veces. Tasa de desarrollo del embrión se observó cada 24 hrs y registrados para 96 ó 120 h. Etapa temprana división embriones fueron clasificados como degenerados si> 25% de cada embrión citoplásmica figuran fragmentos o si el blastomeres parece oscuro y granular. Morula etapa de blastocisto y los embriones fueron considerados como degenerados si se derrumbó. Por último, los resultados de su desarrollo fueron estadísticamente comparados mediante test χ 2.

Blastocisto tinción diferencial

Al final del cultivo (120 horas para una sola célula y 96 horas de dos células de embriones), la ampliación de los blastocistos de cada grupo fueron seleccionados al azar, y la ICM y TE fueron teñidas diferencialmente según Thouas et al. [31]. Para la tinción de los embriones, los blastocistos fueron incubadas en 500 μ l de solución 1 (BSA libre de buffer Hepes murino de trompas medio líquido + 1% tritón X-100 y 100 μ g / ml de yoduro de propidio, Sigma, EE.UU.), para un máximo de 10 segundos . Blastocistos fueron trasladados de inmediato en 500 μ l de solución 2 (solución fijadora de 100% etanol + 25 μ g / ml bisbenzimide, Sigma, EE.UU.) y almacenados a 4 ° C durante la noche. Manchadas blastocistos fueron transferidos de la solución 2 directamente en glicerol, teniendo cuidado de evitar el arrastre de cantidades excesivas de las soluciones. Blastocistos fueron montados en portaobjetos de cristal en una gota de glicerol, y se realizó el recuento de células a partir de imágenes obtenidas de un microscopio invertido equipado con una lámpara ultravioleta y filtros de excitación (460 nm para el azul y rojo de fluorescencia y 500 nm para el rojo). Los datos se analizaron por medio de un análisis de la varianza (ANOVA).

Resultados
Cultivo de células

Después de un día de ser cultivadas en ECM-Gel, se originó en las células epiteliales de las glándulas, que se extiende en los intervalos entre las glándulas, sin semillas en ECM-Gel revestidos inserta, y confluency llegó a los 7 días. Estas células, en forma columnar y envasados en estrecha colaboración, apareció como una placa epitelial en el ECM-Gel, mientras que las células sobre la superficie de plástico, apareció poligonal y no envasados en estrecha colaboración, llegando confluency después de 5 días de la cultura.

Polarizada estructura de la célula

Las células cultivadas en superficies ECM-Gel tenía una aparición altamente polarizada con un núcleo basal y apical abundantes microvellosidades (Figs. 1a y 1b]. Lateral cruces (como desmosomas y apretado enlaces) están bien establecidos y lámina basal se formó en virtud de las células epiteliales (Fig. 1c]. Los núcleos de las células in vitro fueron algunos eukromatin con invaginación en la envoltura nuclear (Fig. 1b]. Su abundante citoplasma había esférica o alargada mitocondrias y cisternas de rER. En general, las células cultivadas en ECM-Gel fueron similares a los observados en los tejidos.

No polarizado de cultivo celular

Las células cultivadas en superficies de plástico (no polarizado células) fueron de corto y afilado en la sección (Fig. 1d], en oposición a las células columnares en el fragmento de tejido. Estas células sólo había unos pocos procesos apical (Fig. 1e]. Las extensiones de las células adyacentes se observaron a sentar a los demás y al igual que los cruces de desmosomas sujetados juntos; no había apretado nudo (Fig. 1f]. El núcleo de estas células, en comparación con las células epiteliales in vivo, son relativamente grandes. Su citoplasma es relativamente libre de orgánulos; sólo unos mitocondrias, cisternas de rER, y se observaron grandes vacuolas (Fig. 1e].

Desarrollo y blastocisto celularidad
Discusión

Células epiteliales del endometrio humanos ya han sido cultivadas en ECM-Gel para diferentes fines. Bentin-Ley et al. [32, 33] utiliza este sistema de la cultura para estudiar los cambios que se producen en la superficie de las células del epitelio endometrial humano en presencia de un implante de blastocisto, mientras que Arnold et al. [34] estas células cultivadas sobre ECM - Gel para describir el papel regulador de las células del estroma cultivadas en el gel en función de las células epiteliales y la morfogénesis in vitro.

Park et al. [35], estableció un tridimensional endometrial cultura en la que las células del estroma endometrial humanos fueron incorporados en una mezcla de colágeno Iy matrigel; células epiteliales se cultivan antes de ser sustituido por la demandante células (células de cáncer de endometrio de origen epitelial). Estos investigadores estudiaron la invasión de la demandante en las células del estroma fracción. Usando ECM-Gel, Classen-Linke et al. [36] estableció un sistema de cultivo de células de endometrio a la progesterona y el estudio de los receptores estrogénicos, como marcador de moléculas fisiológicamente intactas las células epiteliales por inmunohistoquímica y RT-PCR.

Varios investigadores han planteado la hipótesis de que las células epiteliales polarizadas podrá celebrar promesa para promover el crecimiento y el desarrollo de otras células. Pollard et al. Sugirió que el mantenimiento de la polaridad celular es necesaria para optimizar los sistemas de co-cultura [37]. Habiendo cultivadas de las células epiteliales de las especies bovina y ratón oviductos como una monocapa polarizada utilizando Costar Transwell-Col y haber evaluado también el embrión tróficos potencial de estas células en co-cultivo con un ratón de células de embriones, Ouhibi et al. [38] llegó a la conclusión de que la Mantenimiento de la polaridad de la célula de alimentación de las capas no mejoró el desarrollo del embrión. Cabe señalar que los autores no dijo uso ECM-Gel para la inducción de células de polaridad, ni evaluar la condición de polaridad de la células cultivadas. Otros investigadores han oviducto cultivadas en células epiteliales ECM-Gel y demostrado que la motilidad y capacidad fecundante de los espermatozoides se mejora cuando co-cultivadas con células epiteliales polarizadas (frente a la no polarizada en las células cultivadas de plástico) [28 - 30]. Nuestro trabajo se centró en las células epiteliales humanas uterino que se cultivaron en ECM-Gel como una monocapa polarizada; siguientes polaridad confirmación por TEM, su potencial para mejorar el desarrollo de embriones de ratón se evaluó.

Ultra-estructural evaluación de la polaridad celular ha sido objeto de investigaciones anteriores [22, 39]. Un importante indicador de polaridad en el ultra-plano estructural es la presencia de los cruces apretado en el límite lateral de la membrana apical y dominios. Vega Salas er al. [40] sugiere que la interacción entre las células epiteliales y ECM generado diferencias en la distribución de las proteínas entre en contacto y no contacto con las superficies, y que estas interacciones también perfeccionó la polaridad apical-basal, el signo de utilidad, que es la ubicación de Apretado nudo en la membrana apical-lateral frontera. Este cruce evita la mezcla de proteínas específicas de los diferentes dominios de la membrana. Otros signos de polaridad en la célula ultra-plano estructural incluyen la reducción de la distancia entre dos células adyacentes, la ubicación de los núcleos basales, formación y apical de las microvellosidades. Nuestro ultra-estructural imágenes mostraron que las células cultivadas en ECM-Gel se polares y muy similares a los observados en las células in vivo.

Selección de un medio que puede apoyar tanto el embrión y las células de alimentación presenta el principal desafío en nuestro estudio. Frasor et al. [12] examinaron el crecimiento y el desarrollo de ratón de dos células de embriones humanos utilizando células epiteliales oviducto HTF (un simple medio en condiciones de apoyar el desarrollo del embrión) y MEM-α (un complejo medio capaz de soportar el crecimiento de células somáticas) y Llegó a la conclusión de que la optimización de las características de crecimiento de las células somáticas en la cultura mejoraría el desarrollo del embrión. Varios medios de comunicación fueron utilizados en esta investigación de manera que una monocapa polarizada podría establecerse, no obstante es MEDM / HAM 's-F12 se utilizó como medio de cultivo co-ya que es el único medio apoyar el crecimiento y el mantenimiento de las células polarizadas. MEDM / HAM 's-F12 también ha sido utilizado por otros investigadores como una co-medio de cultivo. En concreto, Freeman et al. [41] dos células cultivadas en embriones de ratón fibroblastos, oviducto, útero y las células epiteliales, así como sobre las células utilizando folicular MEDM / HAM 's-F12 medio. Es de notar que sus tasas de blastocistos fueron ligeramente superiores a los de nuestro estudio, aunque esto podría estar asociado con diferentes cepas de ratón utilizado en cada experimento (B 6 C 3 F 1 versus NMRI).

Nuestra investigación mostró que una sola célula de embriones de la polarizado y no polarizado grupos estadísticamente bien desarrollado en comparación con las del control, pero los grupos polarizada no mostró ventaja sobre el no polarizado grupo cuando se trata de mejorar el desarrollo in vitro de embriones De una etapa de la célula. Esto puede ser a causa de un bloque de desarrollo que ocurren en las dos células etapa, o tal vez la embryotrophic efectos de la polarización monocapa manifiesta sólo cuando el co-sistema de la cultura se inicia mediante el uso de células de dos embriones. Parece que en los sistemas de co-cultura, el mecanismo de activación no es suficiente para superar el bloque de desarrollo del embrión. Esto puede causar que el embrión no responder adecuadamente incluso a la influencia positiva de la polarizada grupo. Esos embriones se espera que tengan una menor tasa de división y la reducción de celularidad en la etapa de blastocisto, en comparación con los co-cultivadas a partir de la etapa 2-celda.

También encontró una proporción similar de TE y de la ICM en los blastocistos que se originó de los dos de uno y dos células de embriones. Parece que independientemente del número total de células, las células mecanismos de asignación de poner especificado proporciones de las células y en la TE ICM cada componente de blastocisto. De hecho, simillar resultados fueron reportados por Sherban et al [12].

Un efecto positivo de un sistema de la cultura polarizada en dos células de embriones de desarrollo se reflejarían como la eficiencia de la producción de blastocistos. Nuestros resultados demuestran que el desarrollo de los blastocistos de embriones cultivados en un estado polarizado adquirir blastomeres significativamente más en comparación con aquellos cultivados en los no polarizados células. Alto número de células significa también son indicativos de los tipos más elevados principios de división de células y la viabilidad. Además, el aumento de la implantación del embrión puede ser el resultado de un aumento de la tasa de producción de líquidos y blastocoel anterior logro de un crítico de eclosión de diámetro [42]; aumento de la producción de lisina por zona TE células también deben ser considerados [43].

Handyside y Hunter [44] demostraron que la proporción de ~ TE aumentó de 60% a principios de los blastocistos de ratón a ~ 83% antes de la implantación. En las primeras 36 h después de la formación de blastocisto, TE componentes aumento exponencial y, a continuación, meseta como el aumento en el número de células retarda ICM, que es coincidente con el período de la apoptosis en la reunión de los comités [45]. Estas influencias como resultado un aumento en la proporción de células en el TE blastocisto durante el período de incubación de blastocistos y expansión. Nuestras observaciones a este respecto son consistentes con los reportados previamente por Sherban et al. [46]. Desde esta puede ser la hipótesis de que los blastocistos con una mayor proporción relativa de células TE son más avanzados que los que tienen una baja proporción de células TE. En el presente estudio, el recuento de células se realizó al final de un intervalo de 120 h cultura. Nuestros resultados indican que la media TE porcentaje de embriones células cultivadas en polarizado es más alta que la de los embriones cultivados en el polarizado de las células, aunque la diferencia no alcanzó significación estadística.

Puede ser que los efectos de embryotrophic experimento I (grupo polarizado) se debe tanto a la ECM y la polarizada células propias, pero hay que señalar que las células cultivadas en ECM-Gel ocupar completamente todas las superficies disponibles de ECM-Gel y, además, apretados Cruces conservar ECM-Gel en la parte baja del compartimiento durante la cultura. Esto tuvo el efecto de hacer ninguna de las superficies expuestas ECM-Gel para influir en el desarrollo del embrión y, por lo tanto, todos los efectos se embryotrophic debido a la altamente polarizada columnar células epiteliales. Influencias positivas de la polarización de células en embriones de crecimiento y celularidad blastocito producido a partir de dos células de embriones de desarrollo pueden ser diferenciadas en razón de su estado y la morfología de matrigel. Dado que las células de alimentación de proporcionar su efecto secretor por un agente embryotrophic, es lógico especular que polarizada por la liberación de células diferentes embryotrophic materiales en el medio de cultivo de embriones puede mejorar la calidad más que sus homólogos no polarizado. Thomas et al. [47] encontraron que las células epiteliales de oviducto polarizado in vitro, tenía una composición diferente de proteínas en comparación con los de las cultivadas de plástico no polarizado células. Asimismo, Wolddesenbet y Newton [48] indicó que las células epiteliales de oviducto cultivadas han polarizado las secreciones similares a los de las cultivadas fragmento de tejido. El efecto de la alimentación de un contacto directo entre las células y embriones en el desarrollo del embrión también debe considerarse, la prevención de este tipo de contacto reduce el efecto positivo de la cultura co-células en el embrión. En polarizado compañeros de los sistemas de cultivo de alimentación de las células columnares están en forma y se encuentran muy cerca unos de otros, por lo que cada embrión establece contacto directo con más células y, probablemente, se vuelve más influencias positivas en comparación con los de la no polarizado células. La determinación de la composición exacta de la polarización de células secreciones y el mecanismo de acción de contacto directo sobre el desarrollo del embrión en los sistemas de co-cultura requiere de más investigación.

Conclusión

Nuestros resultados sugieren que las células epiteliales del oviducto humano, siendo cultivadas en un estado polarizado, podría mejorar la calidad de blastocisto, cuando co-cultivadas con células de embriones de dos (pero no de una célula de embriones). Parece que proporcionar un entorno capaz de soportar la capa de alimentación, así como el crecimiento del embrión in vitro mejorar aún más el desarrollo de una y dos células de embriones de ratón en términos de tasa de formación de blastocistos y de la calidad.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Archivo que contiene la tabla 1 y 2
Archivo Adicional 2
Archivo que contiene la tabla 3 y 4
Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Royan. Damos las gracias al personal del Departamento de Microscopía Electrónica de la Universidad de Sahid Beheshty ultraestructurales de evaluación, y los médicos en el Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital de Arash y Teherán para el suministro de muestras de endometrio.