Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2005; 3: 2-2 (más artículos en esta revista)

Cinética y isotipo perfil de respuestas de anticuerpos en macacos rhesus inducida después de la vacunación con el VPH 6, 11, 16 y 18 L1 virus-like-partículas formulado con o sin adyuvante de aluminio Merck

BioMed Central
Wanda Ruiz (wanda_ruiz@merck.com) [1], William L McClements (william_mcclements@merck.com) [2], Kathrin U Jansen (jansen@mac.com) [2], Mark T Esser (mark_esser@merck.com ) [1]
[1] Vaccine and Biologics Research Merck Research Laboratories 466 Devon Park Dr. Wayne, PA 19087-8630 USA
[2] Vaccine and Biologics Research Merck Research Laboratories West Point, PA 19486 USA

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Resumen
Antecedentes

Virus del papiloma humano (VPH) son los más comunes de los virus de transmisión sexual. De la infección por el epitelio cervical por VPH puede llevar al desarrollo de cáncer cervical. Los recientes avances en la investigación sobre vacunas han demostrado que la vacunación con el virus del papiloma-como partículas (VLP), que contiene los principales problemas estructurales de proteínas virales, L1 de VPH 16 puede proporcionar protección de la creación de una crónica de la infección por VPH 16 y las formas conexas de la neoplasia intraepitelial cervical (CIN) en la base de referencia VPH 16 ingenua mujer.

Métodos

Para entender mejor los efectos cuantitativos y cualitativos de aluminio como adyuvante en la inmunogenicidad propiedades de un VPH 6, 11, 16 y 18L1 vacuna VLP, usamos una VPH específicos, los anticuerpos isotyping ensayo y un inmunoensayo competitivo que mide los anticuerpos para neutralizar a los epítopos perfil Sueros de macacos rhesus inmunizados con la vacuna contra el VPH L1 VLP formulado con o sin adyuvante de aluminio.

Resultados

La inmunización con VLP formulado con el adyuvante de aluminio obtenido una respuesta inmune mucho más fuerte con el pico más alto, tanto en los títulos de anticuerpos cuatro semanas post vacunación (12,7 a 41,9 veces más altos), así como en la persistencia de la fase en la semana 52 (4,3 a 26,7 veces mayor ) Que el de la VLP solo. Además, el aluminio como adyuvante formulado HPV VLP vacuna suscitó predominantemente T helper de tipo 2 la respuesta, con altos niveles de IgG1 e IgG4 y los bajos niveles de IgG2. La vacuna también obtuvo altos niveles de IgA sérica, que puede ser importante en la prestación de inmunidad a la mucosa impartir protección en el tracto anogenital.

Conclusión

Estos resultados muestran que el VPH 6, 11, 16 y 18 L1 VLP-Merck vacuna formulada con el adyuvante de aluminio sólido y provoque una respuesta inmune duradera y mantiene la promesa de una vacuna para prevenir el cáncer cervical.

Antecedentes

El cáncer de cuello uterino sigue siendo una de las principales causas de las muertes relacionadas con el cáncer en la mujer. Infección por VPH es el primer paso para obligar en el desarrollo de cáncer cervical [1]. Casi un cuarto de millón de mujeres mueren de cáncer de cuello uterino y alrededor de medio millón son diagnosticados con esta enfermedad cada año [2]. El cáncer del cuello uterino representa el 12% de todos los cánceres en mujeres y es la segunda neoplasia maligna ginecológica más frecuente en el mundo [3]. Una gran parte de esta carga es la salud en el mundo en desarrollo, donde las mujeres no tienen acceso a una buena asistencia sanitaria y de Papanicolaou (Pap) pantallas. Aunque el uso generalizado de Pap en el mundo desarrollado se ha incrementado la detección precoz de la displasia cervical y el cáncer, a fin de mejorar los resultados del tratamiento para el cáncer cervical, sería mucho más preferible disponer de una vacuna que bloquea la infección por el VPH, lo que impide la iniciación de la Proceso de la enfermedad. Además, los países en desarrollo que por lo general no tienen acceso a Pap y otras medidas de prevención que más se benefician de una vacuna que bloquea la infección por VPH y su posterior enfermedad consecuencias. Por lo tanto, existe una gran necesidad de un eficaz y bien tolerado en general, la vacuna contra el VPH, que tiene una baja tasa de ocurrencia de eventos adversos durante la administración.

Virus del papiloma humano son pequeños doble varados virus ADN. La infección por VPH es la más común de las enfermedades virales de transmisión sexual en todo el mundo [4]. VPH infecta la mucosa cutánea y células epiteliales y las causas benignas y malignas hyperproliferative lesiones, que incluye las verrugas genitales y el cáncer cervical [5]. Hasta la fecha, más de 100 tipos de VPH han sido identificados. De estos, 35 infectan el tracto genital [6, 7]. Tipos de VPH genital pueden dividirse en dos grandes categorías: bajo riesgo a los tipos que causan verrugas genitales, displasia cervical, pero poco cáncer, y los tipos de alto riesgo, que causan displasia que puede progresar a cáncer. VPH tipo 16 y 18 de infección causa del 70% de los casos de cáncer y el 25% de la displasia cervical de bajo grado [8]. Los tipos de VPH 6 y 11, por otra parte, causa aproximadamente el 95% de las verrugas genitales (condilomas acuminados o verrugas venéreas), y el 25% de la displasia cervical de bajo grado (CIN1) [9, 10]. Así, la orientación de una vacuna de VPH 6, 11, 16 y 18 se centrarán en la mayoría de VPH relacionados con la enfermedad clínica.

Recientemente, se informó de una prueba de concepto para un estudio de eficacia profiláctica vacuna de VPH 16 L1 virus-like partículas (VLP) formulado sobre Merck adyuvante de aluminio (MAA) [11]. El estudio doble ciego aleatorizado 2391 mujeres (16-23 años) para recibir placebo o tres dosis de 40 μ g de VLPs de VPH 16 en un 0, 2, y 6 meses régimen. La variable primaria de eficacia fue la persistencia de la infección por VPH 16, incluidos los relacionados con el VPH 16 displasia cervical. Dado que la vacuna está siendo desarrollado para la profilaxis contra la infección, el análisis primario se llevó a cabo en las mujeres que eran ingenuos al VPH 16 en el ingreso y se mantuvo libre de la infección por VPH 16 a través de la realización de la serie de vacunación. Entre los que recibieron placebo dentro de esta cohorte, 41 casos de infección persistente por VPH 16 se detectaron. Ninguna de las mujeres que recibieron VPH 16 L1 VLP vacuna en esta cohorte desarrolló criterio de valoración de casos [11].

Por ahora, la investigación de una vacuna tetravalente, compuesto por VPH 6, 11, 16, y 18 L1 VLP formulado con MAA. Esta vacuna también ha demostrado ser eficaz en la prevención de la infección persistente y de VPH 6, 11, 16 y 18 relacionados con la displasia cervical [12]. Para entender mejor los efectos cuantitativos y cualitativos de Merck de aluminio como adyuvante en la inmunogenicidad de la VLP se utilizó una novela de tipos específicos de VPH, de anticuerpos isotyping ensayo y un inmunoensayo competitivo Luminex (cLIA) para medir los VPH tipo de respuestas de anticuerpos específicos en macacos rhesus. Los resultados presentados aquí indican que la formulación con adyuvante de aluminio Merck aumentó la VLP sin afectar a la inmunogenicidad del isotipo perfil.

Métodos
Vacunas

Partículas similares al virus fueron preparados como ha sido descrito previamente (con modificaciones) de los distintos tipos de lisados-Saccharomyces cerevisiae genes que expresan la L1 de VPH 6, 11, 16 y 18, respectivamente [13]. Igualdad de las concentraciones de los cuatro VLPs de VPH se combinaron y se utiliza ya sea directamente, o adsorbido a MAA. Una dosis de vacuna estándar se compone de 2 μ g cada uno de los cuatro tipos de VLP, con o sin 225 μ g de MAA. El adyuvante de aluminio Merck es una propiedad de la base de sulfato hidroxifosfato de aluminio como adyuvante utilizado en otras vacunas fabricada por Merck & Co, [14].

Vacunas en estudio Rhesus Macaques

Grupos de hombres y mujeres macacos Rhesus (n = 5) fueron vacunados en las semanas 0, 8 y 24 con las dos vacunas experimentales se ha descrito anteriormente. Suero se recogió en las semanas 0, 2, 4, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 26, 28 y 52. Los animales se mantuvieron en conformidad con las institucionales Cuidado de Animales y el Empleo de Comisiones Laboratorios de Investigación de Merck (West Point, PA).

Anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales utilizados en el VPH cLIA incluido H6.M48 [15] para el VPH 6, K11.B2 para el VPH 11, H16.V5 [16] para el VPH 16 y H18.J4 [16] para el VPH 18. Estos anticuerpos han demostrado ser específicos para el tipo de VPH y que se unen a los epitopos neutralizantes [17]. El mAbs se conjugado con ficoeritrina (Chromaprobe, Aptos, CA) y se usa a una concentración final de 0,1 μ g / ml cada una.

VPH específicos de inmunoglobulina isotyping ensayo

Un anticuerpo multiplexadas isotyping Luminex ensayo se desarrolló para caracterizar los aspectos cualitativos de VPH específicos de la respuesta inmune humoral. El multiplex, isotyping ensayo se utilizan para clasificar los anticuerpos específicos del VPH como IgM, IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG4, total o IgG. IgG3 no se evaluó desde macacos rhesus no hacen la IgG3 subclase de anticuerpos [18, 19]. Un grupo de isotipo de anticuerpos monoclonales específicos para la IgE, IgG1, IgG2, y IgG4 se compraron ya sea de Sigma (St. Louis, MO) o el sur de la Biotecnología (Birmingham, AL) y el isotipo de los anticuerpos policlonales específicos para IgA, IgM, y el total de IgG se compraron de Rockland Inc (Gilbertsville, PA). Estos anticuerpos (Cuadro 1] se evaluaron para la reactividad a los humanos, rhesus mono verde africano y las inmunoglobulinas. La especificidad de los anticuerpos a sus respectivos isotipos de inmunoglobulinas se estableció por un ensayo utilizando Luminex purificada humanos IgM, IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 covalentemente conjugado con Luminex microesferas. Microesferas fueron incubadas con anticuerpos agotamiento de la noche a la mañana Suero Humano (ADHS), lavada y utilizando el isotipo detectado anticuerpos específicos a las concentraciones que se muestra en el Cuadro 1. Óptimo de las concentraciones de anticuerpos, que se muestra en la Tabla 1, se establecieron mediante la comparación de las diferentes concentraciones de Abs en la detección y monitoreo de los sueros antes de la vacunación y los sueros positivos de VPH 6, 11, 16 y 18L1 VLP vacunados monos verdes africanos. Ab concentraciones fueron escogidos que dieron la mayoría de la sensibilidad y la mayor relación señal / ruido entre pre-inmune y sueros de animales vacunados. Reactividad cruzada entre la detección de anticuerpos isotipo fue examinado por conjugar purificada humanos Igs a Luminex y microesferas incubando estas microesferas con cada uno de los isotyping anticuerpos en su ensayo de las concentraciones elegidas. En estos experimentos que hemos detectado cierta reactividad cruzada de la lucha contra IgG1 MAb hacia IgG2 (71%) y el anti IgG2 hacia IgG1 (58%). Esta reactividad cruzada fue la razón de la disminución de la concentración de los anti-IgG1 e IgG2 MAbs a 10 μ g / ml (Tabla 1].

Para el multiplexado, el VPH-isotyping de anticuerpos específicos de ensayo, el VPH 6, 11, 16, y 18 de VLPs se conjuga covalentemente a cuatro Luminex microesferas microesfera identificados como 6, 11, 16 y 18, respectivamente. Prueba de sueros de macacos rhesus fueron vacunados en serie diluida 5 veces a partir de una dilución de 1:10 y con ADHS incubaron durante la noche con la VLP conjugado con microesferas (5000 VLP-microesferas para cada tipo en PBS + 1% Tritón X-100 (PBST ) En un volumen total de 100 μ l en un 1,2 μ m hidrófilo, la baja unión a proteínas, Durapore ® placa de filtro de membrana (Millipore, Bedford, MA). El contenido de la placa se lavó 3 veces con 200 μ l de PBST y resuspendido en PBST. VPH tipo Anticuerpos específicos vinculados a la VLP se incubaron por 2 horas con biotina, isotipo de la detección de anticuerpos específicos de secundaria a las concentraciones que se muestra en el Cuadro 1. Las microesferas se lavaron tres veces, y resuspendido en PBST. Biotina Los anticuerpos fueron detectados por incubación con streptavidina Conjugado con ficoeritrina (Strep-PE) durante 30 minutos a una concentración final de 5 μ g / ml. Las placas se lavaron 3 veces y leer en un Bio-plex analizador comprado de Bio-Rad Laboratories, Inc (Hercules, CA). El Bio-plex analizador, en base a la tecnología de Luminex xMAP, es un flujo cytometer modificado que permite la cuantificación simultánea de hasta 100 analitos en un único bien y los informes Mediana Intensidad de fluorescencia (MFI) señales de la Strep-PE reactivo de detección [20] . Dilución punto final de los títulos se definieron mediante la comparación de las señales a los de ADHS, el control negativo. Por positividad, una IFM hubo que calcular el valor por encima de la media de ADHS + 10 desviaciones estándar y el punto final de dilución tenido que demostrar la positividad en la Anteriores menor dilución.

VPH tipo competitivas específicas de Luminex inmunoenzimáticos (cLIA)

Un optimizado y validado previamente VPH competitiva Luminex inmunoenzimáticos (cLIA) descrita por primera vez por Opalka et al. [21] se utilizó para cuantificar el VPH 6, 11, 16, y 18 de anticuerpos específicos para conocer de los epitopos neutralizantes en la VLP. Utilizando la misma VLP-conjugado microesferas se ha descrito anteriormente, los títulos de anticuerpos se determinaron utilizando un formato competitivo, en donde el VPH de tipos específicos de ficoeritrina (PE) de la etiqueta de anticuerpos monoclonales (MAbs) para conocer los epitopos neutralizantes competir con anticuerpos séricos por la unión a conformationally dependientes, neutralizando Epítopos. Las señales fluorescentes de obligado VPH específicos de MAbs son inversamente proporcional a la del sujeto títulos de anticuerpos neutralizantes. Relativa inhibición de la MAb obligatorio en suero problema se comparó con un estándar de referencia en suero utilizando un parámetro de cuatro curva logística apropiado [22]. Los sueros de referencia para el VPH 6, 11, 16 y 18 utilizados para la curva estándar fueron asignados arbitrariamente valores expresados en mili-Unidades de Merck por mililitro (mMU / mL). Un título de anticuerpos> 200 mMU / mL para el VPH 11 se ha mostrado para neutralizar ~ 10 8 viriones en el athymic mouse xenoinjertos de ensayo [23]. Los títulos de VPH 6 y 11 sueros de referencia anteriormente se determinarán en un pseudoneutralization ensayo [17]. El límite inferior de cuantificación para HPV6, 11 y 18 cLIAs es de 8 mMU / mL y para el VPH 16 es de 12 mMU / mL.

Análisis Estadístico

Los títulos de anticuerpos obtenidos de la cLIA VPH fueron log-transformado y analizados utilizando una cola, no en parejas, de la t de Student Test. P-valores se obtuvieron mediante la comparación de la media de log-transformado títulos de cada uno de los 5 monos de la semana 2 a 52 dentro de los dos grupos. La existencia de una diferencia estadísticamente significativa entre los títulos de anticuerpos de macacos rhesus vacunados con VLP + MAA versus VLP solo fue demostrado por un P-valor inferior a 0,05. Error de las barras representan el error estándar de log-transformado títulos.

Resultados
La vacunación con VLPs de VPH formulada con el adyuvante de aluminio induce significativamente mayor que los títulos de VLPs solos

El propósito de este estudio fue caracterizar los efectos cuantitativos y cualitativos de la inclusión de MAA a los VPH 6, 11, 16 y 18 de VLP vacuna. En primer lugar queríamos medir los títulos de anticuerpos neutralizantes para epítopos del VPH en L1 inducida por una vacuna tetravalente formulado con o sin adyuvante de aluminio utilizando el VPH cLIA. Los títulos de anticuerpos de los cuatro tipos de VPH en los dos grupos de la vacuna desarrollada después de la primera vacunación, disminuyó, y aumentó de nuevo después de cada impulso (Fig. 1]. Los datos son consistentes con un típico primer impulso respuesta. Pico de los títulos de anticuerpos cuatro semanas post dosis 3, en la semana 28, para los cuatro tipos de VPH fueron 12,7 a 41,9 veces más altos que para el grupo vacunado con VLPs + MAA en comparación con el grupo vacunado con VLPs solo, y entre 4,3 y 26,7 veces mayor En la fase de la persistencia en la semana 52 (Cuadro 2A]. De la t de Student Pruebas de log-transformado los títulos de anticuerpos en la semana 52 de la VLP + MAA frente a la VLP por sí solo grupo de VPH 6, 11, 16 y 18 también fue estadísticamente significativa P-valores de 0,045, 0,026, 0,039 y 0,008, respectivamente. De la t de Student Pruebas de log-transformado los títulos de anticuerpos de semana 2-52 de la VLP + MAA frente a la VLP por sí solo grupo de VPH 6, 11, 16 y 18 también fue estadísticamente significativa P-valores de 0,0022, 0,0026, 0,0021 y 0,0026 Respectivamente (Fig. 1].

También queríamos medir el total de VPH-IgG específicos para determinar si los niveles de la formulación con el aumento de la MAA total VPH específicos de los títulos de Ab. El total de VPH específicos de los títulos de IgG pico, y los títulos de siete meses después de dosis tres fueron siempre más elevados en el grupo de VLP + MAA en comparación con el grupo de VLP sola (Fig. 2]. Una respuesta anamnésica se observó después de cada vacuna y de aumentar los niveles de IgG total son detectables a través de un año. El volumen máximo de los títulos de anticuerpos cuatro semanas post dosis 3, en la semana 28, en el grupo de VLP + MAA fueron entre 65,7 a 125,0 veces más altos que los del grupo de VLP por sí sola la vacunación en toda la serie y entre 18,1 a 90,6 veces más altos que en la persistencia Fase, en la semana 52 (Tabla 2B].

VPH específicos de las respuestas de anticuerpos isotipo

Para caracterizar los isotipos de anticuerpos observada con la VLP formulado con MAA o VLPs, que modificó una sola multiplexadas Ab isotyping ensayo desarrollado por primera vez para medir Ab isotipos en los seres humanos [24]. Estos cambios incluyen el uso de detección mAbs que reaccionan con humanos, y rhesus mono verde africano Igs, siempre que sea posible (Tabla 1]. Además hemos utilizado con biotina Abs para que podamos utilizar un común streptavidina-PE reactivo de detección. Esta novela de anticuerpos específicos del VPH-isotyping ensayo resultó ser específico y sensible para la detección de macacos rhesus, IgM, IgA, IgE, IgG4 y el total de IgG. Baja reactividad cruzada fue visto con el anti-IgG1 e IgG2 anticuerpos purificados a IgG2 e IgG1 humana respectivamente. Las respuestas a estos isotipos de anticuerpos se midieron por separado para el VPH 6, 11, 16 y 18 y fueron similares entre sí. Resultados para HPV16 respuestas, que son representativos de los cuatro tipos se muestran en la figura 3.

En primer lugar, hemos examinado el VPH IgM específica porque las respuestas de anticuerpos IgM son los primeros que se producen después de la vacunación y que indican una respuesta inmune primaria a la vacuna. Como era de esperar, una respuesta IgM para los cuatro tipos se midió después de la primera vacunación en la semana 0 y que se muestre el representante del VPH tipo 16 (Fig. 3A]. Curiosamente, otras dos primarias IgM se observaron respuestas después de cada una de las vacunaciones de refuerzo dado a las semanas 8 y 24, en tanto la VLP y VLP + MAA grupos del estudio (Fig. 3A]. IgM respuestas en el grupo de VLP por sí sola regresó a la base de referencia de la semana 52, que era de siete meses después de la dosis 3, mientras que una respuesta de anticuerpos IgM en el grupo de VLP + MAA fue detectable en la semana 52.

Desde VPH son virus de transmisión sexual que cruzar la barrera en la mucosa del tracto anogenital, el próximo examinó si la VLP inducido una respuesta IgA y la formulación con qué efecto tendría la MAA en una respuesta de IgA. En teoría, la inducción de IgA mejoraría en gran medida la eficacia de una vacuna contra el VPH. Ambos grupos de la vacuna demostró tipo IgA específicos de las respuestas a la VLP que se mantiene por medio de un año (Fig. 3B]. Cada vacuna impulso suscitado respuestas de IgA secundaria de vacunación en ambos grupos de estudio (Fig. 3B]. Superior IgA punto final de dilución de los títulos se observaron en los macacos rhesus vacunados con VLP + MAA en comparación con los vacunados con VLP solo.

También examinó si existía una respuesta IgE inducida después de la vacunación. La media geométrica de los títulos (GMTs) de las respuestas de IgE para los dos grupos no se vacuna por encima de antecedentes, sin embargo un animal en el grupo de VLP tenido una respuesta IgE detectables en la semana 4 para el VPH 6 y 16, y en la semana 24 para el VPH 16 (datos No se muestra). Esta respuesta fue apenas por encima del límite de detección y no se detectó después de la dosis de refuerzo dado a las semanas 8 y 24.

Hemos medido el próximo subtipos IgG para determinar si Merck formulación con adyuvante de aluminio afectado a la Ig isotype perfil. Caracterización de isotipo IgG perfil que también se analice si formulación MAA alterado con el TH1 o TH2 perfil de la respuesta inmune. Las principales subclases de IgG observada en ambos grupos de vacunación se IgG1 (Fig. 3C]. Similar a la observada para el total de respuestas de IgG, IgG1 secundaria se observaron respuestas después de cada impulso, y se mantiene por medio de los títulos de un año en el grupo de VLP + MAA (Fig. 3C]. Sin embargo, el grupo vacunado con VLP por sí sola ha títulos detectables sólo después de la segunda inmunización y estos títulos se acercó a los valores de referencia de un año (Figura 3C]. También se observó un alto nivel de IgG4 y Ab títulos en el grupo de VLP + MAA se detecta temprano después de cada vacunación, pero se indetectable en la semana 52 (Fig. 3D]. Los monos vacunados con VLPs sólo demuestra por sí solo IgG4 respuestas después de cada vacunación impulso, pero los títulos cayeron por debajo del límite de detección poco después (Fig. 3D]. No se detecta una fuerte respuesta de IgG2 en el grupo de VLP-solos y los niveles de IgG2 en el grupo de VLP + MAA se observaron sólo inmediatamente después de la vacunación (datos no presentados). Sin embargo, debido a que hemos detectado cierta reactividad cruzada de la lucha contra la IgG2 MAb a IgG1 humana, no podemos descartar la posibilidad de que la IgG2 señales observadas se debe a la reactividad cruzada de la lucha contra la IgG2 MAb a los altos niveles de IgG1 rhesus Ab (Fig. 3A]. IgG3 VPH específicos de las respuestas no se mide porque macacos rhesus no hacen la IgG3 subclase de anticuerpos [18, 19]. En resumen, el aumento total de IgG, IgG1, IgG4 y Ab títulos se observaron en macacos rhesus los vacunados con VLP + MAA en comparación con los vacunados con VLPs solo.

Discusión

Este es el primer estudio para examinar directamente los efectos de la Merck de aluminio como adyuvante en la respuesta inmune a una tetravalente VPH 6, 11, 16 y 18 L1 vacuna. Los resultados aquí fueron generados usando un nuevo tipo de VPH de anticuerpos específicos isotyping ensayo para caracterizar a la inmunoglobulina subclases de VPH 6, 11, 16 y 18 en macacos rhesus, y un inmunoensayo competitivo Luminex (cLIA) que las medidas de tipo de VPH anticuerpos específicos para conocer Epitopos neutralizantes. La tetravalente VPH L1 VLP vacuna formulada con MAA inducida superior para el total de los títulos de IgG (Fig. 2], así como para todos los isotipos Ig medido (Fig. 3], frente a la vacuna sin MAA. También el MAA-formulado vacuna indujo aumento de los niveles de los títulos de anticuerpos a los epitopos neutralizantes frente a uno sin MAA (Fig. 1]. Fuerte respuesta inmune se suscitó frente a los cuatro tipos de VPH de alto y los títulos de anticuerpos persisten a través de un año.

Los resultados de la VPH cLIA mostraron que la vacuna induce anticuerpos que competía con MAbs a conocer los epitopos neutralizantes, y son, por lo tanto, en teoría capaz de neutralizar el VPH. Cabe señalar que anteriormente hemos demostrado que un concurso de radioinmunoensayo (cRIA) [25] y la cLIA correlacionan bien con un ensayo de neutralización de VPH 11. Los títulos de anticuerpos en la cLIA también siguió un "prime-impulsar" la respuesta en que los títulos de anticuerpos fueron mayores después de cada dosis de vacuna. Además, los títulos de cLIA muestran que la formulación de la vacuna con MAA aumentado significativamente pico neutralizar títulos, y, más importante aún, las diferencias en las respuestas fueron duraderas, a través de la persistencia de un año.

Anteriormente, Merck informó de que el VPH 16 L1 VLP vacuna induce una respuesta inmune predominantemente TH2 con IL-4 productores de las células T-helper, los altos niveles de neutralizar Abs y los bajos niveles de IFN-γ de secretar CD8 + o células T CD4 + [26 ]. Dado que la vacuna tetravalente VPH también contiene proteínas de la cápside L1, la respuesta fue también espera que se TH2-como [27]. Usando el VPH isotyping ensayo, que es un vinculante directa de ensayo para la detección de anticuerpos contra epítopos conservados compartida a través de múltiples tipos de VPH, que mostró que el isotipo perfil de los vacunados macacos rhesus era compatible con una TH2 como de la respuesta inmune. Curiosamente, la formulación de MAA no afectó el perfil general de isotipo de los monos vacunados.

Como era de prever, abundantes cantidades de anticuerpos isotipo IgG se encontraron, y de todas las subclases de IgG, IgG1 se detectan más fácilmente. La abundante presencia de IgG1 suscitó en ambos grupos de vacunación, afirma que las vacunas no inducir la respuesta inmune a través de una vía de TH2. También es interesante observar que en el próximo abundante subclase IgG detectados, detectado principalmente en el grupo de VLP + MAA, se IgG4 (Fig. 3D]. IgG4 es más característico de una respuesta TH1 y, por inducir esta subclase IgG, la vacuna se muestra eficaz también en la obtención de un teléfono celular (TH1), la respuesta inmunitaria, aunque, previsiblemente, no de larga duración. Cabe señalar que anteriormente hemos observado bajos niveles de IFN-γ secretora de las células CD4 + y CD8 + T-células [26], lo que sugiere que la vacuna induce un bajo nivel de respuesta inmune celular. Similar a lo que hemos observado en macacos rhesus, isotipo análisis de los sueros de las mujeres vacunadas con la vacuna contra el VPH 11 VLP formulado con MAA también detectó poco a los niveles de IgG2 no [24]. Isotipo análisis realizado en un estudio epidemiológico por Wang et al. Además, no se encontraron anticuerpos IgG2, que se atribuye a las desfavorables perfil de citoquinas de la infección por el VPH para la inducción de IgG2 [28]. Detección de la subclase IgG3 no se realizó, porque macacos rhesus no hacen IgG3 [18, 19].

También midieron altos niveles de IgA sérica observados en los animales vacunados. IgA, la inmunoglobulina secretora, se piensa que es muy importante en el bloqueo de la entrada viral en tejidos de la mucosa [29]. Estos resultados son consistentes con lo que hemos observar en el suero de las mujeres vacunadas con la vacuna contra el VPH 11 VLP [24]. La estimulación de IgA debe ser ventajosa para una vacuna que previene la infección por VPH en la defensa contra la entrada de VPH, que comúnmente entra por las del tracto urogenital. Los altos niveles de IgA suscitado por la vacuna también puede ser una de las razones por la vacuna ha sido eficaz en los ensayos clínicos humanos [11]. IgE respuestas se midieron los anticuerpos IgE, porque están implicados en los síntomas de alergia. De conformidad respuestas de anticuerpos IgE no se observó en ninguno de los dos grupos. Sólo un animal en el grupo de VLP sola vacuna había IgE detectables, pero la respuesta fue apenas por encima del límite de detección y transitorios, ya que no se detectó después de la vacunación de refuerzo. Esto es coherente con la observación de que no reacciones alérgicas o efectos adversos graves en los monos después de la vacunación. Estas observaciones son consistentes con nuestros hallazgos clínicos que una vacuna VLP + MAA fue seguro y bien tolerado [30]. En resumen, el isotipo análisis de los datos son consistentes con la vacuna VLP + MAA inducir principalmente una TH2 como de la respuesta inmune con altos títulos de anticuerpos IgA e IgG1.

Isotyping En estos estudios, se utilizó cabra policlonal anti-mono IgM, IgA, y el total de IgG; mono-específicas, porque no se dispone de reactivos para los subtipos de IgG y IgE, hemos utilizado anti-humano MAbs ratón para medir IgG1, IgG2, IgG4, IgE y respuestas. El policlonal anti-IgA, IgM e IgG total de los reactivos fueron seleccionados por su especificidad y en su capacidad para detectar ampliamente mono verde africano, macacos rhesus y humanos isotipos de anticuerpos. Las diversas diferencias entre humanos, macacos rhesus mono verde africano y sueros podría ser responsable de los cambios en la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos reactivos y isotyping por lo que la concentración adecuada de anticuerpos reactivos utilizados en el tipo de VPH de anticuerpos específicos isotyping ensayo fueron optimizadas para su uso con Macacos rhesus suero.

Debido a la falta de disponibilidad de Igs purificadas rhesus, hemos utilizado purificada humanos Igs para determinar las especificidades de los anticuerpos específicos de tipo isotyping reactivos. Hubo algunos observó reactividad de los anti-IgG2 anticuerpo humano purificado para IgG1 humana, y viceversa, pero estos datos fueron obtenidos en humanos Igs purificadas y las diferencias entre humanos y rhesus anticuerpos puede dar cuenta de la razón por la que se produjo un fuerte respuesta IgG1 con baja IgG2 títulos (Fig. 3]. Sin embargo, dado que no podemos descartar que la IgG2 títulos no son más que un reflejo de la reactividad cruzada a los altos títulos de IgG1, definitivamente no podemos decir que hay algún IgG2 las respuestas observadas.

En algunos casos, los animales habían Ab baja a los títulos de la VLP antes de la vacunación. Esto no fue inesperado ya que más de 100 se han identificado virus del papiloma [31] y muchos de ellos comparten epítopes conservados estructurales que se cruzan en una reacción directa vinculante ensayo. Por esta razón, hemos utilizado Antibody agotamiento de Suero Humano (ADHS) como un control negativo en lugar de sueros de macacos rhesus antes de la vacunación.

Actualmente, la única aceptada por la FDA para el uso de adyuvantes con vacunas profilácticas son la base de aluminio [32]. El propósito de este estudio fue evaluar el efecto de la Merck adyuvante de aluminio sobre la inmunogenicidad de la L1 VLP de VPH 6, 11, 16 y 18 de la vacuna y los resultados muestran que la adición de la MAA aumenta significativamente la inmunogenicidad de la vacuna. En marcado contraste con nuestros resultados, Harro et al. Han informado de que la formulación con adyuvante no mejorar la inmunogenicidad de una vacuna contra el HPV VLP [33]. En este estudio, 72 voluntarios fueron asignados aleatoriamente a recibir placebo o una VPH 16 L1 VLP vacuna producida en células de insectos. Los receptores de la vacuna se les dio una dosis de 10 μ g o 50 μ g de VLPs formulado sin adyuvante, con un adyuvante de aluminio, o con adyuvante MF59. Dado que no existen diferencias significativas en los títulos de anticuerpos neutralizantes y de los títulos de ELISA se encontraron en sujetos en los tres grupos, los autores concluyeron adyuvante no era necesario. Nuestros resultados fueron obtenidos en la tetravalente VPH de Merck-L1 VLP vacuna, que se formula con Merck de aluminio como adyuvante. Aunque los mecanismos por los que los adyuvantes de aluminio mejorar la inmunogenicidad, son poco conocidos, pueden actuar para formar un antígeno de depósito, lo que permite la vacuna de lado, en el sitio de administración y tal vez, aún más importante, estimular el sistema inmunitario induciendo mayor neutralizar Ab títulos [34 ]. La inclusión de MAA a la vacuna no indujo cualitativamente diferente respuesta inmune humoral en el que el perfil de isotipo fue similar entre los animales vacunados con las dos vacunas tetravalente (Fig. 3]. Sin embargo, los datos de los ensayos de anticuerpos isotyping y la cLIA mostró que la inclusión de MAA a la inducida por la vacuna VLP Ab títulos significativamente más altos (Fig. 1, 2, 3]. Estos datos muestran claramente un beneficio para la formulación de la tetravalente VPH-L1 VLPs con MAA.

Las diferencias observadas en la respuesta inmune observada con la vacuna contra el denunciados por Harro et al. Merck y la vacuna tetravalente VPH puede atribuirse a varios factores. En primer lugar, serían las diferencias en la formulación y los procesos de depuración de las vacunas. La vacuna informó por Harro et al. Fue producida en células de insectos en lugar de la levadura de la vacuna de Merck. En segundo lugar, las diferencias en los vacunados, los seres humanos y los macacos rhesus puede responder adyuvante diferente a las vacunas HPV VLP. Por último, las diferencias en la formulación y la composición de los dos adyuvantes de aluminio utilizado podría tener profundos impactos en la inmunogenicidad. Diferentes adyuvantes de la sal de aluminio se utilizan en estos dos estudios; nuestro estudio adsorbido VLPs a un propietario formulación de sulfato hidroxifosfato de aluminio (MAA), mientras que el Harro et al. Estudio utilizó sulfato potásico de aluminio. Sin un jefe a la cabeza la comparación de las dos vacunas, es difícil establecer por qué los resultados son diferentes. Sin embargo, la magnitud y la durabilidad de respuestas de anticuerpos encontrados en la tetravalente VLP + MAA rhesus macacos vacunados en este estudio son consistentes con los de ensayos clínicos en humanos de los VPH 11 o VPH 16 vacunas monovalentes [30].

El isotyping y cLIA ensayos descritos en este estudio son útiles en la caracterización de la respuesta inmune al VPH viriones naturales después de la infección o después de la vacunación. La novela cLIA utilizado en este estudio es un método robusto y sensible para la detección de anticuerpos específicos del VPH en el suero a conocer los epitopos neutralizantes sobre VPH viriones y ha demostrado ser una valiosa herramienta para la vigilancia de la respuesta inmune del VPH en los ensayos clínicos humanos de VPH 6, 11, 16 y 18L1-VLP vacuna. Estos ensayos tienen uso potencial en el futuro otros estudios epidemiológicos y ensayos clínicos de vacunas.

Conclusión

Los resultados presentados aquí, muestran que una de VPH 6, 11, 16 y 18-L1 VLP vacuna formulada con el adyuvante de aluminio Merck ha aumentado sin afectar a la inmunogenicidad isotipo perfil. La VLP formulada con el adyuvante de aluminio Merck obtuvo un sólido y duradero que la respuesta inmune duración de 52 semanas. Esta vacuna tiene como promesa de una vacuna para prevenir el cáncer cervical.

Lista de abreviaturas

MAb, anticuerpo monoclonal; PBS, de búfer fosfato salino; cLIA, Luminex inmunoensayo competitivo; ADHS, agotado de anticuerpos humanos en suero; VLP, partículas similares al virus, el VPH, el virus del papiloma humano; GMT, la media geométrica de los títulos; Ig, inmunoglobulina; Ab, de anticuerpos .

Conflicto de intereses

W. Ruiz, W. McClements, K. Jansen y M. Esser fueron todos los empleados de Merck Research Laboratories, una división de Merck & Co, Inc cuando se realizó este estudio y potencialmente propias existencias y / o mantener las opciones sobre acciones en el Compañía. Merck está desarrollando una vacuna contra el VPH tetravalente. Merck también financió este estudio en su totalidad.

Contribuciones de los autores

W. McClements y K. Jansen diseñó el estudio de la inmunización. M. Ruiz W. Esser y desarrolló el Luminex inmunoensayo competitivo y el nuevo isotyping ensayos. W. Ruiz realiza todos los ensayos de laboratorio. W. y M. Ruiz Esser escribió el manuscrito y todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer Skibbens R. y M. Kuchka (Lehigh University, Bethlehem, PA); Kierstead L., A. Finnefrock, J. Drummond, N. Chirmule, E. Shaw, S. Schlottman, G. Wang, JF Smith, G. Page, el VPH y el VIH grupos (Merck, MRL), por su asistencia y apoyo; R. Charbonneau y S. Macmullen anterior isotyping para el desarrollo, p. Boerckel por su asistencia de expertos de laboratorio, T. Green, de expertos Estadística asesoramiento y asistencia, R. Marchese (Merck LMR Wayne), por su lectura crítica del manuscrito y la orientación de expertos, y T. Fujiwara por su motivación y aliento.