Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 11-11 (más artículos en esta revista)

- Factor activador de plaquetas aumento de la afluencia de calcio y la interleucina-6 expresión, pero no la producción, en humanos microglia

BioMed Central
Prasongchai Sattayaprasert (mannkung@hotmail.com) [1], Choi Hyun B (chb1202@hanmail.net) [1], Sukumal Chongthammakun (scsct@mahidol.ac.th) [3], James G McLarnon (mclarnon @ intercambio. Ubc.ca) [1]
[1] Departamento de Farmacología y Terapéutica de la Facultad de Medicina de la Universidad de British Columbia, Vancouver, BC, Canadá
[2] División de Neurología, Departamento de Medicina de la Universidad de British Columbia, Canadá
[3] Departamento de Anatomía, Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia

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Resumen

De calcio sensibles a la microscopía de fluorescencia y el análisis de biología molecular se han utilizado para estudiar los efectos del factor activador de plaquetas (PAF) en el calcio intracelular [Ca 2 +] i y la IL-6 en la expresión humana microglia. FAP (muy aplicado a 100 nM) provocó una respuesta bifásica en el [Ca 2 +] i que consta de un primer rápido aumento de [Ca 2 +] i debido a la liberación interior de las tiendas, seguida por una afluencia sostenida. Esta última fase de la [Ca 2 +] i aumento fue bloqueado por SKF96365, una tienda no selectiva que funciona con canal (SOC) inhibidor. RT-PCR análisis mostró FAP tratamiento de la microglia inducida por la expresión de citoquinas pro-inflamatorias IL-6 en un tiempo que dependen de manera que fue bloqueada en presencia de SKF96365. Sin embargo, no mostró ningún ensayo ELISA la producción de IL-6 se suscitó en cualquier punto del tiempo (1-24 h) para exposiciones a microglial FAP. Estos hallazgos sugieren que la estimulación de la FAP microglia induce la expresión humana, pero no la producción, de IL-6 y que el SOC mediada [Ca 2 +] i afluencia contribuye a la mejora de la expresión de citoquinas.

Antecedentes

Microglia son residentes, las células inmunocompetentes en el cerebro. Ellos muestran la plasticidad funcional y puede ser activada por una diversidad de estímulos inflamatorios incluyendo los relacionados con las enfermedades neurodegenerativas [9, 18]. Las respuestas funcionales de la activación de microglia siguientes incluyen la proliferación, y la secreción de la fagocitosis. En este último caso microglia pueden secretar pro-y anti-inflamatorios citocinas, quimiocinas, factores neurotróficos y excitotoxins como el glutamato [20].

Un importante agente inflamatorio es factor activador de plaquetas (PAF), un compuesto alquil éter fosfolípido, que tanto estimula y es producido por microglia [13]. FAP contribuye a respuestas inflamatorias en el cerebro y se informó de que se upregulated en fisiopatología CNS [2, 17]. Agudo aplicación de la FAP a la microglia humana bifásica induce un cambio en los niveles intracelulares de Ca 2 + ([Ca 2 +] i), con una primera fase debido a la rápida liberación intracelular de retículo endoplasmático (ER), tiendas y una fase secundaria debido a la afluencia a través de Almacenar canales operados (SOC) [15, 31]. Es importante destacar que el SOC se ha demostrado que la exposición después de la activación sostenida de la estimulación humanos [31] y [29] de roedores microglia. Prolongada entrada de Ca 2 + a través del SOC en estimulado microglia puede constituir una señal de acoplamiento entre un estímulo y la activación de la respuesta celular funcional. De hecho, la participación sostenida de Ca 2 + respuestas ha sido señalada como un factor en la producción de ácido araquidónico por microglia rata [23].

Las citoquinas proinflamatorias IL-6 se libera de microglia activada y media respuestas inflamatorias en el cerebro. Los niveles de IL-6 en suero y líquido cefalorraquídeo se han encontrado para ser elevados en pacientes con accidente cerebrovascular [8, 28] y de la citoquina también ha sido implicado en la etiopatogenia de los trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (PD) Y la encefalopatía del VIH [3, 14, 25]. Curiosamente, algunas pruebas también está disponible sugiere que, en virtud de algunas condiciones de niveles elevados de IL-6 en el cerebro puede ser beneficioso [27].

En este estudio, hemos examinado el papel de la mediación SOC [Ca 2 +] i afluencia en la mediación acciones de la FAP inflamatoria estímulo para inducir a la IL-6 en humanos microglia.

Materiales y métodos
Preparación de las células

Los procedimientos para el aislamiento de microglia humanos han sido señalados [24]. En resumen, los tejidos del cerebro de embriones humanos fueron disecados en pequeños bloques, incubadas en buffer fosfato-salina (PBS) que contenga 0,25% de tripsina y 40 μ g / ml DNasa y luego disociarse en células individuales por repetido pipeteo. Las células se chapada en frascos T75 en un medio que consta de Dulbecco modificado a medio Eagle (MEDM), que contiene un 5% de suero de caballo, 5 mg / ml de glucosa, 25 μ g / ml de gentamicina, y el 2,5 μ g / ml de anfotericina B. libremente flotante fueron cosechadas de microglia Un medio de cultivos de células mixtas después de 7-10 días de crecimiento en la cultura y frascos de plata de aclar en coverslips para la identificación, en poli-L-lisina-recubiertos de vidrio coverslips de calcio espectrofluorometría y chapada en seis-así multiplates de RT-PCR o ELISA . CD11b y ricinus communis crioaglutininas (RCA), marcadores específicos de microglia, fueron utilizados para confirmar la pureza de la cultura que fue en exceso de 98% [24, 30].

Calcio espectrofluorometría

Los procedimientos utilizados para la medición de Ca 2 + intracelular se han reportado [6, 31]. Microglia se incubaron con 1 μ M fura-2/AM (acetoxymethyl ester, Molecular Probes, Eugene, OR) más 1 μ M pluronic ácido normal en suero fisiológico (PSS) durante 30 min. PSS solución contenida (en mM): (126) NaCl, KCl (5), MgCl 2 (1,2), HEPES (10), D-glucosa (10) y CaCl 2 (1); pH de 7,4. Todos los reactivos se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO).

Después de un lavado en 20 min tinte sin solución, coverslips se colocaron en el escenario de un microscopio Zeiss invertido Axiovert × 40, utilizando un lente objetivo de cuarzo. Las células fueron expuestas a la alternancia de longitudes de onda de 340/380 nm s en intervalos de 6 y de emisión de luz pasa por un filtro de 510 nm. Un sistema de procesamiento de imágenes (Empix Imaging, Mississauga, ON) se utilizó para registrar tasas de fluorescencia utilizando una cámara CCD (Retiga 1300i, Burnaby, BC). Se determinaron los coeficientes de fluorescencia y convertido a los valores de [Ca 2 +] i utilizando procedimientos publicado [11]. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (20-22 ° C).

Transcripción reversa-PCR y ELISA ensayo

IL-6 expresión se detectó con la transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR). Aislamiento de ARN se realizó con TRIzol (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) y se eliminó la contaminación de ADN utilizando DNasa. La síntesis de ADNc se realizó utilizando M-MLV transcriptasa reversa (Gibco-BRL). Las secuencias de los humanos primers específicos para la IL-6 de la siguiente manera: primer sentido: 5'-GTGTGAAAGCAGCAAAGAGGC-3 '; primer antisentido: 5'-CTGGAGGTACTCTAGGTATAC-3'. Humanos específicos de la IL-6, las señales se han generado con el termociclador GeneAmp y Amplitaq Gold ADN polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 6 min seguido de 28 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 45 seg, recocido a 56 ° C durante 1 min y extensión a 72 ° C durante 1 min. Un paso de extensión final a 72 ° C durante 10 minutos se llevó a cabo. Productos PCR (159 pb) se identificaron utilizando geles de agarosa al 1,5% que contiene bromuro de etidio y visualizados a la luz ultravioleta. GAPDH fue utilizado como una reacción humana normal y específica primer secuencias son las siguientes: en primer sentido: 5'-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3 '; primer antisentido: 5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'. Las intensidades de cada banda se mide a través de la imagen NIH J 1,24 software (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Relativa de los niveles de mRNA para cada tratamiento se normalizaron a GAPDH.

De inmunoadsorción enzimática (ELISA) ensayos se realizaron de acuerdo a instrucciones del fabricante (sistemas de I + D, Minneapolis, MN). Las células se chapada en múltiples y placas (≈ 10 5 células / así) y tratados con FAP (100 nM) en la ausencia o presencia de SKF96365 (20 μ M en 8 h). La celda libre de sobrenadantes se utilizaron para el análisis de la producción de IL-6 (kit detecta IL-6, precios tan bajos como 0,7 pg / ml). Los valores se expresaron en los medios ± SEM y la significación estadística (p <0,05) se determinó a través de una vía ANOVA y Newman-Keuls comparación múltiple después de la prueba.

Resultados
Efectos de SKF96365 sobre SOC-mediada [Ca 2 +] i afluencia de FAP

FAP inducida por cambios en la [Ca 2 +] i de microglia humanos han sido reportados previamente [15, 21, 31]. Estudio inicial mostró un aumento transitorio en el SOC [31], pero más reciente trabajo ha demostrado FAP aplicación a evocar una etapa de sostenido SOC tras un primer componente debido al agotamiento de Ca 2 + intracelular de las tiendas [15, 21]. Las diferencias en las respuestas FAP se considera en la discusión.

Un representante aguda respuesta a la aplicación de los FAP (aplicado a 100 nM) se presenta en la Fig 1A (n = 18 células). A nivel de la meseta [Ca 2 +] i que se mantuvo por un período de más de 2 minutos después de la eliminación de los FAP. Tras la determinación tanto de la fase meseta, el baño de solución se ha sustituido por Ca 2 + libre de PSS. Este procedimiento causó una inmediata disminución de la [Ca 2 +] i a los niveles basales (fig. 1A]. Larga duración de SOC mediada por flujo de Ca 2 + también se han documentado en microglial células de ratón [29].

Los resultados de la aplicación de la SOC inhibidor SKF96365 (a 20 μ M) a la fase de meseta de una respuesta FAP se muestra en la Fig representante de la grabación 1B (n = 21 células). SOC mediada por la entrada de Ca 2 + se redujo a los valores basales de SKF96365. Amplitud de Ca 2 + a través de afluencia SOC se mide como la diferencia entre la base de referencia y la meseta niveles y en cinco experimentos independientes (n = 107 células) antes de la amplitud SKF96365 fue de 140 ± 21 nM y después de SKF96365 fue a los niveles básicos. Trabajos anteriores ha demostrado SKF96365 pretratamiento de la microglia (50 μ M en 5 min) abolió un transitorio SOC en las células [31].

Efectos de SKF96365 en microglial expresión de la IL-6

Seguidamente, examinó los efectos de la FAP sobre la expresión de las citoquinas proinflamatorias IL-6 en la ausencia y presencia de la inhibición SOC. El tiempo de la dependencia de la estimulación FAP (100 nM) de la microglia de IL-6 se presentan en la Figura 2A. El representante RT-PCR no mostró expresión constitutiva de la IL-6, no microglia (carril 1 de la figura 2A]. IL-6 se expresó al máximo en 1 h de la exposición a la FAP luego bajó a niveles inferiores en el tratamiento ya veces (más largo de la exposición, de 6 h). Un tiempo similar de la dependencia para la expresión de IL-6 se expuso en un total de cuatro experimentos.

A una hora de la exposición humana a la microglia FAP se eligió para su posterior análisis RT-PCR. Como se muestra en la Figura 2B, constitutiva expresión de la IL-6 se ausente (carril 1). FAP tratamiento fue eficaz en la estimulación de la expresión de citoquinas (Figura 2B, carril 2). La expresión de la IL-6 se suprimió cuando SKF96365 se incluye con la aplicación FAP (Fig 2B, carril 3). N evidente expresión de IL-6 se observó para la FAP en aplicación de Ca 2 + libre de PSS (Figura 2B, carril 4). SKF96365, que se aplica solo en PSS solución, no causó ningún aumento de la IL-6 (Figura 2B, carril 5).

Es de interés para comparar FAP como un inductor del microglial IL-6 a la de LPS (lipopolisacárido) un potente estímulo de las células inflamatorias. Los resultados de la exposición de los humanos a microglia LPS (100 ng / ml durante 6 h) se presenta en la figura 2B (carril 6) mostrando LPS estimulación causado una intensa banda de la IL-6. Alterar el número de ciclos de PCR no tuvo efecto aparente en la intensidad (datos no presentados), sugiriendo la IL-6 de saturación de la banda con LPS (Fig 2B, carril 6). Comparación de la intensidad de la banda indicó LPS es un más eficaz inductor de IL-6 en relación con FAP. Curiosamente, una parte de la inhibición de la LPS inducido por IL-6 mRNA SKF96365 se observó cuando se aplicó con LPS (Fig 2B, carril 7).

Semi-cuantitativos de análisis RT-PCR se presenta en la figura 2C y FAP muestra como un eficaz estimulador de la expresión de IL-6 (n = 3). Sin embargo, la expresión de la IL-6 es considerablemente menor con FAP como un estímulo en comparación con LPS (Fig 2 B, C]. Inclusión de SKF96365 con FAP o la aplicación de la FAP en Ca 2 +-PSS eliminado libre expresión de la IL-6 (n = 3). LPS Aunque no fue objeto de este estudio, la disminución de la LPS inducción de IL-6 con SKF96365 es de interés y se discute a continuación.

Ensayo ELISA para efectos de la FAP microglial en la producción de IL-6

Hemos investigado próxima producción de IL-6 de la FAP tratados microglia humanos utilizando un tiempo de exposición de 8 h. N la producción de IL-6 fue evidente en cuatro experimentos (datos no presentados), los niveles de IL-6 estaban por debajo del nivel de detección del ensayo ELISA (≤ 1 pg / ml). Con el fin de determinar si el tiempo de tratamiento es un factor limitante en la producción de IL-6, una serie de experimentos utilizando diferentes microglial veces de la exposición a la FAP se llevaron a cabo (de 1-24 h). Los resultados se presentan en la figura 3; no significativo de la producción de IL-6 (n = 4) se encontró para cualquier tiempo de tratamiento (FAP solicitada 1,2,8 ó 24 h).

También examinó si un aumento de diez veces en la concentración de FAP (a 1 μ M) sería eficaz en la producción de IL-6. Como se muestra en la figura 3, esta mayor concentración de la FAP también no tuvo efecto para inducir la producción de IL-6 veces para el tratamiento de 8 o 24 h (n = 3 experimentos independientes). Los efectos de la estimulación LPS fueron determinadas en estos experimentos (con 100 ng / ml durante 8 h). Microglia, tratados con LPS, producido altas concentraciones de IL-6 a niveles superiores a 400 pg / ml (n = 4 experimentos independientes).

Discusión

Los resultados de este trabajo indican que la FAP mediada por cambios en la [Ca 2 +] i participan en la expresión celular de los agentes pro-inflamatorias, IL-6 en humanos microglia. En esencia, la activación del SOC actúa como un control transcripcional de expresión de la IL-6. Nuestros resultados muestran que la inhibición de la SOC con SKF96365 bloqueado la entrada de Ca 2 + y microglial expresión de la IL-6. Sin embargo, FAP inducida por la expresión de la IL-6 (Fig 2] no se tradujeron en la producción de citoquinas (Fig 3]. Este resultado podría sugerir que un factor adicional de la señal o puedan ser necesarios para microglial la secreción de IL-6.

Como encontrados para otros tipos de células unexcitable, microglia no suelen expresar voltaje dependientes de los canales de Ca 2 + [7]. La constante entrada de Ca 2 + a través de SOC es probable una importante vía para la microglial respuestas a los estímulos inflamatorios específicos [15, 22, 26]. Aunque la apertura del SOC se necesita para volver a ocupar ER tiendas, otras funciones para esta afluencia vía no han sido bien establecidos. Activación del SOC es necesario para la expresión de la IL-6, sino una señal adicional se requiere para producir la citoquina pro-inflamatoria en humanos microglia. El estado de activación de la microglia pueden influir en la medida de la afluencia de Ca 2 + a través del SOC. Microglia mostrando una morfología ameboides se considera representante de un estado activado mientras que las células con morfología ramificadas se consideran quiescente. Hemos encontrado sostenido SOC respuestas de los FAP estimulada en células de microglia demostrando ameboides morfología [15, 21] y también en el presente trabajo. Sin embargo, un estudio inicial usando una mezcla de ameboides y ramificado en forma de las células, mostró una respuesta transitoria SOC con la estimulación por FAP [31]. Posteriormente se trabajará útil para correlacionar SOC con expresión de la activación de células.

Un reciente estudio ha proporcionado una visión detallada de la ATP como un inductor de IL-6 en la expresión y producción de MG-5 microglial línea celular [12]. ATP y la purinergic agonista BzATP son a la vez eficaces en el aumento de expresión de la IL-6, con efectos de la activación de la ruta de p38 MAPK. Sin embargo, la ATP (activador de ambos P2YR y metabotrópicos ionotropic P2XR), pero no BzATP (activador de la ionotropic subtipo P2X 7 R), se encontró para inducir la producción de citoquinas. El papel del SOC en MG-5 respuestas de las células es poco clara desde monofásicos ATP evoca un cambio en el [Ca 2 +] i debido a la liberación de P2YR intracelulares dependientes de las tiendas. En humanos microglia hemos atribuido la falta de una fase del SOC [Ca 2 +] i debido a la concomitante ATP vinculante a algunos P2XR (no P2X 7 R) causando despolarización celular y el bloque de Ca 2 + afluencia [6].

FAP inducción de IL-6 se encontró que era en función del tiempo (Figura 2A], además de la dependencia de la presencia de Ca 2 + extracelular y SOC (Figura 2B]. Se observó que no existen IL-6 en la expresión de media hora y un máximo nivel en una hora de exposición a microglial FAP. Poco o nada de IL-6, ya se expresó con FAP tratamientos de microglia. La inhibición de retículo endoplasmático Ca 2 + ATPasa (SERCA) ha informado al aumento de IL-6 mRNA expresión de roedores en los macrófagos dentro de los 15 minutos [4, 19]. Bloqueo de la SERCA, por compuestos como el thapsigargin, y el posterior agotamiento de los depósitos intracelulares es un estímulo para la activación del protocolo SOC. Sin embargo, SOC mediada por la entrada de Ca 2 + no se determinó en los estudios de roedores.

Aunque FAP es un eficaz estimulador de IL-6 en la expresión humana microglia, LPS suscitado una mayor expresión de las citoquinas. De hecho, las bandas de IL-6 parece saturada (Fig. 2B] y no mostró ningún cambio en la intensidad con mayor número de ciclos de PCR (datos no presentados). Saturación con LPS evitaría una comparación cuantitativa entre la FAP y la LPS como estímulos para la activación microglial expresión de la IL-6 (Figura 2C]. Una interesante observación fue que SKF96365 inhibe parcialmente la LPS inducido por la expresión de la IL-6 (Figura 2C]. Aunque LPS ha informado de que en un acto de Ca 2 +-de manera independiente en los macrófagos [19], varios estudios han encontrado la bacteria compuesto evoca cambios en la [Ca 2 +] i en microglia / macrófagos [1, 5, 16, 32] Que sugiere la posible participación del SOC LPS en la inducción de citocinas.

Los resultados pueden tener importancia para las funciones de la IL-6 en el envejecimiento. Varios estudios han proporcionado pruebas de edad que dependen de los aumentos en los niveles de IL-6 en el cerebro de roedores [revisado en [10]]. Por ejemplo, una conclusión es que los cerebros de los ratones mostraron mayores elevaciones considerables en la expresión y producción de IL-6 en comparación con los cerebros de los animales jóvenes [33]. Este resultado se correlaciona con microglial producción de la citocina [33]. Y será de interés para determinar si FAP estimulada microglia humanos adultos son más potentes productores de IL-6 en comparación con las células fetales.

Lista de abreviaturas

FAP: factor activador de plaquetas; SOC: tienda que funciona con canales; IL-6, interleucina-6; PSS: suero fisiológico; PBS: buffer fosfato salino-; [Ca2 +] i: calcio intracelular; MEDM: Dulbecco modificada de Eagle mediano

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

PS y HBC contribuido igualmente a la imagen de calcio, RT-PCR y ELISA experimentos. HBC también llevó a cabo el aislamiento de microglia. SC participó en el diseño de experimentos y revisado y editado el manuscrito. JGM diseñado y supervisado todos los experimentos, interpreta los datos y finalizó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación del Corazón y de Accidentes Cerebrovasculares de Columbia Británica y Yukon y la enfermedad de Alzheimer Society of Canada (a JGM) y un doctorado de investigación premio de la Fundación del Corazón y los trazos de Canadá (a HBC).