Kinetoplastid Biology and Disease, 2005; 4: 3-3 (más artículos en esta revista)

Etapa específica de la expresión mitocondrial co-chaperonin de Leishmania donovani, CPN10

BioMed Central
Fanny Beatriz Zamora-Veyl (fannyzamora@web.de) [1], Manfred Kroemer (kroemer@bni-hamburg.de) [1], Dorothea Zander (zander@bni-hamburg.de) [1], Joachim Clos (clos @ Bni-hamburg.de) [1]
[1] Instituto Bernhard Nocht de Medicina Tropical Bernhard Nocht St 74, D-20359 Hamburgo, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Leishmania spp., En el curso de su ciclo de vida parasitaria, encuentro dos ambientes muy diferentes: el intestino de sandflies y la phagosomes de mamíferos macrófagos. Durante la transmisión en un mamífero, los parásitos se ven expuestos a un aumento de la temperatura ambiente, así como a las diferentes fuentes de carbono. Molecular chaperones o proteínas de choque térmico están implicados en las necesarias adaptaciones que impliquen ordenó la diferenciación de la flagelado, extracelular promastigote a la fase amastigote intracelular.

Resultados

En este sentido, muestran que la Leishmania donovani co-chaperonin, CPN10, es sintetizado a un significativo aumento de la concentración durante la diferenciación in vitro a la fase amastigote. Mostramos por microscopía de fluorescencia y por inmunoelectrónica microscopía electrónica que, al igual que su socio CPN60.2 putativo complejo, CPN10 se localiza a la única, tubular mitocondria de los parásitos y, además, que co-precipitados con CPN60.2, los principales mitocondrial Chaperonin de Leishmania spp ..

Conclusión

Nuestros datos indican un aumento de las necesidades de CPN10 en el contexto de la proteína mitocondrial durante plegables o temprano en la etapa de mamífero de este agente patógeno. Además, estos datos confirman la buena fe como CPN60.2 mitocondrial GroEL homólogo en L. donovani y postula la interacción de los eucariotas chaperonins, CPN60 y CPN10.

Antecedentes

El euglenozoa que, junto a la euglenophyta, también incluyen los protozoos patógenos de la Orden Kinetoplastida, han ramificado anticipadamente en eucariotas evolución. El kinetoplastida han desarrollado, o mantenerse, mecanismos moleculares no compartida por la mayoría de la Corona Grupo Eukaryota, como transeuropeas de empalme de ARN mensajero, ARN de edición, transcripción y polycistronic. La información genética de su única mitocondria, la llamada kDNA, se localiza a la kinetoplast, un orgánulo exclusivo para este fin. El kinetoplast es parte de un tubular, de un solo mitocondria que muestra poca semejanza morfológica a la mitocondria de la Corona Grupo Eukaryota. El kinetoplastida abarcar dos géneros de parásitos patógenos, Trypanosoma y Leishmania, que responsables de una considerable morbilidad y la mortalidad humanas.

Los parásitos del género Leishmania existir en dos morfológicamente distintas etapas del ciclo de vida. La esbelta, flagelado, promastigote prolifera en el tracto alimentario de las mujeres sandflies a temperatura ambiente. El amastigote, redondeado, forma intracelular, sin flagelo protuberantes, persiste en la phagosomes de mamíferos y macrófagos a temperaturas de hasta 39 ° C. La diferencia de temperaturas en los dos entornos, no sólo provoca la respectiva etapa de desarrollo [1], pero también plantea un desafío para el sistema de proteínas chaperones. Por lo menos dos proteínas de choque térmico, Hsp100 y CPN60.2, muestran significativamente inducida abundancia durante la fase amastigote [2 - 4].

Aparte de la diferencia de temperatura, los dos entornos, los insectos y los macrófagos phagosome gut, ofrecen también diferentes cualitativa y cuantitativa de las fuentes de carbono. La etapa del ciclo de vida de diferenciación, por lo tanto, debe incluir una adaptación de los parásitos de las vías metabólicas. Compartimentos subcelulares, por ejemplo, la única tubular mitocondria, asimismo, someterse a la adaptación. El plegado de un conjunto diferente de las enzimas del metabolismo después de su translocación en todo el exterior y el interior de las membranas mitocondriales se puede esperar que el reto del sistema mitocondrial acompañante.

Importación de proteínas codificadas nuclear es vital para la función de la mitocondria. Un complejo mecanismo de chaperón proteínas es necesaria para el desarrollo de las proteínas mitocondriales, sus transeuropeas de transporte de membrana, y sus replegado en el interior de la matriz mitocondrial [5]. Este último se cree que se logrará en virtud de los 60 kDa chaperonin (CPN60). Esta proteína es un homólogo funcional y estructural a la GroEL chaperonin de la eubacteriae. La función de GroEL, ser objeto de una labor de investigación considerable, es bien conocido [6, 7]. En las bacterias, GroEL formas barril-al igual que las estructuras de dos anillos de subunidades, de 7 de cada una, con dos cavidades centrales. 7 subunidades de la GroES co-chaperonin forma una tapa que cubre una de las cavidades. Folding intermedias de cliente proteínas están obligados dentro de una cavidad donde se puede alcanzar la energía a favor de conformaciones sin injerencia de otros polipéptidos.

Menos conocido es, por comparación, sobre la función de GroEL homólogos eucariotas, la CPN60 proteínas. Son poseedores de las proteínas codificadas mitocondrial. En lugar de formar dos anillos de GroEL de siete subunidades, la chaperonin complejo en la mitocondria consta de un solo anillo de siete CPN60 y un anillo de CPN10 subunidades, y se muestra que la función de CPN60/CPN10 complejos en el interior de la mitocondria es similar a la chaperonin Función de las bacterias, citosólicas GroEL y GroES complejos [8, 9]. GroES también pueden desempeñar un papel en la modulación de la especificidad por el sustrato de GroEL. Por ejemplo, se informó de que GroES vinculante turnos de la preferencia de GroEL para hidrofóbicas aminoácidos hacia aminoácidos hidrófilos con cadenas laterales [10]. En la levadura, no todos los sustratos CPN60 necesidad para la correcta CPN10 plegables. Otras proteínas requieren tanto CPN60 y CPN10, mientras que recién importados CPN60 depende de CPN10 para corregir plegable [11].

Tuvimos que anteriormente se la Leishmania donovani CPN60.2 gen que codifica la mitocondrial 60 kD chaperonin [4]. Esto muestra el aumento de expresión de proteínas in vitro durante promastigote a amastigote diferenciación, lo que indica un requisito para CPN60 alterado en la fase amastigote. Un segundo, la divergencia genética copia, CPN60.1, no se expresa a niveles detectables en cualquier etapa del cultivo in vitro de L. L. donovani o importantes [4]. Para entender mejor proteína mitocondrial chaperoning amastigotes durante el ciclo de vida, hemos identificado el gen CPN10 de Leishmania donovani, determinó su abundancia en las dos etapas del ciclo de vida, y analizó la localización subcelular del gen producto y su asociación con CPN60.2.

Resultados
La amplificación de ADN L. donovani CPN10

Una adaptación de la conocida eucarióticas CPN10 secuencias de aminoácidos limitado reveló cuatro tramos de la secuencia de conservación (no se muestra). Oligonucleótidos CPN10.1 a CPN10.4 se diseñaron según el codón sesgo de Leishmania spp .. L. donovani utilizando ADN genómico como plantilla, combinaciones de los mencionados primers fueron probados en una reacción en cadena de polimerasa. Sólo la combinación de primers CPN10.1 y CPN10.4 producido una amplificación de producto de la espera tamaño (no se muestra). El producto de amplificación fue entonces subcloned en el vector pBluescript y sometidos a análisis de secuencias utilizando la secuencia estándar pBluescript primers. La secuencia de análisis confirmó que el producto de amplificación albergado probable CPN10 secuencias (no se muestra).

El aislamiento de un clon de ADN genómico CPN10

La amplificación de genes putativo CPN10 fragmento fue utilizado para clasificar una L. donovani ADN genómico cosmid biblioteca [3]. Cosmids positivos fueron sometidos a una restricción Southern Blot digerir y análisis para identificar subfragments común que se encontraba la CPN10 gen (s). Un 1,5 kb XhoI I fragmento que CPN10 hibridación con la sonda se subcloned en pBluescript y sometidos a análisis de secuencias. La secuencia (GenBank AF394959) contiene un marco de lectura abierto ininterrumpido de 303 bp codificación de un polipéptido putativo 10,7 kDa. Una comparación de la secuencia de búsqueda BLAST confirmó este polipéptido putativo lo que se refiere a eucarióticas y procariótico co-chaperonins. Figura 1A muestra la posición de la L. donovani CPN10 en el linaje de los eucariotas CPN10 proteínas. L. donovani CPN10 grupos dentro de la kinetoplastid homólogos. Figura 1B muestra una alineación con el seleccionado eucarióticas CPN10 polipéptidos. El alto grado de conservación de secuencia entre LdCPN10 y sus homólogos en eucariotas superiores indica una función conservada.

Análisis del Sur

Dentro del conjunto de cromosomas haploides, L. donovani CPN10 parece ser solo ejemplar. Esto fue determinado por Southern Blot L. donovani análisis de ADN genómico, digeridos con 7 endonucleasas de restricción (Figura 2A]. El patrón de fragmentos de restricción no indica la presencia de copias adicionales de genes. También se realizó electroforesis en gel de campo pulsado (Figura 2B] para determinar la localización cromosómica de los genes CPN10. La sonda de hibridación CPN10 específicas cromosómicas a una banda de aproximadamente 1100 kb. Este tamaño corresponde a los cromosomas 26 o 27 ter. Esto se confirmó cuando la secuencia de los principales L. genoma fue terminado; dos copias de CPN10 se encuentran en el cromosoma 26 http://www.genedb.org/genedb/Search?name=LmjF26.0620&organism=leish.

RT-PCR análisis

Del Norte análisis de L. donovani ARN utilizando un CPN10 específicos de la sonda no produjo ningún bandas en el rango de tamaño esperado. Para cerciorarse de que el putativo CPN10 gen codifica una ARN estable, se realizó RT-PCR. De células enteras se reversely ARN transcrito utilizando un oligo-dT primer. El primer capítulo de cDNA se utilizó como modelo en una amplificación mediante PCR primers CPN10-1 y CPN10-4. Controles negativos incluyó una amplificación de material de una combinación de la síntesis de cDNA que se han inactivado a 65 ° C durante 10 minutos (Figura 2C, carril 1), y una amplificación con una cantidad equivalente de células enteras RNA como plantilla (carril 3), a Excluir contaminaciones de ADN en el ARN preparación. Ambas reacciones no da lugar a un producto de amplificación. La reacción de ADNc como plantilla (carril 2), sin embargo, produjo un ~ 350 bp PCR producto, gran parte la misma que la reacción con el ADN genómico como plantilla (carril 4). Llegamos a la conclusión de que la estable, polyadenylated RNA se produce a partir de la CPN10 gen.

Producción de anticuerpos anti-CPN10

El marco de lectura abierta CPN10 se subcloned en pJC45, un derivado de la pJC40 [4, 12], para la expresión en E. coli cepa Bl21 (DE3) [13]. Su-etiquetados CPN10 fue purificado por cromatografía de metal quelato (Figura 3] y se usa para immunise las gallinas ponedoras. Los anticuerpos fueron preparados a partir de yema de huevo, antes y después de la inmunización de rendimiento pre-inmune y CPN10 preparativos de anticuerpos específicos. En los análisis Western Blot, estos anticuerpos recombinantes rCPN10 fielmente reconocidos (no se muestra).

LdCPN10 expresión es inducida en el amastigote

El uso de la anti-CPN10 anticuerpos, se realizó el análisis de inmunoblot sobre lisados de L. donovani promastigotes antes y después del choque térmico, y de axenically cultivadas amastigotes (Figura 4B]. En promastigotos cultivadas a 25 ° C, se observa sólo un leve banda en el rango de tamaño esperado. Después de las 24 h de tratamiento de los promastigotos a 37 ° C, se observa una señal. El CPN10 señal aumenta fuertemente durante la diferenciación in vitro amastigote. Figura 4A muestra muestras idénticas separadas por SDS-PAGE y tinción Coomassie Blue. Se concluye que la Leishmania donovani CPN10 se expresa preferentemente en la fase de amastigote, inducido por lo menos en parte, por la elevada temperatura.

CPN10 es el co-chaperonin en L. donovani

Por analogía, se espera que CPN10 como co-chaperonin a los 60 kDa chaperonin, CPN60. Sin embargo, hay dos divergentes miembros de la familia de genes CPN60 en L. donovani, CPN60.1 y CPN60.2. De ellos, sólo CPN60.2 podría ser mostrado para codificar una proteína que localizado a la mitocondria [4]. Por lo tanto, si la prueba CPN10 interactúa con CPN60.2 proteína en L. donovani y realizadas co-precipitación inmune. L. donovani lisados de células fueron incubadas con anticuerpos anti-CPN10, IgG anti-pollo (conejo) y Proteína-A agarosa. El material se precipitó luego analizado por inmunoblot utilizando anticuerpos anti-CPN60.2. Como se muestra en la Figura 4C, la lucha contra la CPN10 precipitado contiene una proteína que reacciona con los anticuerpos anti-CPN60.2. CPN60.2 Llegamos a la conclusión de que es la buena fe chaperonin y CPN10 que sirve como su co-chaperonin.

Localización subcelular de LdCPN10

Desde CPN10 sirve como co-acompañante a CPN60 esperábamos CPN10 para localizar a la kinetoplast / compleja en el interior de la mitocondria leishmaniae. Para probar esta predicción, la secuencia de codificación de CPN10 fue fusionado a un GFP (Green Fluorescent Protein), la codificación de ADN en el vector de expresión pIRmcs3-. La construcción fue linearised expresión recombinada en el rRNA locus de L. donovani a rendimiento estable expresión de la CPN10:: GFP quimera. El recombinante se cultiva como parásitos promastigotos y analizados por microscopía de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 5. Observamos brillantes fluorescentes estructuras tubulares en el promastigotos. No se observa fluorescencia en el citoplasma. Esto indica que la secuencia puede CPN10 cuantitativamente directa GFP en un compartimiento o orgánulos subcelulares.

Para identificar el compartimento subcelular que alberga CPN10, se realizó mediante microscopio electrónico inmune secciones de calor y subrayó promastigotos de amastigotes axénicos. La Figura 6 muestra el resultado. Encontramos las partículas de oro asociadas tanto con estructuras tubulares y con la kinetoplast. CPN10 Llegamos a la conclusión de que es una proteína mitocondrial.

Cuando analizamos la localización subcelular de CPN60.2 en L. donovani, este chaperonin, también, localizado a un compartimiento tubular subcelulares. Sin embargo, no hemos encontrado que asociados a la kinetoplast. Por lo tanto, la exacta localización subcelular estaba todavía claro. Uso de la cepa que sobreexpresa la CPN10:: GFP quimera, se realizó una co-inmune microscopía electrónica. Se utilizó anti-GFP mAB junto con anti-ratón inmunoelectrónica partículas (5 nm). A continuación, las secciones fueron teñidas co-utilizando anticuerpos anti-CPN60, IgG anti-pollo (conejo), y una proteína de oro (10 nm). Como se muestra en la Figura 7, CPN10:: GFP y CPN60 colocalise tubular en el mismo compartimento. Esto demuestra que CPN60.2 es realmente una proteína mitocondrial en Leishmania.

Discusión

Hemos clonado y analizado el gen de la CPN10 protozoo parásito Leishmania donovani. Este es, a nuestro conocimiento, la primera caracterización de un protozoario miembro de la familia de GroES conservadas co-chaperonins. Desde CPN10 es una proteína muy pequeña con un impacto en la función mitocondrial, la secuencia de las restricciones a la variación debe ser más bien estrechas. En consecuencia, Leishmania CPN10 es> 60% similares a los de mamíferos CPN10 secuencias. Una comparación de la L. donovani CPN10 con otros genes eucariotas GroES homólogos confirma aún más que la leishmaniae pertenecer a una distancia entre la entidad eukaryota, claramente separada de la Corona Grupo eucarióticos. Una posición similar se observó divergieron de la GroEL homólogo de L. donovani, CPN60.2 [4].

El gen para CPN10 es solo ejemplar en el genoma L. donovani. Esto es en contraste con la CPN60.2 gen que está presente en dos copias, además de una, en la medida de lo conocido en silencio, CPN60.1 gen [4]. También está en contraste con la situación en los principales L.. Según la base de datos del genoma L. major, L. los principales CPN10 está codificado por dos copias de genes situados en tándem. Si se confirma, esta diferencia podría servir para distinguir ambas especies de Leishmania que tienen superposición de regiones endémicas.

CPN10 eucariotas, al igual que su homólogo bacteriana, GroES, se supone que actúan como co-chaperonin a CPN60 en la matriz mitocondrial. Inmune microscopía electrónica revela que CPN10 localiza tanto a la kinetoplast y de la parte tubular de la mitocondria. Más importante aún, co-immunoprecipitation experimentos de establecer una interacción directa entre CPN10 y CPN60.2. Esto no sólo indica una función de la buena fe CPN10 como co-chaperonin, sino que también establece CPN60.2 como la Leishmania GroEL homólogo. Además, la localización mitocondrial de las dos proteínas está ahora bien establecida.

La secuencia mitocondrial de transporte de señales de CPN10 puede dirigir a la importación de la mucho más grande CPN10:: GFP quimera en la mitocondria y la kinetoplast. La quimera se expresa de la integración estable en el sitio rRNA gen se repite. La quimera puede servir para futuros diseños experimentales como localiasation marcador mitocondrial, y como marcador de la integridad de la mitocondria.

CPN10 El gen se expresa preferentemente bajo el calor y el estrés en axénicos amastigotes de L. donovani. El complejo socio putativo, CPN60.2, muestra también el aumento de la abundancia en virtud de estrés por calor [4]. La inducción de la CPN10, sin embargo, es más pronunciada, y comparable a la inducción de Hsp100 [3]. En este sentido, tres de las proteínas de choque térmico, Hsp100, Cpn60.2, y CPN10, difieren de los principales acompañantes, Hsp70 y Hsp90 (Hsp83). Estos últimos muestran altos constitutiva abundancia y sólo un aumento marginal en el calor y en la fase amastigote [3, 14]. Es probable que estos diferentes expresión cinética reflejan diferentes funciones durante el ciclo de vida. Hsp100 se requiere sólo en amastigotes intracelulares de L. donovani y tiene un papel amastigote en la expresión de genes específicos [15]. CPN60.2, y más aún, CPN10, son, evidentemente, también en el aumento de la demanda durante la fase amastigote.

¿Hay una función específica para CPN10 durante los mamíferos etapa de la vida del parásito ciclo? Se ha sugerido que GroES pueden alterar la afinidad de GroEL de cadenas laterales de aminoácidos [10]. En la levadura, proteínas sustrato Mayo veces CPN10 ya sea de forma independiente o en una forma dependiente de CPN10-[11]. Esto plantea la posibilidad de que la expresión preferencial de CPN10 en amastigotes de L. donovani puede reflejar un cambio en la especificidad por el sustrato de los complejos mitocondriales chaperonin, necesaria por el cambio del medio ambiente y los cambios concomitantes en la disponibilidad de nutrientes. Desde CPN10 es un ejemplar único gen que es expresado en la etapa de proliferación promastigote, puede ser un buen objetivo para el método de sustitución de un gen. Esto debería permitir a evaluar el papel de CPN10 para la virulencia y patogenicidad de los parásitos Leishmania.

Conclusión

Hemos identificado la Leishmania donovani homólogo de la co-bacterial chaperonin, GroES, y el nombre asignado a CPN10 el gen y la proteína. CPN10 es una proteína de choque térmico y muestra el aumento de la concentración intracelular en una elevación de la temperatura y en axenically cultivadas amastigotes de L. donovani. CPN10 localiza a la mitochodrial compartimiento y co-localiza con la GroES homólogo, CPN60.2. Una interacción directa de las dos proteínas se demostró utilizando co-inmuno precipitación. CPN10 y CPN60.2 Ambos son, por tanto, marcadores adecuados para la mitocondria de Leishmania spp. Y especies relacionadas. Además, el aumento de la concentración en la fase amastigote sugiere un papel de CPN10 en esta etapa.

Métodos
Cepas de parásitos y de la cultura

Para nuestro análisis hemos utilizado la Lo8 cepa de L. donovani, un regalo de D. Zilberstein. Promastigotos habitualmente se cultivan a 25 ° C en medio complementado M199 [3]. Densidad celular se vigila mediante un Schaerfe Sistemas CASY contra Cell. In vitro promastigote a amastigote diferenciación se realizó tal como se describe [3].

Mediante amplificación por PCR de ADN CPN10

Cuatro primers se delinearon de una secuencia de aminoácidos conocida comparación de GroES y CPN10 proteínas. La extrema parcialidad en Leishmania hacia G C y residuos en el bamboleo posiciones de los codones se utilizó para crear los cebos con un mínimo de degeneración:

Primer CPN10.1: CCGCTGTTCG ACCGCGTGCT GG

Primer CPN10.2: GGCGGCATCR TGCTGCC

Primer CPN10.3: CGGCAGCAYG ATGCCGCC

Primer CPN10.4: CAGCACCTTG TCGCCCACCT TCAC

100 ng de DNA genómico L. donovani se mezclaba con 40 ng de oligonucleótido primer pares, 25 mmoles de cada dNTP, 10 × reacción de amortiguación, y 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Beckman) en un 50 μ l de reacción. La mezcla de reacción se incubó durante 1 min a 95 ° C, 1 min a 55 ° C, y 1 min a 72 ° C. El ciclo se repitió 35 veces. 10% de la reacción se analizó en un gel de agarosa al 1%. Controles negativos incluyen cada primero por sí mismo y omisión de la plantilla de ADN. Bandas ausente de los controles negativos fueron recuperados por electroforesis en gel de agarosa preparativa y mediante el uso de cuentas de cristal adsorción (PureGen Kit, Biozyme). Productos de PCR fueron subcloned utilizando el kit de clonación TA (Invitrogen) y sometidos a análisis de secuencias ..

La transcriptasa inversa (RT-) PCR

Total RNA de parásitos promastigotos etapa cepa Lo8 se preparó utilizando un Kit Ribolyser (Hybaid). La síntesis de ADNc se realizó utilizando la Primera Strand síntesis kit (Pharmacia) con la adjunta (dT) 18 primer tipo y 5 μ g de RNA total. El cDNA fue amplificado utilizando los primers enzimáticamente CPN10.1 y CPN10.4 La amplificación se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.

Biblioteca de cribado

Se utilizó un cosmid biblioteca de L. donovani anteriormente descrito en [16]. La biblioteca se proyectó digoxigenina por hibridación con sondas de ADN marcado derivados de los productos de amplificación subcloned. Hibridación se realizó a los 65 ° C en la solución HYB 9 (Biozyme) durante 16 h. Lavados se realizaron en la disminución de las concentraciones de la cooperación Sur-Sur (6 × 0,2 × a la cooperación Sur-Sur, 0,5% SDS) a 65 ° C. Fueron desarrollados utilizando filtros anti-digoxigenina FAB / AP conjugada (Boehringer Mannheim), seguida de colorimetría tinción con NBT / BCIP. Cosmid clones positivos fueron recogidos, rescreened, y verificado en una reacción de amplificación utilizando CPN10 primers específicos.

Subcloning y análisis de secuencias

Cosmid ADN de los clones positivos fue sometido a restricción endonucleased Southern Blot digerir y adecuado para determinar endonucleasas de restricción. Cosmid ADN fue digerido en una escala preparativa y subcloned en una adecuada cleaved pBluescript KS + vector (Stratagene) o pJC45 vector [4]. Plásmido subclones luego fueron víctimas de caminar bidireccional primer análisis de la secuencia, a partir de las secuencias conocidas de la PCR amplificates. Secuenciación se realizó en un Applied Biosystems modelo 370 secuenciador utilizando el Kit DyeTerminator.

Secuencia de la evaluación

Contig alineación, en silico traducción, y la alineación de secuencias se realizaron mediante el MacMolly Tetris y el MacVector paquetes de software. Se realizaron análisis filogenético utilizando el algoritmo clustalW con MacVector incluido en la configuración por defecto.

Recombinante expresión de CPN10

El marco de lectura abierta putativo de CPN10 fue amplificado utilizando primers específicos que modificar la secuencia de inicio en un codón NdeI sitio y el codón de secuencia en un sitio EcoRI. Los productos de amplificación fueron cleaved con NdeI y EcoRI ligated y en el vector de expresión pJC45 [4], entre los NdeI sitio y el sitio EcoRI. La expresión de plásmidos se transformó en la cepa BL21 (DE3) [pAPlacIQ], un regalo de Olivier Payet, CNRS Toulouse. Las bacterias se cultivaron en medio CircleGrow (BIO 101) complementado con 50 μ g / ml Ampicillin y 10 μ g / ml kanamicina a OD600 = 0,5. IPTG se añadió a 1 mM y se continuó la incubación durante 1 h. La purificación de Su-etiquetados proteínas de lisados bacterianos metal quelado por cromatografía de que se ha descrito [12, 14].

Para expresar CPN10:: GFP quimera, la secuencia de codificación de CPN10, menos el codón de parada, se enzimáticamente amplificado para crear sitios HindIII BamHI y en el 5 'y 3' termina, respectivamente. Digerido con BamHI y HindIII, los productos de amplificación fueron ligated entre los sitios BamHI y HindIII del plásmido p426/PQ25 levadura [17]. Mediante este procedimiento, y las buenas prácticas agrarias CPN10 codificación de las secuencias fueron fusionados en el marco. El quimérico CPN10:: secuencia de codificación de las buenas prácticas agrarias, se extirparon con BamHI y XhoI y ligated en pIRmcs3-[18]. El plásmido pIRCPN10:: GFP y el padre plásmido pIRmcs3-se linearised utilizando SwaI y transfectadas en L. donovani por electroporación. Recombinante parásitos fueron sometidos ClonNAT (Werner Bioreagents) selección (100 μ g / ml) y se analizaron por microscopía de fluorescencia.

La inmunización y la preparación de anticuerpos

La inmunización de las gallinas ponedoras y de la preparación de anticuerpos de yema de huevo ha sido descrito [19].

El análisis por inmunotransferencia

SDS-PAGE y Transferencia de Occidental se realizaron como se describe [14, 19]. En pocas palabras, las membranas fueron tratadas con el amortiguador de bloqueo (4% leche descremada en polvo y 0,1% de Tween 20 en DPBS), con anticuerpos en diluciones adecuadas en el amortiguador de bloqueo, y con el anticuerpo secundario / fosfatasa alcalina conjugada (Dianova) en el amortiguador de bloqueo. Blots se tiñeron con nitrobluetetrazolium cloruro y 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolyl.

Inmune precipitación

1 × 10 8 promastigotos fueron cosechadas por centrifugación y lisadas en 500 μ l de buffer de salida (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, y el 2,5 μ g ×-1 ml cada uno de aprotinina, leupeptina, pepstatin, Y antipain). Lisados se centrifuga a 13000 × g, 4 ° C. Proteínas solubles fueron incubadas con 20 μ l de anticuerpos anti-CPN10 de 1 h a 4 ° C. 350 μ l de proteína A-sepharose purines se preincubated con anti-IgG de pollo y conejo añadió. Los purines se incubaron a 4 ° C durante 2 h. El inmunoensayo se centrifugó y se lavan tres veces en un tampón de lavado (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,2% NP-40, 2 mM EDTA), dos veces en el lavado de amortiguación B (como se indica más arriba, con la excepción de NaCl es 500 mM) y una vez en el lavado de amortiguación C (10 mM Tris-HCl pH 7.5). Para el análisis de SDS-PAGE 250 μ l de SDS se añadió buffer de muestras y las muestras fueron calentadas durante 5 minutos a 95 ° C. Después de la centrifugación, de 50 μ l del sobrenadante fue cargado en un 12% de gel de PA.

Inmune microscopía electrónica

Inmune microscopía electrónica se realizó tal como se describe en esencia [3]. LR-White incrustados microsections fueron tratados con anticuerpos de pollo en 1:500 (anti-CPN10) o 1:2000 (anti-CPN60.2) en PBS (0,1% de Tween 20, 1% BSA). Anti-IgG pollo (conejo) y Proteína-A inmunoelectrónica partículas (10 nm) para la detección. Para la detección de CPN10:: GFP quimera, anti-GFP anticuerpo monoclonal y 5 nm anti-ratón conjugado inmunoelectrónica (Sigma) fueron utilizados.

Microscopía de fluorescencia

L. donovani promastigotes expresando CPN10: GFP quimera se cultivaron a 2 × 10 7 células ml -1. 1 10 1500 × g. El sobrenadante fue descartado y el pellet de células se resuspendió en 200 μ l de Dulbecco del PBS. 2 μ l se aplicó a un portaobjetos de microscopio multiwell y sometidos a la microscopía de fluorescencia en la magnificación de 63 veces. Las muestras se analizaron en campo claro y en el FITC utilizando un canal de Hitachi Modelo de cámara CCD monocromo. Las imágenes fueron tomadas y se combina la improvisación utilizando Open Lab ® paquete de software y su exportación en formato TIFF. Cosechando y yuxtaposición se realizaron utilizando el software Adobe Photoshop ®.

Pulsada electroforesis en gel de campo

Leishmania células fueron cosechadas por centrifugación y se lavan dos veces en PBS. Tras la centrifugación, los parásitos se resuspendió en PBS y mezclado con un volumen igual de prewarmed 1,5 InCert agarosa (FMC BioProducts, Rockland). Esta mezcla se alicuotar en bloque de formadores (2 × 107 parásitos por bloque, Pharmacia). Para lyse parásitos, los bloques de agarosa fueron incubadas en 2 mg / ml de proteinasa K (1% Laurylsarkosyl, 0,5 m EDTA pH 9,0) a 37 ° C durante 48 h, y se almacena en 0,5 EDTA a 4 ° C.

PFGE se realizó a los 13 ° C en 0,25 × TBE buffer bajo las siguientes condiciones: intervall en segundos: 100-10 registro, el cambio de ángulo: -110 lin; voltaje: 200-150 log (Rotaphor, Biometra).

Saccharomyces cerevisiae cepa YPH80 cromosomas (New England Biolabs) se utilizan como normas de tamaño.

Después de la tinción con bromuro de etidio (1 μ g ml-1) y la rotura de un capítulo de 5 minutos de exposición a la radiación ultravioleta (254 nm), el gel se borró en una membrana de nylon de carga positiva (Qiagen) por transferencia alcalina [20]. La membrana se digoxigenina hibridación con una sonda marcada con CPN10. Blots se tiñeron como se ha descrito anteriormente.

La imagen digital

Primaria datos experimentales fueron digitalizados, ya sea en un scanner (Microtek Scanmaker 8700) o en un escáner de película de 35 mm (NIKON LS-4000). Fósforo de imágenes (Molecular Dynamics) se importaron directamente de datos como imágenes TIFF. Las imágenes fueron cultivadas y optimizados para la saturación del color utilizando el software Adobe Photoshop ®. Ningún filtro u otra alteración de las funciones de la imagen estaban empleados en las imágenes o partes de ellos. Las imágenes fueron combinadas con gráficos vectoriales y texto utilizando software ClarisDraw ®, versión 1.0d.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

FBZ-V. Realizó la clonación de CPN10, la electroforesis en gel de campo pulsado, RT-PCR, la expresión de proteínas recombinantes y producción de anticuerpos policlonales, la construcción, y el análisis de transfección CPN10:: GFP quimera, y el análisis inicial de inmunoblot.

MK realizó el microscopio electrónico inmune y experimentos adicionales inmunoblot.

DZ amplificada y caracteriza CPN10 ADN de L. donovani ADN genómico.

JC concebido en el estudio, bajo la supervisión de la ejecución y preparó el proyecto final del manuscrito.

Todos los autores participaron en la redacción del manuscrito, y leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a C. y K. Hoyer Mellenthin para el uso de las bibliotecas y cosmid DNA de consejos prácticos, T. Jacobs para ayudar con microscopía de fluorescencia, S. Krobitsch para un regalo de p426/PQ25 plásmido, y A. Macdonald para más La asistencia técnica. F. Zamora-Veyl fue un post-doctoral fellow de la Deutscher Akademischer Austauschdienst.