Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 15-15 (más artículos en esta revista)

Diabetes (db / db) mutación inducida por epitelio endometrial lipoapoptosis: análisis ultraestructural y citoquímicas de la atrofia del tracto reproductivo

BioMed Central
David R Garris (garrisd@umkc.edu) [1]
[1-64110 EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

La diabetes (db / db) mutación en ratones C57BL/KsJ promueve un progresivo cytolipidemia en el epitelio endometrial (EE) de la capa del tracto reproductivo femenino en el que los resultados prematuro celular y atrofia de órganos. Los estudios actuales se centran en los cambios ultraestructurales y citoquímicas nucleares que promueven la apoptosis y cytostructural después de la interrupción de la expresión endometrial hypercytolipidemia que promueve la diabetes asociada a la infertilidad organoinvolution y manifiesto.

Métodos

Control (:+/+) normal y la diabetes (db / db) genotipo grupos se prepararon para la luz alta resolución análisis microscópico de cytolipidemia nuclear y la apoptosis (TUNEL-3'-etiquetados fragmentación del ADN) y los índices en comparación con la electrónica de transmisión (TEM) Análisis microscópico del tejido endometrial de las muestras obtenidas de 8-16 semanas de edad, los grupos.

Resultados

En comparación con los controles, db / db mutación expresión inducida por un aumento espectacular en EE cytolipid vacuola volumen y la densidad dentro de la capa del epitelio endometrial. TEM análisis reveló que cytolipid vacuola acumulaciones inicialmente agregados en el baso de las regiones polares de UEE células en respuesta a la sistémica hiperglucémicas / hipertrigliceridémica condiciones que caracterizan el (db / db). Citoplásmica progresiva de la circulación de lípidos en piscinas perinuclear compartimentos de las células afectadas EE nuclear inducida por el aislamiento de los organelos que fueron desplazados hacia la periferia citoplásmica compartimentos. Citoquímicas análisis de la acumulación de lípidos vacuola indicó atracción hacia, y la incorporación en el interior, la envoltura nuclear de células hiperlipidémicos. Co-localización de las armas nucleares de apoptosis 3'-fragmentos de ADN en células identificadas hiperlipidémicos EE fue coincidente con la citoquímicos y ultraestructurales de identificación de los lípidos penetración a través de la envoltura nuclear en db / db mutantes.

Conclusión

Estos resultados son la primera indicación de que citoquímicas las alteraciones metabólicas en db / db promover hypercytolipidemia mutantes que son coincidentes con lipoapoptosis nuclear inducida por disolución, como se denota por el análisis de la fragmentación del ADN. El lipidemia inducida por alteraciones en orgánulos intracelulares y arquitecturas nuclear sugiere que las alteraciones metabólicas en la glucosa y de lípidos en la diabetes cascadas metabólicas (db / db) mutantes cytointegrity perturba, que culminaron en disregulation nucleares (tal como se indica por lipoapoptosis) y eventual prematuro del sistema reproductor y organoinvolution Resultante, manifiesta, la esterilidad reproductiva.

Antecedentes

El cytoarchitecture del tracto reproductivo femenino se ve gravemente comprometida por la deletérea influencia de la diabetes inducida por alteraciones en el útero-ováricos celular glucometabolism [1 - 3]. En los seres humanos [4 - 6] y modelos experimentales [7 - 11], la diabetes asociada a alteraciones en el metabolismo del endometrio uterino y la estructura se han asociado con pronunciada hypercytolipidemia, una hiper-calórico que induce la respuesta metabólica celular hiperlipidemia y la posterior promoción de la prematura del tracto reproductivo Involución [2, 3, 12 - 16]. El resultado de reproducción se caracteriza por la incompetencia reproductiva acyclicity [13, 14], el desarrollo folicular ovárico en peligro [14], la depresión de la síntesis de hormonas esteroideas de ovario [17], la depresión y la sensibilidad a Responsividad endocrinos estimulado el metabolismo celular [18 - 20] y el aumento de útero - Atrofia epitelial [2]. Los afectados endometrial arquitectura se caracteriza por un enorme aumento de la intra-e inter-celular deposiciones de los lípidos [2, 13], resultante de la intersticial perivascular y escapar de la imbibición sistémica elevados de triglicéridos y de ácidos grasos libres moities [21, 22], que caracterizan a la Una diabetes (tipo 2), metabólicas (X), síndrome [23, 24]. En última instancia, la exposición crónica a la influencia de la no homeostático condición metabólica induce un síndrome de lipoatrofia [12 - 14], que se caracteriza por la progresiva acumulación de inclusiones cytolipid [2], orgánulos disolución [2], compartimento nuclear de aislamiento [15], reprimidas Metabolismo oxidativo celular [13], y cito-atrofia [9, 13, 14, 17]. Los informes recientes han indicado que la manifestación de la diabetes (db / db) mutación en ratones C57BL/KsJ compromisos del tracto reproductivo de maduración mediante la promoción de hypercytolipidemia en el epitelio endometrial capa (EE) [2] que se caracteriza por un progresivo aislamiento de los lípidos de la Núcleos de las células que rodean organelas citoplasmáticas compartimentos [15]. La expansión de volumen en el endometrio cytolipid db / db mutantes se ha asociado con ruptura de la cromatina nuclear (ADN) y de la integridad estructural pycnosis asociada a la degeneración [24]. Sin embargo, la co-expresión de incidente hypercytolipidemia metabólicas y estructurales nucleares disolución, como un índice por 3'-la fragmentación del ADN [24] dentro de los núcleos apoptóticos, queda por demostrar. En el presente estudio se diseñó para evaluar la co-incidente citoquímicas y alteraciones ultraestructurales que promueven prematuro, degeneración progresiva lipoapoptotic nucleares en el epitelio endometrial capa de la obesidad, hipoglucemiantes, hiperlipidémicos y hypogonadal (infértil) db / db-mutante del tracto reproductivo.

Materiales y métodos
Animales

Adultos, mujeres C57BL/KsJ ratones (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), entre 8 y 16 semanas de edad, que denota la abierta y las fases crónicas de la diabetes de tipo 2, síndrome [14], se utilizan en estos estudios y mantenidos de conformidad Con los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH publicación No. 80-23). Littermate controles (+/+) y la diabetes (db / db)-mutante genotipos, fueron acompañados par de fenotipo, la toma de muestras de tejidos y la concentración de glucosa en la sangre comparaciones en el curso de estos estudios. Todos los ratones fueron alojados cinco por jaula, agrupados de acuerdo con genotipo, bajo condiciones ambientales controladas (23 ° C), con un fotoperíodo de 12 establecido Horas de luz / día (encendidos: 0600 h) [13, 14]. Niveles de glucosa en sangre (Ames Glucometer método), las concentraciones de triglicéridos en suero (Sigma, St Louis) y pesos corporales fueron controlados en cada una de las 8 a 16 semanas de edad, los grupos de edad que se describió anteriormente [13, 14]. Los animales que muestran tanto la obesidad (≥ 25 gramos) y pronuncia la hiperglucemia (≥ 200 mg / dl) y la hiperlipidemia (≥ 200 mg / ml de suero triglicéridos) en relación con los controles (≤ 150 mg / dl y mg / ml, respectivamente) fueron consideradas como manifiesta , De los diabéticos obesos [16, 23], con la expresión comparativa de estos índices señaló en relación con el control o la mutación genotípica (Tabla I] de los grupos en todo el período experimental.

Obtención y preparación de tejidos

Endometrio uterino muestras de tejidos de cada grupo de control de la diabetes y el (+/+) (db / db) acompañado de pares de genotipos fueron recolectados, pesadas y preparado para microscopía de luz de alta resolución (HRLM), citoquímicas citoplásmica análisis de las deposiciones de los lípidos y la transmisión a través de microscopía electrónica (TEM) el examen que se describió anteriormente [2]. En resumen, los ratones fueron anestesiados a las 8 (es decir, la fase abierta) o 16 semanas (es decir, la fase crónica de tipo 2, síndrome de expresión y de compromiso del tracto reproductivo) [14] con pentobarbital sódico y sistémicamente perfundidos con 50 ml de suero fisiológico y 100 ml De la solución de Karnovsky solución. Cobrados mediados de cornua muestras de tejido uterino fueron limpiados, borrados, bloqueado y embebidos en parafina o plástico, ya sea mediante técnicas convencionales [2]. Todas las muestras de tejido fueron seccionadas y teñidas con azul de toluidina-fucsina básica mezcla de policromía de identificación [24, 25], de los lípidos celulares piscinas por HRLM o con tetróxido de osmio [2] antes de su examen por TEM.

Alta resolución, Digital y TEM, Hypercytolipidemia Análisis

Muestras de tejido preparado para la luz análisis microscópico se utilizaron para policromía orgánulos diferenciación, la localización de la acumulación intracelular de lípidos inclusión, y la determinación de citoplásmica cambios asociados con la progresión de la expresión db / db mutación a lo descrito previamente [25]. Imágenes fotográficas de los compartimentos del tejido uterino y de las poblaciones de células epiteliales de las muestras de tejidos preparados fueron capturados con un Olimpo (Olympus Optical, Tokio, Japón) y cámara digital gráficos microscopio unidad, con lípidos vacuola piscinas digitalmente una mayor utilización de policromía mancha de identificación, color y digital - Escala de conversión de químicos específicos de análisis de localización de triglicéridos [25]. Muestras de tejido preparado para TEM análisis de los mismos grupos se analizaron las variaciones estructurales en organelas citoplasmáticas cambios en la densidad de inclusión y de los lípidos, así como para uterino lámina basal y peri-nuclear de los cambios inducidos por la expresada hypercytolipidemia asociados a la expresión (db / db ) Mutación [2].

Localización y análisis de los db / db-Asociado Nuclear Lipoapoptosis

Uterino muestras de los grupos designados fueron recogidos y rápidamente congeladas para criostato (-20 ° C) la sección posteriormente preparados para TUNEL (FD NeuroTechnologies; Ellicott City, MD) etiquetados apoptosis 3'-análisis de la fragmentación del ADN, un reconocido químico asociado con nuclear Cromatina disolución, según lo descrito anteriormente [20]. Las láminas fueron colocadas en 0,1 M tampón fosfato (PBS: pH 7.4), que contiene un 4% (v / v) paraformaldehido durante 30 minutos. Muestras de tejido fueron posteriormente lavados (x2 enjuagues @ 5 minutos cada uno) en PBS 0.01M, entonces fijo en la pre-enfriado (-20 ° C) etanol: ácido acético (2:1 v / v) durante 5 minutos, se lava (x2) En PBS por 10 minutos para asegurar la adecuada preservación del tejido antes de la preparación para el etiquetado TUNEL. Detección de libre 3'-hidroxilo terminal fragmentos de ADN se realizó a través de in situ TdT-mediada-biotina dUTP nick fines de etiquetado (TUNEL) técnica. Terminal deoxynucleotidyl transferasa se utilizó para la incorporación de catalizado con biotina deoxyuridines expuestos en el 3'-hidroxilo termini de los fragmentos de ADN que etiquetados en apoptosis. La integrado biotins mayor y se visualizan como denso, localizado avidina-biotina-complejos identificables por HRLM. Todos los etiquetados TUNEL endometrial muestras fueron posteriormente counterstained para policromía cytostructural análisis [25], que permitan la identificación de hypercytolipidemia dentro de las mismas celdas de la etiqueta nuclear apoptosis. Intracelular nuclear o citoplásmica orgánulos (mitocondrial) TUNEL etiqueta especificidad se evaluó antes de citoquímicas análisis de los co-localizados vacuola perinuclear de lípidos y de los perfiles de densidad de fragmentos de ADN 3'-, indicativo de alteraciones cytodegenerative apoptosis, en las células del epitelio endometrial afectados exhiben hypercytolipidemia.

Análisis Estadístico

Los valores para el peso y las concentraciones de glucosa en la sangre se expresaron como grupo de medios (± SEM) para el genotipo de los grupos designados. Intergrupo diferencias se determinaron utilizando el Student T-test y exámenes de Análisis de Diferencia, con una p ≤ 0,05 aceptado como representación de las diferencias de medición estadística intergrupo.

Resultados
Citoquímicos y de análisis ultraestructural del epitelio endometrial Hypercytolipidemia

Los cambios en el peso, el peso uterino y concentración de glucosa en sangre en ratones C57BL/KsJ resultante de la expresión de la diabetes (db / db) mutación se indican en la Tabla I. Dramático aumento de la obesidad y fenotípicas asociadas situaciones hiperglucémicas caracteriza (db / db) en relación con los grupos (+/+) índices. En cambio, el peso uterino en la db / db-mutante grupo reducido (cuadro I], en asociación con la progresiva y la atrofia endometrial hypercytolipidemia que caracterizó el útero preparado para HRLM muestras y análisis de TEM.

La acumulación y la retención de EE células cytolipid tiendas por (+/+) tejidos se encontró que se limita a la baso de las regiones polares de control de todas las muestras examinadas por HRLM (Figura 1A, C] y TEM (Figura 2A] análisis entre el 8 y el 16 semanas de edad. Los químicos específicos de localización de los depósitos de triglicéridos basales citoplásmica caracteriza + / + endometrial células epiteliales, en la que frente al citoplasma de orgánulos distribución y organización eran indicativos de un viable cytoarchitecture (Figura 2A]. En contraste, el color de identificación de las deposiciones en hypercytolipidemic (db / db) muestras de tejidos se demostró por el cytoarchitectural observado por ambas alteraciones citoquímicas HRLM (Figura 1B, D] y TEM (Figura 2B] análisis. Características de los 8 - 16 semanas de edad db / db-mutante muestras de tejido (Figuras 2B, 3] fue el enorme aumento de los triglicéridos frente al citoplasma de las piscinas que fueron distribuidos en un gradiente entre patrón basal, apical citoplásmico perinuclear y regiones (Figuras 2B, 3 ). TEM análisis de las muestras de epitelio endometrial db / db grupos indicó que el polo basal citoplásmica compartimentos figura densa, la ampliación de la acumulación de lípidos vacuola que progresivamente emigraron a rodear y ocupar el espacio perinuclear de las células afectadas (Figura 3]. El progresivo cambio en las configuraciones de envoltura nuclear (es decir, confusa membrana, pycnotic distorsiones) inducida por el perinuclear lípidos piscina expansiones incluidas dramática invaginaciones de la membrana externa nuclear, la cromatina aglutinación interior a lo largo de la membrana nuclear y la interrupción física de la dotación en regiones en las que la integridad de lípidos Fracciones se observaron ponerse en contacto con el exterior y penetrar en la lámina nuclear (Figuras 2B, 3, 4A], como lo demuestra el análisis de TEM. La membrana nuclear y la cromatina asociados con la acumulación de lípidos pronunciada perinuclear se caracteriza además por un importante ampliación de la perinuclear espacio que rodea a cada célula afectada (Figura 3], la promoción de un aislamiento físico del compartimento nuclear de los organelos citoplasmáticos que fueron desplazados por periféricamente La ampliación de las piscinas frente al citoplasma de los lípidos.

Citoquímicos y TUNEL-Sello de Análisis de las nucleares Lipoapoptosis

La influencia de db / db inducida hypercytolipidemia nucleares interrupción fue evaluado por el combinado citoquímicas de la localización intracelular de triglicéridos por las deposiciones con ayuda de computadora, digital citoquímicas análisis y la co-localización de la fragmentación del ADN 3'-por-TUNEL counterstaining etiquetada como un índice Disolución de la cromatina nuclear (apoptosis) eventos (Figura 4B-C]. TUNEL al índice de apoptosis nuclear, localizado en db / db UEE células con co-incidente hypercytolipidemic vacuolar expansión (Figura 4B]. Al ser sometido a análisis de triglicéridos citoquímicas (Figuras 4C, 5], nuclear TUNEL etiqueta fue co-localizado en el cytolipid deposiciones presente tanto en la mitocondria ricos basal polo citoplásmica compartimento, así como dentro de la perinuclear y nucleares de compartimentos afectados db / Db células (Figura 4C]. TUNEL densa nuclear de la etiqueta se encuentra dentro de los compartimentos definidos nuclear de db / db células (Figura 4C], y fue prominente dentro de la capa de células basales de la proliferación del tejido epitelial en la que ambas TUNEL hypercytolipidemic vacuola y deposiciones fueron co-localizada (Figura 5 ). En db / db EE muestras demostrando perinuclear piscina penetración de los lípidos de la envoltura nuclear afectados, TUNEL-lipoapoptosis se indica un índice de compromiso celular promovido por la penetración de triglicéridos y de la perturbación de organización nuclear del epitelio (Figura 5]. El lipometabolic perturbación de cytostructural organización que coincidió con la co-localización nuclear de la apoptosis (TUNEL-etiqueta) y hiperlipidémicos, citoquímicas índices, que caracteriza la prematura EE cytoatrophic involución del tracto reproductivo femenino asociado a la abierta expresión de la tipo 2 (DMNID ), Síndrome de la diabetes.

Discusión y Conclusiones

Los resultados actuales demuestran que el microambiente hiperlipidémicos metabólica inducida por la expresión de la diabetes (db / db)-mutación promueve un progresivo lipoapoptotic cytoatrophy de EE tejido, eventos que contribuyen a organoinvolution prematuro de la hembra del tracto reproductivo y esterilidad manifiesta en la C57BL / KsJ modelo murino de la mutación de un gen vinculado, heredado, dysregulated síndrome metabólico [12, 23]. El único co-localización de la vacuola densa cytolipid piscinas en las células afectadas experimentando TUNEL al índice de apoptosis y de la cromatina nuclear disolución hypercytoplasmic indica que el secuestro de lípidos extracelulares en el compartimento citoplásmico perinuclear compromisos nucleares organización por la promoción de la fragmentación del ADN nuclear y la posterior degradación por lipo - Infiltración (Figura 6]. En última instancia, la progresiva cytometabolic perturbación de las capas endometriales compromisos cytostructural tracto reproductivo y la integridad del tejido [2, 3], según lo indicado por la reducción de la biomasa uterino en db / db grupos. Similar a la diabetes y la obesidad asociada a la reproducción humana complicaciones en estudios clínicos [4, 6], el reconocido alteraciones fenotípicas y en ambos cytolipid (metabolismo) los índices adiposo-inducido una organización celular como en el EE capa [2]. Los cambios resultantes en organelas intracelulares desplazamiento hacia la periferia citoplásmica compartimentos, el embotamiento de EE apical ciliar y microvillus expresiones [2], la alteración química (es decir, hiperlipidemia), la composición y la disolución coincidente nuclear apoptosis (Figura 6], correlacionado con el reconocido funcional Compromiso órgano-y prematuro de la involución del sistema reproductor femenino [2] en db / db genotipo mutantes. La progresiva intracitoplasmática de tráfico intracelular de lípidos basales de las piscinas-a-perinuclear-to-apical citoplásmica loci, se ha reconocido que se asocia tanto con la duración y la gravedad de las aberraciones metabólicas sistémicas en db / db-mutantes [2, 15]. Estos datos sugieren que la progresiva infiltración de lípidos de la capa de EE promueve el indicado estructurales, metabólicas y trastornos de lipoapoptotic núcleo (ADN)-transcripcional dirigida cascadas metabólicas que, en última instancia no inducir cambios en la homeostasis cytoarchitectural afectados db / db células que se vuelven incapaces de El apoyo a la función normal del tracto reproductivo (Figura 6]. La progresiva interrupción de estos índices estructurales interdependientes y cascadas metabólicas culmina en la resultante, acumulativos, cytoatrophic prematuro organoinvolution del tracto reproductivo femenino y manifiesto la esterilidad.

De particular interés es el de la progresiva acumulación perinuclear y la infiltración de la nuclear por compartimiento db / db-mutación asociada expansión de las piscinas frente al citoplasma de los lípidos. Por tanto HRLM TEM y análisis, la identificación de los lípidos vacuola contacto con, o por medio de la infiltración, la envoltura nuclear se puso de manifiesto en las células que exhiben TUNEL-etiquetados lipoapoptosis. Progresivamente, las migraciones de los lípidos acumulados como los lípidos de baja densidad en las piscinas vacuola perinuclear espacio, pero emigraron progresivamente en contacto con el exterior envoltura nuclear y extranuclear citoplásmica ampliado el espacio. Posterior aislamiento de los núcleos céntricos de la infiltración de lípidos en el espacio perinuclear (Figuras 3, 4] fue acompañada de la inducción de la envoltura nuclear prominente pycnotic convolutions que fueron asociados con la migración de lípidos vacuola en contacto con, o por medio de la lámina externa nuclear. La migración translaminal intranuclear de lípidos y de las deposiciones (Figura 6] se produjeron en la asociación coincidente con TUNEL al índice de fragmentación del ADN. Estas observaciones sugieren que el hypercytolipidemic promueve una condición metabólica inducida por lípidos disolución química o perturbación [26] intrínsecos de ADN nuclear (cromatina) organización, la alteración del metabolismo normal (transcripcional) cascada de respuestas de los que se activan en respuesta a la hipercalórica microambiente [14, 15 ]. El consiguiente aislamiento nucleares, químicas y estructurales de la interrupción colectiva promover la disolución subsiguiente apoptosis, autolíticas desaparición de la organización celular y viabilidad estructural [15], lo que resulta en cytoatrophy prematuro dentro de los tejidos afectados. Había tomado nota de la eficacia terapéutica de los diversos agentes lipolítica [26 - 28] hacia la restauración y el mantenimiento de tracto reproductivo cytoarchitecture en hypogonadal genotipo mutantes apoya la idea de que lipoapoptosis, lo que representa una lipometabolic perturbación de los afectados dentro de cytointegrity db / db células, efectivamente compromete la eficiencia reproductiva En modelos experimentales o de los seres humanos que sufren de Tipo 2 (DMNID), la diabetes y la obesidad-relacionadas, hiperlipidémicos metabólicas (X), inducida por el síndrome, disfunción reproductiva [24].

En resumen, los resultados de los estudios actuales son los primeros cito-químicos y ultraestructurales pruebas de que la perturbación de apoptosis EE capas de tejido en la diabetes (db / db) C57BL/KsJ ratones mutantes se produce coincidiendo con la infiltración de los lípidos nucleares y de la fragmentación del ADN, que los acontecimientos Están vinculados a la hipercalórica metabólicos resultantes de la progresiva cytolipidemia dentro de los compartimentos del tracto reproductivo femenino [2, 12]. La gravedad de la apoptosis inducida por cytolipidemia era estructuralmente asociados a la co-localización de los lípidos se infiltra en el compartimento nuclear de las células afectadas. Trans-nuclear lípidos migración fue progresiva, que emigran de una ampliación perinuclear lugar, a través de la membrana nuclear externa contactos, y en última instancia de difusión transmembrana, en la nucleoplasm (Figura 6]. La gradual, progresiva acumulación de depósitos de lípidos núcleo-eventualmente interrumpido la cromatina y el patrón de distribución, como lo demuestra la etiqueta TUNEL-3'-la fragmentación del ADN. La progresiva disolución de lipoapoptotic nuclear continuidad, y la consiguiente separación de los compartimentos orgánulo citoplásmico, promovido pronunciada EE cytoatrophy y la involución uterina. La hiperlipidemia inducida, de la degradación intracelular de apoptosis integridad estructural y cascadas de señales metabólicas homeostático [15] en peligro la reproducción de competencias, en representación de eventos celulares común [5, 26], y comparte la fertilidad complicaciones [28], experimentadas por los seres humanos y los modelos experimentales y expresión de la obesidad Tipo II (DMNID) diabetes síndromes metabólicos.

Agradecimientos

El autor desea expresar su sincero reconocimiento por la excelente técnica y experimental de la asistencia prestada por el doctor Bryan L. Garris, y el histoquímicas y fotográfica apoyo prestado por el Dr Lesya Novikova, Jessica Kueker y Matthew J. Garris, durante diversas fases de estos Estudios.