Antígenos mieloides en la infancia leucemia linfoblástica: los datos clínicos apuntan a la regulación de CD66c distintos de otros antígenos mieloides

Aunque la expresión de marcadores de superficie en la leucemia linfoblástica aguda (ALL) es paralela al normal de precursores hematopoyéticos, varios marcadores de linaje mieloide se encuentran en TODOS los linfoblastos. Este fenómeno se conoce como "aberrante expresión". La cuestión de los mecanismos de regulación que permiten que se ha dirigido en repetidas ocasiones a lo largo del los últimos 40 años [1, 2]. Aunque varias hipótesis posible, ya sea haciendo hincapié en la indecisión o linaje genético misprogramming se han planteado, el fenómeno todavía no se comprenden totalmente. Nosotros y otros han demostrado que el antígeno mieloide CD66c es muy frecuente aberrantly expresado en B-precursor ALL, sin embargo, un gran estudio que muestra su frecuencia a la luz de otros antígenos mieloides ha faltado. CD66c expresión se encuentra en los casos de niños y adultos en TODOS fuerte correlación con cambios genéticos no aleatoria (BCR / ABL positividad [3], y hiperdiploidías TEL/AML1 negatividad [4], revisado en [5]].

CD66c (CEACAM6, anteriormente llamado inespecíficos cruz de reacción antígeno, la autoridad nacional de competencia y 90/50 KOR-SA3544 antígeno) es un miembro de la familia antígeno carcinoembrionario. Esta gran molécula glicosilada consta de dos constantes Ig-como los dominios y una variable Ig-como dominio y es anclado a la membrana a través de su glycosylphosphatidylinositol (GPI). Dentro del sistema hematopoyético, CD66c expresión se limita a los granulocitos y sus precursores [3, 6], en la que sirve y homotipica heterotypic adhesión [7], de señalización mediada por Ca2 + [8] y es marcadamente upregulated intracelular de las tiendas después de la activación [9].

También se encuentran en epitelios de los diversos órganos [7]. Upregulation de CD66c es un evento temprano molecular en la transformación que conduzca a los tumores de colon [10]. También se confirmó para inhibir anoikis (apoptosis inducida en la respuesta de las células normales por insuficiente o inadecuada adherencia al sustrato) en el modelo in vitro de carcinoma de colon [11] y específicos silenciamiento de este gen dado lugar a una disminución en el potencial metastásico de adenocarcinoma pancreático [12 ].

Sorprendentemente, Sugita et al [13] informó de la presencia intracelular de CD66c en todas las líneas de células leucémicas examinados, independientemente de la presencia o ausencia de superficie, con una distribución diferente de antígeno en el citoplasma que determina la superficie de expresión. Se especuló que la presencia de un transportista que no divulgada objetivo de esta molécula gránulos y expresión de la superficie, mientras que la superficie CD66c ^neg líneas celulares de esta falta de transporte. Este intrigante hipótesis nos llevó a probar si CEACAM6 transcripción de los genes y / o intracelulares CD66c expresión es siempre seguido de la superficie de expresión.

Singularidad de la expresión aberrante de CD66c en malignos lymphoblast se explota para el diagnóstico de TODOS y el seguimiento de una enfermedad mínima residual (EMR) mediante citometría de flujo [14, 15]. Para utilizar un marcador para un MRD evaluación crítica cuestión debe abordarse, si la expresión aberrante es una propiedad estable del clon maligno o si puede ser objeto de cambio inmunofenotipo.

En el presente estudio se establecen para hacer frente a la frecuencia de CD66c molécula de expresión en la infancia TODOS, CD66c la regulación de la expresión de genes de transcripción y de superficie citoplásmica de expresión, y seguimos inmunofenotipo estabilidad desde el diagnóstico hasta la recaída. Asimismo, discutir la pertinencia de CD66c pronóstico de la predicción.

La cohorte de todos los niños Checa (<18 años) con diagnóstico de B-precursor ALL investigado en nuestro laboratorio de referencia de 1.5.1997 a 23.7.2004 se utiliza para la actual estudio (n = 381). El consentimiento informado se obtuvo de los pacientes y / o sus tutores. La presencia de TEL/AML1, BCR / ABL y MLL/AF4 fusión de los genes se ha detectado en dos vueltas nested PCR, hiperdiploidías se evaluó mediante citometría de flujo de ADN índice de medición, tal como se describe anteriormente [4]. De los pacientes de genotipo y de la correspondiente superficie CD66c expresión se muestra en la Figura 1 (genotipo disponible en el 98% de los pacientes). Para la tinción intracelular y FACS clasificación, sólo muestras con suficiente material fueron seleccionados.

Superficie CD66c negativo líneas de células con translocación típicos encontrados en la infancia TODOS: TEL/AML1pos (REH) fue amablemente facilitada por R. Pieters (Hospital de la Universidad de Rotterdam), MLL/AF4pos (RS4, 11) y translocación sin fusión (NALM-6) Se obtuvieron a partir de célula alemana en la línea de recogida (DSMZ, Braunschweig, Alemania)

Immunophenotyping citometría de flujo de médula ósea (MO) aspirados se realizó en en el momento del diagnóstico y en la recaída. Inmunofenotípicos rutina de clasificación utilizando panel de anticuerpos monoclonales (moAbs) se realizó como se describió anteriormente [4]. En pocas palabras, BM muestras fueron teñidas con 2 - 3, - 4 colores y combinaciones de moAbs durante 15 minutos en la oscuridad, los eritrocitos fueron lisadas con NH ₄ Cl-lisis que contiene la solución durante 15 min, se lavan y los datos fueron adquiridos utilizando único instrumento FACS Calibur A lo largo del estudio (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) el flujo cytometer. Anti-CD66c (CEACAM6) moAb utilizarse en todos los diagnósticos y mediciones de la recaída en este estudio fue clonar KOR-SA3544 etiquetados directamente a FITC (Immunotech, Marseille, Francia). Intracelular se realizó mediante tinción Fix & Perm kit (Caltag, Burlingame, CA, EE.UU.), según protocolo del fabricante. Adquirida datos fueron analizados con Cell Quest (BD Biosciences) o de flujo Jo (Árbol Star, Ashland, OR, EE.UU.), software, lymphoblast puerta se preparó sobre la base de óptica de dispersión y CD19 ^pos explosión de población fue seleccionada para un nuevo análisis.

Valor del 20% fue elegido como un umbral de la positividad de lo recomendado por EGIL [16]. Por robusto importancia pronóstica de ensayo, de otros valores umbral también fueron probados como se indica en los resultados.

Muestras de la médula ósea CD66c positivo explosiones fueron teñidas con anti-CD66c moAb clon 9A6 (Genovac, Freiburg, Alemania) moAb durante 15 min, eritrocitos fueron lisadas con NH ₄ Cl-lisis que contiene la solución durante 15 minutos, se lava y se muestra se incubaron con anti - CD66c moAb KOR-SA3544 PE moAb conjugado.

Las muestras que contengan 5 × 10 ⁶ células fueron lisadas por 30 min a 4 ° C en 100 μ l de buffer de lisis que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 8,2), 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 10 mM EDTA, 10 mM pirofosfato (Na ₄ P ₂ O ₇₎ y Complete Mini-EDTA Libre (inhibidor de la proteasa cóctel comprimidos, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Desechos se sedimented por centrifugación durante 3 min a 13000 rpm, de 0 º C. Se mezclaron con 100 μ l de 2 × Laemmli SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) muestra la carga de amortiguación, y se calienta durante 5 min a 100 ° C. Las proteínas fueron fraccionados por SDS-PAGE en el 12,5% geles de electroforesis y transferido a membranas PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Membranas fueron bloqueadas durante 1 h en PBS (pH 7.4) que contiene 0,5% de Tween-20 y 5% nonfat la leche en polvo. Blots fueron incubadas durante 1 h a temperatura ambiente con anti-KOR-SA3544 (Immunotech, Marseille, Francia) o anti-beta-actina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.) y, a continuación, moAbs desarrollado utilizando cabra anti-ratón IgG (H + L)-HRP conjugate (Bio-Rad). Inmunorreactivas material fue puesto de manifiesto por un aumento de quimioluminiscencia (ECL, Amersham, Buckinghamshire Little Chalfont, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

RQ-PCR para el análisis, FACS leucémica explosiones fueron ordenados utilizando la opción de clasificación sobre FACS Calibur o instrumento sobre FACS Aria (1,1 × 10 ⁴ - 4,7 × 10 ⁵ células de un paciente). Aislamiento de ARN de las células FACS-ordenados se realizó a través de reactivo Trizol (Gibco BRL, Carlsbad, CA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante [17]. Complementarias de ADN se prepara usando M-MLV transcriptasa reversa (Gibco), de acuerdo a instrucciones del fabricante. Glucógeno (Gibco) 250 μ g / ml se añadió al número inicial de la célula fue inferior a 10 ^5. Calidad de cDNA se verificó por PCR sobre los beta-2-microglobulina (B2M) limpieza de genes.

RQ-PCR se realizó en el LightCycler ™ rápida termociclador sistema (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando SYBR intercalante tinte verde. CEACAM6 primers específicos CGCCTTTGTACCAGCTGTAA y 3'-5'-GCATGTCCCCTGGAAGGA diseñado por Baranov [18] se utilizaron para CEACAM6 amplificación y B2M primers específicos 3'-GATGCTGCTTACATGTCTCG 5'-CCAGCAGAGAATGGAAAGTC [19] se utiliza para la cuantificación total de cDNA.

Mediante amplificación por PCR se realizó en 1 × reacción de amortiguación (20 mmol / L Tris-HCl, pH 8,4, 50 mmol / L KCl), y 2,0 mmol MgCl ₂ que contiene 200 μ mol / l de cada dNTP, 0,2 μ mol / L de cada cebador , 5 μ g de albúmina sérica bovina por reacción, y 1 U de Taq ADN polimerasa Platinum (todos de Gibco) en un volumen final de reacción de 20 μ L. Para cada reacción de PCR, 2 μ l de cDNA plantilla y 2 μ l de SYBR Green 5 × 10 ^-4 (FMC BioProducts, Rockland, MA, EE.UU.) se incluyó tinte fluorescente. El ciclismo condiciones fueron de 2,0 minutos a 95 ° C, seguidos por 45 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 5 segundos, recocido a 59 ° C durante 30 segundos, y la extensión a 72 ° C durante 15 segundos. CEACAM6 y B2M gen se amplifica por separado de la misma cDNA, y todos los experimentos se realizaron por duplicado. Análisis de la curva de fusión se realizó después de cada plazo, en caso de pico de temperatura de fusión cambio, los productos de PCR se verificó en la electroforesis en gel de agarosa.

Amplificación y curvas de calibración se han generado mediante el uso de software de afiliados (LightCycler 3-software de análisis de datos; versión 3.5.28; Idaho Technology Inc, Salt Lake City, UT, EE.UU.). Una curva de calibración para el B2M y CEACAM6 limpieza gen fue generado mediante la serie de 10 × cDNA diluido granulocitos de sangre periférica como un estándar para las dos reacciones. Punto de cruce (Cp) valor se calculó con el uso de software 3 LightCycler segunda derivada máxima método. CEACAM6n valor es relativo y representa una proporción de CEACAM6 a B2M (CEACAM6n = CEACAM6 / B2M). Norma cDNA de granulocitos CEACAM6n se le asignó el valor de 1, la misma alícuota de granulocitos cDNA se utilizó a lo largo del estudio.

Evaluación estadística se realizó con el software Statview, (SAS Institute Inc, NC, EE.UU.). Se utilizó la prueba exacta de Fisher, coeficiente de regresión, la prueba de Mann-Whitney y Logrank (Mantel-Cox) las pruebas contempladas en el texto.

Hemos seleccionado 365 muestras obtenidas del paciente en el momento del diagnóstico de B-precursor TODOS los que se dispone de información sobre la expresión de MyAg CD13, CD15, CD33, CD65 y CD66c. Subcohort Esto representa el 96% de todos los B-precursor ALL diagnosticados en el período de estudio. La molécula CD66c se expresó en 43% de los casos (Tabla 1, los casos con> 20% fueron consideradas positivas blastos positivos). Para la fracción de las células y la correlación positiva con el genotipo ver [5], de la nota, el 29% de los pacientes expresó CD66c en más de 50% blastos. Comparación con otros MyAg mostró CD66c que se expresó con más frecuencia. Coexpression de CD66c con otros MyAg no es un hallazgo habitual (Cuadro 1, Gráfico 2]. La expresión de CD13, CD33 y CD65 tienden a ser no aleatorios (mutuamente excluyentes) con CD66c (Tabla 1]. Coexpression de CD66c con cualquier 2 de la otra MyAg se encontró en menos de 4 casos en cada combinación. Curiosamente, la relación mutua de otros MyAg fue aleatorio, con la excepción de CD13 y CD33 coexpression (p <0,0001) y CD15 y CD65 coexpression (p = 0,0002). El análisis se realizó también en diferentes valores de corte (10, 30 y 50%; datos no presentados). Lo mismo o menos correlaciones significativas, también se observaron en diferentes valores de corte.

El clon moAb KOR-SA3544 no se incluyó en la diferenciación Antígenos Leucocitos Humanos taller, pero se caracterizó por Sugita et al [13]. Para evitar la ambigüedad de interpretación de datos se amplió la caracterización de KOR-SA3544 clon de CD66c moAb mediante el bloqueo de los experimentos realizados en ^pos CD66c explosiones. Pretratamiento de las células con el taller-mecanografiados clon 9A6 moAb completamente bloqueado vinculante de KOR-SA3544 clon 9 leucémica en todos los especímenes y en granulocitos (datos no presentados).

Hemos estudiado la superficie y citoplásmica expresión de CD66c TODOS diagnóstico en 20 muestras por citometría de flujo. En contraste con los resultados de Sugita et al [13], hemos detectado CD66c exclusivamente en los 8 casos positivos de superficie. Ninguno de los 12 casos negativos superficie manchada en el citoplasma (Figura 3]. La causa probable de lo contrario, en varios casos, la búsqueda de (menor porcentaje después de permeabilización que en la superficie) es un fondo superior después de permeabilización (isotypic control de la intensidad de fluorescencia media fue de 4,3 ± 2,0 y 9,7 ± 3,7 para las aguas superficiales y permeabilized tinción, respectivamente), que abarca Límite de los acontecimientos.

Para ampliar las conclusiones anteriores, la hemos utilizado en tiempo real cuantitativos Transcripción Reversa-PCR (RQ-RT-PCR) para evaluar cuantitativamente la presencia de determinados CEACAM6 ARNm. Estamos ^FACS-pos CD66c ordenados CD19 o CD19 ^{neg pos pos} CD66c explosión de las células RQ-RT-PCR análisis. No hemos encontrado gran cantidad de CEACAM6 transcripción en la superficie CD66c ^neg linfoblastos, mientras que las células CD66c ^pos figura CEACAM6. Cuando CD66c positivo y ^neg fracción se FACS-ordenados heterogéneo de los especímenes (linfoblastos en parte positivo para CD66c) el nivel de CEACAM6 se observó mayor en CD66c ^neg células CD66c y menor en ^pos de células en comparación con el uniforme de las poblaciones (Figura 4]. En una muestra (todos los pacientes con síndrome de Down), CEACAM6 no fue mayor en ^pos CD66c fracción.

Además, la cuestión intracelular CD66c positividad en la superficie CD66c negativo líneas celulares. Se realizó el Western blot como se describe por Sugita et al. [13] sobre REH (TEL/AML1 ^pos) y RS4, 11 (MLL/AF4 ^pos) líneas celulares y no encontró CD66c proteína (Figura 5]. Además encontramos NALM-6 (superficie CD66c ^neg, no translocación) línea celular negativo. Dos BCR / ABL y cuatro hyperdiploid (todos superficie CD66c ^pos) muestras de diagnóstico utilizados como controles positivos fueron positivos, de manera similar con la banda estrecha a banda ancha en contraste detectado en granulocitos (Figura 5], lo que sugiere diferentes glicosilación de acuerdo con informe de Sugita.

Todos los pacientes que recayeron hasta 12/2003 con la información disponible sobre CD66c expresión en el diagnóstico y en las recaídas se utilizan para evaluar la estabilidad de CD66c expresión. Comparación de CD66c expresión en 39 casos de recaída infancia TODOS los casos a su inmunofenotipo en el momento del diagnóstico revelaron que tanto la negatividad y la positividad de este antígeno se mantuvo desde el diagnóstico hasta la recaída (Figura 6; mediana del tiempo hasta la recaída 2.5y min 0.3y, max 5.3y) . Aunque los niveles cuantitativos de CD66c expresión difiere en algunos pacientes (mediana de diferencia de 0,0%, la desviación estándar del 21%), no caso de CD66c completa pérdida o ganancia se encontró en nuestra cohorte.

Sólo B-precursor ALL pacientes tratados en el mismo ALL BFM 95 protocolo de tratamiento [20] (n = 254) fueron evaluados para el pronóstico del impacto. El pronóstico no difiere de los casos con cualquiera de las dos explosiones CD66c ^pos ya sea superior a 20% (Figura 7] o cualquier otro valor de corte a prueba (5%, 10% y 50%, datos no presentados).

A continuación, pregunta si CD66c correlacionada con la expresión de los factores de riesgo utilizados en TODOS protocolo BFM-95 para la estratificación en los grupos de riesgo [21]. No hay diferencia en la supervivencia libre de recaída (RFS) se observó cuando analizaron por separado para cada grupo de riesgo más alto o más bajo y leucocitosis inicial (valor de corte: 2 × 10 ⁴ células por ml), grupo de edad o de respuesta a la prednisona (grupos como en la Tabla 2] .

Cuando se analizan con respecto a un genotipo, que no encontró valor pronóstico de CD66c en cualquier grupo definido (BCR / ABL ^{pos, pos} TEL/AML1, hyperdiploid TODAS, y ninguno de los mencionados cambios genéticos, la Figura 7 y Tabla 2]. En contraste con el estudio de Hanenberg et al [22], no hay ninguna correlación entre la inicial y la leucocitosis CD66c en nuestra cohorte (Tabla 2].

Nuestros datos sobre la infancia B-precursor ALL CD66c muestran que se expresaron con mayor frecuencia que la mieloide antígenos incluidos en la norma immunophenotyping paneles para TODOS. A nuestro entender, CD66c es la más frecuente en la infancia marcador mieloide TODOS. Esto, junto con la estrecha correlación entre el genotipo y CD66c [5], hace CD66c pertinente objeto de la investigación sobre la regulación de expresión aberrante.

De acuerdo con los datos de Sugita, confirmamos la especificidad de KOR-SA3544 clon moAb para CD66c por CEACAM6 detección de mRNA y por el bloqueo de la cruz-KOR-SA3544 vinculante por el representante clon 9A6, que sugiere una proximidad espacial de los dos epítopos reconocidos. Además se muestra que todos los CD66c ^pos TODOS especímenes muestran un grado similar de glicosilación como líneas de células analizadas por Sugita, que se diferencia de la medida de glicosilación en granulocitos.

Dado que existe una fuerte correlación genotipo de TODOS y CD66c expresión, que la hipótesis de que la superficie CD66c expresión sería controlada por la transcripción de genes en lugar de la orientación a la superficie intracelular de las tiendas a lo propuesto por Sugita [13]. De acuerdo con esto, tanto la tinción intracelular y Western blot no identificar proteínas citoplasmáticas CD66c en cualquier superficie de las células CD66c ^neg. Abajo la misma línea, no CEACAM6 transcripción se detectó en la superficie CD66c ^neg linfoblastos. En general nuestros datos sugieren que la transcripción es el puesto de control que lleva a la superficie de expresión, en lugar de la ex modelo, que propone que todos los linfoblastos malignos CD66c generar la molécula, pero sólo a algunos de ellos para que meta la membrana celular.

Curiosamente, la importancia de esta molécula fue demostrado en un modelo de carcinoma colorrectal donde transfección con CEACAM6 inhibido anoikis (10), de alta CEACAM6 predicho los pacientes de alto riesgo con cáncer colorrectal resecable (9) y CEACAM6 silenciamiento génico anoikis disminución de la resistencia a la in vitro conduce a la inhibición De la capacidad metastásica en modelo murino (11). Aunque la función de CEACAM6 en TODOS los blastos aún se desconoce, la función de esta molécula ha sido recientemente asociado con la patogénesis de otros tipos de cáncer en el hombre [10 - 12, 23, 24]. Estudio de la lucha contra la CEACAM6 immunotoxin terapia basada en el modelo de ratón de carcinoma de páncreas se publicó recientemente [25].

Hasta el momento, la importancia pronóstica de la expresión de antígenos mieloides CD13, CD14, CD33, CD65w, CD11b y CD15 ha sido estudiado con resultados (que se resumen en [26]]. Como se determinó en nuestra gran cohorte de pacientes tratados en ALL BFM 95 de protocolo, ninguna importancia pronóstica de CD66c podría ser revelado, en general, ni tampoco cuando se analizaron por separado los grupos de riesgo o TEL/AML1 ^pos, BCR / ABL ^pos, y otros hyperdiploid B-precursor TODOS los casos por separado. Además, la inestabilidad de la expresión aberrante se informó en la mayoría de los marcadores mieloides (CD13, CD14, CD15, CD33 y CD65).

Estabilidad de expresión es una de las principales preocupaciones de los estudios de citometría de flujo MRD. En la actualidad, el uso de múltiples marcadores CD es ampliamente recomendado para evitar MRD subestimación debido a la inmunofenotipo turno (discutido en [15, 27]]. En el presente estudio se muestra por primera vez que CD66c expresión cualitativamente permanece estable desde el diagnóstico hasta la recaída en todos los casos que estudió. Este hallazgo, junto con la alta frecuencia de CD66c ^pos casos, apoya la inclusión de CD66c en un moAbs paneles para la detección en los pacientes MRD positivo para este CD marcador en el momento del diagnóstico. Sin embargo, anecdótica downregulation de CD66c expresión durante la quimioterapia se ha observado [15], pero no ha sido metódicamente estudiado aún. Cualquier temporal downregulation en falso podría llevar a valores más bajos de la medición MRD - por lo tanto, sería conveniente saber si este fenómeno se produce regularmente en ciertos puntos de la quimioterapia.

Mutual MyAg expresión de la exclusión, así como la estabilidad de diferentes CD66c en comparación con otros MyAgs [28] desafíos de la práctica de la evaluación de los pronósticos MyAg ^pos TODOS los casos, como grupo, [26] y favorece la evaluación de la contribución individual / regulación de cada MyAg de explosión Celular.

CD66c presenta algunas de las asociaciones más reducido con TODOS genotipo. Aunque nuestros hallazgos indican que es poco probable que CD66c tener una importancia práctica como un predictor pronóstico, hay varias razones para centrarse en ella en los estudios de diagnóstico y MRD. CD66c, al parecer la más aberrante de antígenos expresados en la infancia TODOS, es muy útil para discriminar explosiones leucémicas de la falta de células malignas. Aberrante expresión sigue siendo un fenómeno desconcertante que ser objeto de nuevas investigaciones. Si es confirmado por lo suficientemente sensible que las técnicas de los llamados "marcadores aberrantes" son verdaderamente no expresó en ningún sutil población linfoide de precursores, habrá una oportunidad para encontrar nuevos objetivos de la terapia específica TODOS (por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra la diferente forma glicosilada De CD66c) que evitará a los precursores no leucémicas, lo que reduce la toxicidad del tratamiento.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

CT realizó citometría de flujo, la clasificación de células, RQ-RT-PCR y el estudio redactado el manuscrito, MV llevó a cabo el estudio de Western blot, EM adquiridos y analizados los pacientes citometría de flujo de datos y realizó el análisis estadístico, JM diseñado y asistencia para el RQ-RT - PCR estudio, JT diseñado RT-PCR, que el genotipo de detección y discutido críticamente el manuscrito, JS contribuido a la organización y el diseño del estudio y OH concebido del estudio, analizó los datos y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Http://www.biomedcentral.com/1471-2407/5/38/prepub