Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 10-10 (más artículos en esta revista)

Terapia anti-inflamatoria por ibudilast, un inhibidor de la fosfodiesterasa, en la desmielinización de twitcher, un modelo de desmielinización genéticos

BioMed Central
Kuriko Kagitani-Shimono (kuriko-shimono@sutv.zaq.ne.jp) [1], Ikuko Mohri (IkukoMohri@aol.com) [1], Yasushi Fujitani (Fujitani_Yasushi@takeda.co.jp) [2], Kinuko Suzuki (kis@med.unc.edu) [3], Keiichi Ozono (keioz@ped.med.osaka-u.ac.jp) [1], Yoshihiro Urade (uradey@obi.or.jp) [2], Masako Taniike (masako@ped.med.osaka-u.ac.jp) [1]
[1] Departamento de Desarrollo de la Medicina (Pediatría), Osaka University Graduate School of Medicine, 2-2 Yamadaoka, Suita, Osaka 565-0871, Japón
[2] Departamento de Biología Molecular del Comportamiento, Osaka Bioscience Institute, 6-2-4, Furuedai, Suita, Osaka, 565-0874, Japón
[3] Departamento de Patología y Laboratorio de Medicina de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, 919 Brinkhous-Bullitt Bldg, CB7525 Chapel Hill, NC, 27599-7525, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Twitcher ratón (twi / twi) es un auténtico modelo murino de la enfermedad de Krabbe. La acumulación de psychosine, lo que resulta en la apoptosis de los oligodendrocitos y desmielinización posterior, es un evento cardinal a la patogénesis de esta enfermedad. Además, el reclutamiento de células inflamatorias juega un papel importante en el proceso patológico en el twi / twi sistema nervioso central y periférico. En este estudio, se determinó la 1) la relación entre el factor de necrosis tumoral-α (TNF α), de citoquinas pro-inflamatorias, y la progresión de esta enfermedad, y 2) el efecto de la terapia anti-inflamatoria por ibudilast, un inhibidor de la fosfodiesterasa.

Métodos

Hemos cuantificado el nivel de expresión de TNF-α y TNF receptor mRNA en twi / twi semi-cuantitativo mediante RT-PCR. La relación entre la expresión de TNF α, la apoptosis de los oligodendrocitos y desmielinización se estudió con inmunohistoquímica y método TUNEL. Luego tratados twi / twi con una inyección diaria de ibudilast (10 mg / kg), que suprimen la producción de TNF α en el cerebro.

Resultados

Se encontró que el TNF-α inmunorreactivas microglia / macrófagos apareció en el twi / twi cerebro y que los niveles de ARNm de TNF-α y TNF receptor 1 se incrementó con la progresión de la desmielinización. El perfil de distribución de TNF-α inmunorreactivas microglia / macrófagos que se superponen de TUNEL-positivas oligodendrocitos en el twi / twi cerebro. Cuando twi / twi fue tratado con ibudilast de PND30, el número de oligodendrocitos en apoptosis fue reducido y desmielinización es más suave. Evidente mejoría de los síntomas clínicos se observó en dos de cinco. El fracaso de constante mejoría clínica por ibudilast puede ser el resultado de hepatotoxicidad y / o la inhibición de la proliferación de NG2-positivas oligodendrocyte precursores.

Conclusión

Se concluye que la terapia anti-inflamatoria por un inhibidor de la fosfodiesterasa puede considerarse como una nueva alternativa para el tratamiento de la enfermedad de Krabbe.

Antecedentes

El twitcher ratón (C57BL/6J- GALC twi; twi / twi) es un modelo humano de células globosas leucodistrofia (la enfermedad de Krabbe), un trastorno hereditario causado por la deficiencia de la enzima lisosomal galactosylceramidase [1 - 3]. Twi / twi muestra Los síntomas de disfunción cerebelosa como acción temblor y ataxia alrededor postnatal día (PND) 25, la progresiva pérdida de peso después de PND 35, y craneal y parálisis del nervio periférico, y llevarían a la muerte PND alrededor de 45 [4, 5]. Evidente desmielinización PND se reconoce después de 30 en el sistema nervioso central (SNC). Cliniconeuropathological similitudes de este modelo de la enfermedad humana y hacer de este modelo murino de utilidad para la investigación de la patogénesis, así como de enfoques terapéuticos [6]. La fisiología patológica de twi / twi comparte muchas características comunes con el de la esclerosis múltiple (EM), una enfermedad desmielinizante autoinmune, en particular la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), moléculas en el SNC [7 - 9], la activación de la microglia residentes, Contratación de la sangre, los macrófagos [10], y la fuerte expresión de citoquinas pro-inflamatorias, como el TNF α y la interleucina (IL) -6 en el desmielinizante centrarse [10, 11]. Por lo tanto, este modelo murino es útil para la investigación de la pathomechanism de desmielinización y la elaboración de enfoques terapéuticos para la neuroinflammation en general.

Estamos anteriormente mostró que de la desmielinización twi / twi está fuertemente asociada a la apoptosis de los oligodendrocitos (OLs) [12]. TNF α es el más potente inductor de la apoptosis de OLs entre muchos citoquinas in vitro [13]. Además, en twi / twi cerebros, TNF α se informó de que se incremente en desmielinizante regiones [11] y la expresión de TNF α y otros relacionados con las moléculas inmunes se redujeron regulado en el patológicamente mejorado regiones [10].

Inhibidores de la fosfodiesterasa incremento intracelular de AMPc y reducir los niveles de citoquinas inflamatorias, como el TNF α in vitro [14]. Ibudilast, no selectivo inhibidor de la fosfodiesterasa, se informó a reducir la desmielinización en la encefalomielitis alérgica experimental (EAE), y para suprimir la producción de TNF α microglia in vitro [15, 16].

En este estudio se encontró que 1) la expresión de TNF α y de su receptor TNF-R1 se asoció con desmielinización, y que 2) ibudilast desmielinización podrían reducir y mitigar la progresión de la enfermedad y reprimir la producción de TNF α en twitcher cerebro. Estos resultados fueron consistentes con la hipótesis de que el TNF α aumenta la señalización de la apoptosis y OLs desmielinización en twi / twi, y sugirió que la supresión de la inflamación pueden proporcionar nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades desmielinizantes.

Métodos
Animales

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a las Directrices para la Protección de los animales de experimentación expedido por el Gobierno del Japón, los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud, y la Sociedad para la Neurociencia. Heterocigotos obtentor pares de twitcher (twi / +) fueron inicialmente adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Twi / twi y emparejados por edad normal de los hermanos (+ / +) fueron identificados por genotipo con el ADN genómico extraído de la cola cortada por Uso de un aislamiento de ADN Kit Puregene (Gentra Systems, Minneapolis, MN). La genotipificación se realizó como en el informe anterior [17].

Materiales

Los siguientes anticuerpos primarios utilizados fueron: ficoeritrina (PE) conjugadas anti-TNF-α (1:50; PharMingen, San Diego, CA), mouse monoclonal anti-proteína básica de la mielina (MBP) de anticuerpos (1:200; Sternberger Monoclonals Incorporated, Lutherville , MA), de conejo policlonal anti-rat-pi-forma de glutatión-S-transferasa (GST-pi) de anticuerpos (1:1000; MBL, de Nagoya, Japón), de conejo policlonal anti-vaca proteína ácida glial fibrilar (GFAP) de anticuerpos (Prediluted; DAKO, Glostrup, Dinamarca), biotina Ricinus communis-crioaglutininas-1 (RCA-1) (50 μ g / ml; Vector Laboratories, Burlingame, CA), y el conejo policlonal NG2 chondroitin sulfato proteoglicanos (NG2) de anticuerpos (1: 200; Chemicon International Inc, Temecula, CA). Biotina Ricinus communis-crioaglutininas-1 (RCA-1) (50 μ g / ml) se adquirió de Vector Laboratories (Burlingane, CA).

Preparación de tejidos

Brains de twi / twi y + / + ratones mueren en el PND 20, 30, y 40 (n = 3 para cada período de calendario) se immunostained de TNF α. Los animales fueron perfundidos con solución salina fisiológica fría profunda bajo anestesia inhalatoria con sevoflurano, y los aislados fueron rápidamente cerebros congelados en nitrógeno líquido. Para la tinción histoquímicas de rutina, los ratones (n = 3 para cada uno de los grupos) fueron perfundidos con solución salina fisiológica, seguida de paraformaldehído al 4% en buffer fosfato 0,1 M (PB, pH 7.4). El cerebro se ha retirado, y postfixed incrustados en bloques de parafina. Luxol rápido azul (LFB)-ácido periódico de Schiff (PAS), la tinción se realizó en la parafina de las secciones twi / twi y + / + en el PND 40 para la evaluación de la neuropatología.

Para la determinación de los niveles de mRNA, grupos de twi / twi y + / + (n = 3 fechas cada período) fueron asesinados en el PND 20, 30, y 40 bajo anestesia adecuadas. Los cerebros fueron removidos, dividido en el cerebro y cerebelo y tronco cerebral, y rápidamente congelados en nitrógeno líquido.

La inmunocitoquímica

Congelados secciones se fija a 4 ° C en acetona y se incubaron con PE-rata conjugado anti-TNF α anticuerpos de ratón durante 48 h. Por doble etiquetado con el sello RCA-1 y anti TNF-α, TNF-α secciones fueron teñidas con biotina reaccionó con RCA-1 durante 30 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, con avidina-D-isómero isotiocianato de fluoresceína (avidina-FITC; Vector Laboratories), diluido 1:1000 con PBS, durante 30 min. Por NG2 inmunoticción, después de bloquear con 0,3% Triton-X100 de 1 h, congelados secciones fueron incubadas con anticuerpos anti-NG2 de 12 h a 4 ° C, y se incubaron con Alexa 488-conjugadas anti-conejo IgG (H + L) ( 1:400; Molecular Probes, Inc, Eugene, OR) para 2 h.

Parafina secciones se utilizaron para inmunomarcación en la PAM y pi-GST, y terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) mediada dUTP nick fines de etiquetado (TUNEL). Por inmunocitoquímica, secciones sobre diapositivas de cristal fueron incubadas en serie con el ratón anti-MBP o conejo anti-pi-GST anticuerpos, biotina cabra anti-ratón o anti-inmunoglobulinas de conejo (Vector Laboratories), y el complejo avidina-biotina utilizando un kit de élite ABC (ABC; Vector Laboratories). Immunoreactions se visualizaron sumergiendo las diapositivas en un 0,03% de H 2 O 2 en solución 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) que contenga 0,05% diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) y el 0,25% de níquel sulfato de amonio. Twi / twi y + / + en PND 40 fueron sometidos a la tinción de TUNEL. Los núcleos con la fragmentación del ADN se detectó mediante el uso de un kit de detección de la apoptosis situ (Takara Biomedicals, Osaka, Japón). En pocas palabras, después de tratamiento previo con 0,1% tripsina durante 15 min a 37 ° C, las secciones se reaccionó con TdT, dNTPs, y FITC-dUTP marcado por 90 min a 37 ° C, seguida de la peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado de anticuerpos anti-FITC La noche a 4 ° C. El immunoproduct se visualiza con el mismo protocolo descrito anteriormente.

Para identificar el tipo de células TUNEL-positivos, que combinados para la tinción pi-GST, GFAP y RCA-1 en el procedimiento TUNEL. TUNEL Después de la tinción, las secciones fueron incubadas con PBS que contenía 0,3% TritonX-100 y 10% de suero normal de cabra durante 30 min y luego con conejo anti-pi rata GST anticuerpos, de conejo anti-GFAP vaca de anticuerpos con biotina o RCA-1 a 4 ° C Noche a la mañana. El procedimiento era básicamente el mismo que se ha descrito anteriormente, salvo para el uso de ABC-fosfatasa alcalina y naftol AS-BI fosfato junto con hexazotized nueva fucsina (Merck, Darmstadt, Alemania) como cromógeno.

Cuantificación de los niveles de TNF-α mRNA

ARN total fue aislado de la ultracongelados con cerebros Isogen (Nippon gen, Toyama, Japón). El azar 9-tarios-priming cDNA fue preparado con un ARN-LA-PCR Kit (Takara Shuzo, Kyoto, Japón) y 2 μ g de RNA total.

Un LightCycler y el sistema de detección de PCR (Roche Diagnóstico, Mannheim, Alemania) se utilizó para la amplificación y cuantificación de mRNA de TNF α, TNFR1, TNFR2 aldehído y glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) que se describió anteriormente [18]. G3PDH sirvió como control interno. La secuencia específica de los cebos utilizados fueron los siguientes: TNF α adelante ejemplo: 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCCACG-3 ', TNF α invertir ejemplo: 5'-TTTCTCCTGGTATGAGATAGC-3', TNFR1 adelante ejemplo: 5'-CTAAACAGCAGAACCGAGTGT-3 ', TNFR1 invertir ejemplo: 5'-AGATACGTAGAGTGTCCTTGG-3 ', TNFR2 adelante ejemplo: 5'-ATAAAGCCACACCCACAACCT-3', TNFR2 invertir ejemplo: 5'-CATCTCCCTGCCACTCACAA-3 ', G3PDH adelante ejemplo: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3', y G3PDH invertir ejemplo: 5 '-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'. Las construcciones, que se utiliza para crear un estándar de la curva, se hicieron por la clonación con fines de cada amplificación de fragmentos en el sitio Hind III pGEM de un vector (Promega, Madison, WI). El número de copias se calculó tramando una serie de dilución en esta curva estándar de PCR en cada experimento. Para la detección de amplificación, el LightCycler Master Hibridación sondas de ADN se utilizó Kit. Cuantificación de TNF α mRNA se realizó mediante la realización de 50 ciclos repetidos de desnaturalización (1 s de 89 ° C), recocido (5 s a 58 ° C), y de la cadena de extensión enzimática (10 s a 72 ° C). Las condiciones de amplificación de PCR para G3PDH fueron de 40 ciclos repetidos de desnaturalización (1 s a 87 ° C), recocido (5 s a 57 ° C), y de la cadena de extensión enzimática (10 s a 72 ° C). Cuantificación de TNFR1 y TNFR2 mRNAs se efectuó mediante 50 ciclos repetidos de desnaturalización (1 s de 89 ° C), recocido (5 s a 58 ° C), y de la cadena de extensión enzimática (10 s a 72 ° C). Duplicados productos PCR fueron evaluados por análisis de la curva de fusión.

Administración de Ibudilast

Ibudilast es un generoso regalo de Kyorin Farmacéutica Co Ltd (Tokio, Japón). Después de disuelto a una concentración de 1 mg / ml de suero fisiológico que contiene 10% v / v de aceite de ricino polioxietilen hidrogenado 60 (HCO60), ibudilast (10 mg / kg), se inyecta por vía intraperitoneal diaria en tres twi / twi PND de 15 a PND 40, y cinco twi / twi PND de 30 a PND 45. Para los controles, el mismo volumen de HCO 60 fue inyectado en dos twi / twi PND de 15 a PND 40 y cuatro twi / twi PND de 30 a PND 45. La densidad de células TUNEL-positivas en la lesión desmielinizante en twi / twi, tratados desde PND 30 a PND 45 fue calculada utilizando el software MacSCOPE (Mitani Co, Fukui, Japón). Dos neuropatólogos independiente examinó la LFB-PAS-manchado secciones coronal (cuatro secciones por ratón) en el nivel del quiasma óptico y en la que figura el cerebeloso ángulos paraflocculus en una forma doble ciego y anotó la gravedad de desmielinización de 0 a 5. 0: no desmielinización, 1: leve desmielinización, 2: menos del 25% de las áreas están ocupadas por una desmielinización centrarse, 3: 25% ~ 50% de las zonas ocupadas, 4: 50 ~ 75% de las zonas ocupadas, 5 : Más del 75% de las zonas ocupadas. Los puntajes promedio fueron de dos examinadores' evaluaciones.

Hibridación in situ de TNF α

La sonda de cDNA para TNF α por un 268-bp fragmento de la PCR (primers adelante; 5'-GATGGGTTGTACCTTGTCTACTCC-3 'y revertir cartilla; 5'-CTAAGTACTTGGGCAGATTGACCT-3'), desde el ratón TNF α, y se subcloned en un pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, Wisconsin). Hibridación in situ fue llevada a cabo por acción capilar manual utilizando la tecnología con un sistema de tinción Microprobe (Fisher Internacional de la Ciencia, Hampton, NH) que se describió anteriormente [19, 20]. En primer lugar, las secciones del cerebro (10 μ m) se deparaffinized con Auto Dewaxer (Investigación Genética, Huntsville, AL). Las secciones fueron lavadas en el Auto de alcohol, Universal Buffer, y Immuno / ADN de amortiguación (Investigación Genética). Predigestion de proteinasa K (15 μ g / ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) se realizó para aumentar la penetración de la sonda. Después de esta digestión, las secciones de tejidos fueron tratados con inmunosupresores / ADN de amortiguación. El DIG-etiquetados cRNA sonda fue diluida a 0,5 μ g / ml con sonda Brigati diluyente (Investigación Genética), el 50% formamida desionizada, y 50% de sulfato de dextrano. La sonda solución fue calentada a 90 ° C para desnaturalizar el cRNA estructuras y aplicar a las diapositivas. La hibridación de la sonda y el tejido se realizó a 50 ° C durante tres horas. Después de la hibridación, las diapositivas se lavaron en 2 × SSC nonionic que contiene detergente. La detección de la etiqueta DIG-ARN se realizó mediante el uso de la Genius etiquetado y detección del ADN kit (Roche Diagnostics). Por counterstaining, neutral rojo se aplicó.

Análisis estadístico

Prueba t de Student se realizó mediante el uso de software Stat View (SAS Institute, Cary, NC). P <0,05 fue considerado significativo.

Resultados
Los niveles de TNF α y TNFR1 se incrementan en el cerebelo twitcher

El nivel de TNF α mRNA fue la misma en ambos cerebelo y el cerebro de + / + a cualquier edad examinados. En el cerebro, el nivel de TNF-α mRNA en twi / twi fue casi el mismo que en + / + hasta el PND 30, sin embargo, se incrementó a ser aproximadamente 15 veces mayor en el PND que la de 40 + / +. En el cerebelo, no hay diferencia en el nivel de TNF α mRNA entre twi / twi y + / + en el PND 20, sin embargo, su nivel aumentado de manera significativa en twi / twi después PND 30, convirtiendo 40 veces mayor en twi / twi que + / En el PND + 40 (fig. 1A].

A continuación, se investigó los niveles de TNFR1 y TNFR2. En el + / + cerebelo, el nivel de TNFR1 mRNA fue constante a lo largo de todas las edades examinados, mientras que en el twi / twi cerebelo, que aumentó significativamente con la progresión de la desmielinización, convirtiéndose en 50 veces más elevada que en + / + 40 en PND . En contraste, el aumento de ARNm para TNFR2 en twi / twi sólo después PND 40, en comparación con el de + / + (Fig. 1B].

Inmuno análisis reveló que el TNF-α inmunorreactivas células que no se haya reconocido en el PND 20 (Fig. 1C] en twi / twi. Sin embargo, muchos de TNF-α inmunorreactivas se encontraron células en la sustancia blanca cerebral, tronco cerebral y cerebeloso blanca (CWM) en el PND 30 (Fig. 1D] y 40 (Fig. 1E]. Por otra parte, TNF-α inmunorreactivas células no se detectaron en ninguna parte del + / + cerebro incluso en PND 40 (Fig. 1F]. Estos datos son compatibles con los datos de la RT-PCR cuantitativa.

TNF α expresión se incrementa en microglia / macrófagos en las lesiones desmielinizantes en twi / twi

Las características morfológicas de TNF-α células fueron positivas celulares de contorno irregular y la falta de procesos delicado, que recuerda a ameboides microglia / macrófagos. Además, el TNF-α positivo células fueron positivas para el sello RCA-1, un marcador de macrófagos (flechas en la Fig. 2A], pero negativas para los pi-GST, un marcador para OLs, o GFAP, un marcador de astrocitos (datos no presentados), Confirmando las casillas que se microglia / macrófagos. En la twi / twi cerebro, tanto TNF-α células positivas y células TUNEL-positivos fueron más abundantes en el CWM (Fig. 2 B, C] y en el tracto espinal del trigémino (sp5) en el mesencéfalo superior (Fig. 2E, F] . La mayoría de las células TUNEL-positivas también fueron positivos para pi-GST (flecha en la Fig. 2C, H, I], la identificación de ellos como OLs (inserción en la Fig. 2C]. Estas lesiones de cerebelo de los más gravemente desmielinizadas juzgados por MBP inmunoticción (Fig. 2D, G]. En cambio, en el cuerpo calloso, donde era más moderado de desmielinización en el cerebelo, sólo unos pocos de TNF-α se detectaron células positivas (Fig. 2H - J].

Administración de inhibidor de la fosfodiesterasa disminuye la desmielinización y síntomas clínicos

Para investigar si la respuesta inflamatoria en la microglia / macrófagos contribuye a la desmielinización en twi / twi, que administra un inhibidor de la fosfodiesterasa, ibudilast, a twi / twi. Dos de cada cinco twi / twi tratados de PND 30 reveló sorprendentemente leves síntomas clínicos (Fig. 3A]. Incluso en el PND 45, dos de ibudilast tratados twi / twi de 30 PND podrían pasar sin problemas a pesar de leve posterior de la parálisis, y mostró menos grave temblor y ataxia que los vehículos tratados twi / twi. Estos ratones son más grandes que los vehículos tratados twi / twi, puesto que disponían de menos la pérdida de peso (Fig. 3B]. En cambio, ibudilast tratados twi / twi del PND 15 mostró mejoría clínica ni aparente ni alargamiento de la vida útil, sin embargo, sus pesos corporales son más pesados que los de los vehículos tratados twi / twi.

La señal de TNF α mRNA obtenidos por hibridación in situ se reconoció en las células con núcleos pequeños en el CWM y sp5 de vehículo tratados twi / twi (inserción en la Fig. 4A], que corresponde a la presencia de TNF-α inmunoreactividad en la microglia. Esta señal se redujo significativamente en los tratados con ibudilast twi / twi (Fig. 4B, D]. El número de células TUNEL-positivas se redujo en el CWM en ibudilast tratados twi / twi (Fig. 4F, H], en comparación con el de los ratones tratados con vehículo (Fig. 4E, G]. TUNEL-positivas las células se redujo en otras regiones, como el 8 º nervio (8 n) y sp5 en ibudilast tratados twi / twi que en los ratones tratados con vehículo (Fig. 5, la parte superior del gráfico de barras).

LFB-tinción PAS reveló que la desmielinización fue notablemente reprimida en el ibudilast de ratones tratados con PND 30 (Fig. 4J, L], en comparación con el vehículo de los tratados (Fig. 4I, K], como se muestra en la puntuación de desmielinización ( Fig. 5, inferior del gráfico de barras). A partir de estos elementos de prueba, que llegó a la conclusión de que la desmielinización y síntomas clínicos se redujeron con la inhibición de TNF α en twi / twi.

Discusión

Nuestros resultados sugieren que la inflamación secundaria a través de TNF α producidos en microglia / macrófagos aumenta notablemente la apoptosis de OLs y agrava debido a la desmielinización el defecto metabólico en twi / twi. Estos son coherentes con informes anteriores que demuestran que TNF α induce la apoptosis de OLs in vitro [21, 22], y que el TNF α es upregulated en macrófagos y células globosas en twi / twi [11].

TNF α es un establecido pro-inflamatorias mediador del proceso inmunológico, y es esencial para el mantenimiento de la homeostasis del SNC. Sin embargo, su sobreexpresión conduce al desarrollo de la inflamación crónica y la degeneración CNS [23]. Hemos observado anteriormente aparición de TNF-α que expresan las células con progresión de la desmielinización y el número de esas células declinó tras el trasplante de médula ósea con el aumento de supervivencia en twi / twi [10]. TNF α se expresó mediante la infiltración de células mononucleares de sangre, y su expresión se correlacionó con el grado de desmielinización en otra enfermedad desmielinizante genética ligada al X adrenoleukodystrophy [24], y, en el MS [25]. TNF-α ratones transgénicos mostraron más severa desmielinización y la infiltración de macrófagos en EAE, un modelo de ratón para MS [26]. De dos TNFRs, TNFR1 se informó a mediar en el patogenético efectos de TNF α, como la inflamación, la citotoxicidad, y en la apoptosis de OLs EAE [13, 27 - 29]. Nuestro estudio mostró que TNFR1 fue dominante desde las primeras etapas y desmielinizante que desmielinización y OC apoptosis fue mitigado por la supresión de TNF-α en ibudilast tratados twi / twi. Estas líneas de evidencia sugiere que la estimulación de TNFR1 se asoció con la apoptosis de OLs y desmielinización en twi / twi. Por lo tanto, creemos que el TNF α / TNFR1 mediada por la inflamación secundaria involucrada en la progresión de la patología en las variedades de las enfermedades desmielinizantes.

En este estudio, se seleccionaron ibudilast como un agente inmunomodulador que también se suprimió la producción de otros mediadores de la inflamación, tales como el óxido nítrico (NO), IFN-γ e IL-6, y el aumento de la producción de la citoquina inhibitoria, IL-10 , Y de factores neurotróficos, incluido el factor de crecimiento del nervio (NGF), neuroglia factor neurotrófico derivado (GDNF) y neurotrophin (NT-4) [30]. Desde el óxido nítrico inducible (iNOS) y de IL-6 estaban firmemente upregulated en twi / twi y de la enfermedad de Krabbe [10, 11, 31], el efecto positivo de ibudilast también pueden ser asociados con la supresión de la iNOS e IL-6, y la mejora de Inhibitoria citoquinas y factores neurotróficos. Sin embargo, teniendo en cuenta que el TNF α es el más potente citotóxico de citoquinas, y que las señales de TNF α mRNA fueron reprimidas notablemente en las áreas de desmielinización grave en ibudilast tratados twi / twi, el efecto de ibudilast puede ser mediado, en leaset en parte, Por la supresión de la expresión de TNF α.

Varios diferentes tipos de anti-TNF α terapia han sido recientemente denunciados. Por ejemplo, el receptor de TNF-p55-inmunoglobulina proteína de fusión fue comunicado al reprimir desmielinización en la EAE [32, 33], mientras que no mostró una eficacia significativa en pacientes con EM [34, 35]. Infliximab y etanercept, utiliza como anti-TNF α agentes de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn, y no se informó de inducir desmielinización [36, 37]. En contraste con los pobres resultados de esas TNF α represión directa, el interferón (IFN) β [38, 39] y el acetato de glatiramero (GA) [40, 41] han sido ampliamente aprobado en la forma eficaz de los tratamientos inmunomoduladores para la EM. TNF α producción se redujo significativamente en monocitos de los pacientes tratados por GA [42], que actúa principalmente como un antígeno de los linfocitos T. Además, en pacientes con EM que recibieron la administración de IFN β reveló disminución de mRNA para TNF α [43] y un aumento en el suero TNFRs, de los cuales TNFR2 puede jugar un papel protector de la mielina [44].

Los síntomas clínicos se mejoró en sólo dos ibudilast tratados twi / twi, mientras que la desmielinización es más suave en todos los tratados de la twi / twi. En el ibudilast tratados twi / twi sin mejoría clínica, el número de NG2-inmunorreactivas OC progenitores se redujo, en comparación con la de los vehículos tratados twi / twi. La falta de TNF α ha informado a provocar retrasos importantes remyelination de cuprizone en un modelo de desmielinización inducida, debido a un número reducido de proliferando OC progenitores [45], ya que la transducción de señales a través de TNF α p75 TNF receptor 2 (TNFR2) Sabe que inducen la proliferación de progenitores OC [27, 28]. Por lo tanto, la estimulación del TNF α pueden intervenir no sólo en la vía de la señal de apoptosis mediada por TNFR1, sino que también puede desempeñar una función regenerativa a través de la activación de TNFR2 [46]. A principios de tratamiento con ibudilast de 15 PND mostró menos aparente efecto clínico en comparación con los de PND30, probablemente debido a las siguientes razones: a diario la inyección intraperitoneal en sí podría ser demasiado joven para invasoras twi / twi a la ganancia de peso y / o TNFR2-estimulado la proliferación de OLs en este período de mielinización activa es profundamente inhibida por la reducción de la producción de TNF α. Estas líneas de evidencia sugiere que inhibidor de TNF α se debe utilizar por un período limitado de tiempo o en un TNFR1 manera específica.

La citotoxicidad de ibudilast puede ser otra explicación para el hecho de que la mejoría clínica en algunos casos: cuando se administró una dosis alta (20 mg / kg), de ibudilast a twi / twi, inducida por la degeneración vacuolar de los hepatocitos y la de los ratones murieron hepática Fracaso (datos no presentados). Cuando ibudilast fue directamente administrada por una inyección intraventricular de evitar efectos adversos sistémicos, periventricular tejidos fueron dañadas por este producto químico. Estos resultados indican que otros fármacos con menos citotoxicidad son necesarias para mejorar los síntomas de twi / twi y otras enfermedades de desmielinización.

A partir de estas líneas de evidencia, proponemos que la terapia anti-inflamatoria por un inhibidor de la fosfodiesterasa, durante un plazo de tiempo adecuado, puede ser un tratamiento de soporte confiable para la enfermedad de Krabbe para las que no hay tratamiento efectivo, salvo el transplante de médula ósea [6, 23, 47 - 49 ].

Conclusión

Estos resultados sugieren que la supresión de la inflamación por un inhibidor de la fosfodiesterasa podría ser una novela en la terapia genética desmielinización.

Lista de abreviaturas

Twitcher ratón (twi / twi)

Factor de necrosis tumoral-α (TNF α)

Después del día (PND)

Sistema nervioso central (SNC)

Esclerosis múltiple (EM)

Complejo principal de histocompatibilidad (MHC)

Interleuquina (IL)

Oligodendrocitos (OLs)

Encefalomielitis alérgica experimental (EAE)

Ficoeritrina (PE)

Proteína básica de la mielina (MBP)

Pi-forma de glutatión-S-transferasa (GST-pi)

La proteína ácida glial fibrilar (GFA)

Ricinus communis-crioaglutininas-1 (RCA-1)

Buffer fosfato (PB)

Isómero isotiocianato de fluoresceína (FITC)

Deoxynucleotidyltransferase terminal (TdT) mediada dUTP nick fines de etiquetado (TUNEL)

Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)

Peroxidasa de rábano (HRP)

Luxol rápido azul (LFB)-ácido periódico de Schiff (PAS)

Aldehído glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH)

Cerebelosa blanca (CWM)

Interferón (IFN)

Acetato de glatiramero (GA)

Óxido nítrico (NO)

Factor de crecimiento del nervio (NGF)

Neuroglia derivados factor neurotrófico (GDNF)

Neurotrophin (NT)

Óxido nítrico sintasa inducible (iNOS)

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

KKS era responsable de la mayoría de los estudios experimentales, y para escribir el manuscrito. IM contribuido a la fiebre amarilla y la tutela y de la técnica de la edición del manuscrito. KS y KO contribuido a la edición del manuscrito. MT y YU contribuido a la concepción, la interpretación de los resultados y la redacción y edición del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la financiación de los siguientes, el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología del Japón (Grant-in-ayuda a la investigación exploratoria, No.15659246; MT), la Fundación de Investigación Médica de Osaka para Enfermedades Incurables ( MT), Instituto Nacional de Salud USPHS (NS-24453 y HD-03110; KS), Takeda Science Foundation (YU), la Fundación Mitsubishi (YU), la Fundación Japón para Enzimología Aplicada (YU), la Agencia de Exploración Aeroespacial del Japón (YU), Y la Ciudad de Osaka (YU).