Un estudio en la fase I de hidralazina a demethylate y reactivar la expresión de los genes supresores de tumor

El cáncer se considera una enfermedad del genoma que los resultados de un gran número de lesiones genéticas y epigenéticas. Entre las alteraciones epigenéticas, hipermetilación del ADN se cree que juegan un papel importante en el desarrollo y progresión tumoral [1]. En este sentido, al menos tres de ADN funcionales methyltransferases (DNMTs) han sido identificadas, la más abundante es la que DNMT1 preferentemente methylates hemi-metiladas ADN [2], y desempeña un papel clave en la impresión y el cromosoma X-inactivación durante la embriogénesis [3, 4]. DNTM1 se localizan focos de reproducción [5], al menos en parte por la interacción con el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), una proteína que participa en la replicación del ADN. Por lo tanto, es responsable de mantener los niveles adecuados de metilación durante la replicación y, posiblemente, reparación [6]. Otros conocidos son methyltransferases funcional DNMT3a y DNMT3b, que son responsables de la metilación de novo durante la embriogénesis [7]. DNMT3a y DNMT3b tienen iguales preferencias para hemi-metiladas y no metiladas ADN, y por lo que han sido clasificados como de novo methyltransferases [8]. Metilación del ADN pueden interferir directamente con el factor transcripcional de carácter vinculante y, por tanto, impiden la replicación [9], con metil-CpG vinculante que unen a las proteínas y el ADN metilada con proteínas reguladoras que inhiben la transcripción [10]. Además, ambos DNMT1 y metil-vinculante proteínas (PAM), como el metil-CpG-proteína de unión 2 (MeCP2) contratar histonas deacetylases que deacetilate histonas básico colas conduce a la cromatina envasado más estrictos, la reducción del acceso a los factores de transcripción de ADN [11 , 12].

Las células cancerosas se considera que tienen hipometilación global y regional hipermetilación. Hypermethylated regiones son islas CpG, CpG GpC ricos y secuencias de 1 kb largo encontrado proximal a los promotores de genes implicados en el control transcripcional [13]. Estas islas están asociados con alrededor de la mitad de todos los genes [15], su metilación puede reprimir la transcripción de un modo análogo a una mutación o supresión (16). Se piensa que el promotor del gen supresor de tumor hipermetilación contribuye a su silenciamiento transcripcional [14]. Además, existe una lista creciente de genes supresores de tumores en ambos tipos de cáncer familiar y esporádico que se consideren transcriptionally silenciados por hipermetilación [17].

En este sentido, el gen supresor tumoral transcripcional promotor de la reactivación a través de la metilación representa una atractiva estrategia para el tratamiento contra el cáncer. Sustancial de los estudios preclínicos caracterizar inhibidores de la metilación del ADN han demostrado la línea de células de crecimiento de cáncer de detención in vitro y los efectos antitumorales en modelos animales, incluida la prolongación de supervivencia [18 - 20]. Estos conceptos son apoyados por el efecto de la transformación de ADN exógeno metiltransferasa la expresión de los genes observados en los fibroblastos [21], así como por la reversión del fenotipo maligno documentado utilizando oligonucleótidos antisentido contra este gen [22]. Estos hallazgos han allanado el camino para el ensayo clínico de demethylating agentes en el cáncer.

Deoxycytidine análogos de los nucleósidos antes conocido como agentes citotóxicos clásicos y más tarde conocida como inhibidores de la metilación del ADN muestran pobres actividad contra tumores sólidos [23] Sin embargo, el 5-aza-2'-deoxycytidine ha ganado recientemente una atención considerable y actualmente está siendo probado como un agente para demethylating El tratamiento de las neoplasias hematológicas [24]. MG98, es una oligodeoxynucleotide antisentido dirigido contra el 3 'de la región sin traducir ADN metiltransferasa-1 mRNA enzima que se ha puesto a prueba en la clínica [23]. Un estudio en la fase I, cada dos semanas utilizando la administración de este agente, no mostró consecuente disminución de los niveles de mRNA en células de la sangre periférica de los pacientes [25]. A pesar de que este agente ha demostrado actividad en modelos de xenoinjertos de ratones nude, la demostración de la eficacia antitumoral en los seres humanos está pendiente.

Nuestro grupo recientemente ha demostrado in vitro e in vivo y promotor desmetilación gen supresor tumoral transcripcional reactivación mediada por el antihipertensivo hidralazina compuestos [26]. Su ADN demethylating actividad se explica por la interacción entre sus átomos de nitrógeno con los residuos de Lys162 y Arg240 de la ADN metiltransferasa sitio activo como demostró en un modelo de silico [27]. Hidralazina es un fármaco bien tolerado carece de los efectos secundarios comunes de los agentes de quimioterapia citotóxica, sin embargo, sus efectos hipotensores podrían limitar su uso en un entorno clínico, por lo tanto, conveniente para determinar la dosis a su demethylating actividades que se observaron en un conjunto De los genes que se sabe están metiladas en el cáncer cervical.

Los pacientes no tratados previamente con diagnóstico histológico de carcinoma de cuello uterino fueron registrados en este estudio en la fase I. La siguiente se aplicaron los criterios de inclusión: 1) edad entre 18 y 75 años; 2) la condición de Karnofsky del 70% o superior; 3) hematológica, hepática y renal funciones de la siguiente manera: hematológicos: hemoglobina igual o superior a 10 g / L, leucocitos> ; 4000/mm ^3, plaquetas> 100000 / mm ^3, bilirrubina total y transaminasas <1,5 × el límite superior normal, la creatinina sérica y normal, 4) una normal radiografía de tórax y 5) firmaron el consentimiento informado. Los criterios de exclusión fueron: 1) la historia de la alergia a la hidralazina, 2) cualquier pasado o actual condición cardiovascular (mayor presión arterial, la insuficiencia cardíaca, etc, que requieren tratamiento farmacológico, 3) cualquier actual o pasado reumática o enfermedad autoinmune, 4) sin control Infección u otras enfermedades sistémicas; 5), el tratamiento concomitante con cualquier droga experimental; 6) las mujeres embarazadas o lactantes; 7), la enfermedad mental, y 8) anterior o concomitante de las enfermedades malignas que no sea cáncer cutáneo no melanoma. El Consejo Regulador Institucional aprobó el protocolo de estudio.

Se tomaron biopsias de las zonas con visible macroscópico tumoración cervical utilizando una biopsia punch estéril el día antes y el día después de los 10 días de tratamiento hidralazina. El espécimen fue inmediatamente congelado a -20 ° C para su posterior procesamiento. Además, una muestra de sangre de 10 mL se basaba en el brazo por punción venosa, para su posterior extracción de ADN de células mononucleares. Además, la pieza quirúrgica de un cáncer cérvico uterino en etapa temprana de pacientes sometidos a histerectomía radical es multi-muestra en la sala de cirugía mediante la adopción de 4 pequeños fragmentos del tumor macroscópico de las áreas separadas. ADN genómico se aisló de los tejidos tumorales y de la capa leucocitaria capa de muestras de sangre, utilizando el método de proteinasa K digestión y extracción con fenol-cloroformo. ARN de biopsias de tumores se obtuvo utilizando el TriReagent (Gibco BRL Grand Island, Nueva York), kit de extracción de RNA siguientes instrucciones del fabricante.

Veinticuatro horas después de tumor y la toma de muestras de sangre donde los pacientes divididos en los siguientes grupos y comenzó el hidralazina oral por un período de diez días: I) 25 mg cada 12 horas, II) 25 mg cada 8 horas; III) 50 mg cada 12 horas; Y IV) 50 mg cada 8 horas. La toxicidad fue evaluada al final del período de estudio (10 días), con especial énfasis en la presencia, durante todo el tratamiento días, de conocer los signos y síntomas asociados con la hidralazina tratamiento (hipotensión, taquicardia, palpitaciones, síncope, sudoración, dolor de cabeza, mareos y Retención de líquidos). El período de estudio terminado en el día diez y los pacientes acudieron a recibir tratamiento definitivo.

El estado de metilación de los genes se determinó en las biopsias pre y post-tratamiento. El conjunto de genes estudiados fue: p16, RAR β, MGMT, ER, FHIT, APC, DAPK y GSTp1 que fueron analizados por PCR metilación específica-como ha sido descrito previamente [28]. Además, en los cuatro fragmentos del tumor de los pacientes no tratados fueron analizados para la metilación del gen DAPK. En pocas palabras, 1 μ g de ADN en un volumen de 100 μ l de cada muestra fue denaturated recién preparada con NaOH a una concentración final de 0,2 M, y modificados de acuerdo con las instrucciones del fabricante de ADN Modificación kit (Intergen, de Compras, Nueva York). La mezcla de PCR figura 2 μ l de buffer 10X PCR, 0,5 U de Taq polimerasa Oro, dNTPs (1,25 mM cada uno), 300 ng de los cebos y bisulfite-ADN modificado en un volumen final de 20 μ l. Los productos se visualizaron en un gel de agarosa al 2% a la luz ultravioleta. Los cebos y las condiciones de PCR se muestran en la Tabla 1. Un gen se consideró metiladas cuando una banda se presente después de la amplificación con la metiladas, o ambos metiladas y unmethylated conjunto de los cebos. Por el contrario, se considera un gen unmethylated cuando una banda se presente después de la amplificación con la unmethylated establecido en la ausencia de la banda con el conjunto metiladas. Una excepción a estos criterios fue cuando en la biopsia pretratamiento era sólo una banda metiladas pero ambas bandas metiladas unmethylated y después del tratamiento.

El estado de metilación del gen H19 impresa, así como el clon 1,2 que se sabe está normalmente metiladas y no objeto de impresión [29] También se ha analizado por PCR metilación específica. El control positivo para unmethylation clon 1,2 en la secuencia de ADN fue tratado con células cultivadas ethionine. Primers y las condiciones se muestran en la Tabla 1.

Total RNA obtenido de pre y post-tratamiento biopsias se transcribe invertir utilizando un kit de RT-PCR (Perkin Elmer, Branchburg, Nueva Jersey), después de las instrucciones del fabricante. Primers y las condiciones de amplificaciones se muestran en la Tabla 2.

Adenina, timina, guanina, uracyl, cytosine y 5-metil-cytosine fueron adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Bases fueron disueltos en el 2,4 mM en HCL 0,1 M, 0,01 M HCL, o Milli-Q de calidad de agua (Millipore, Bedford, MA), y filtra a través de 0,45 μ m de filtros de tamaño de poro (Millipore). En pocas palabras, se extrajeron muestras de ADN resuspendido en buffer TE al (1 μ g / μ l). La hidrólisis de ADN se llevó a cabo incubando por 40 μ g de ADN en 2 mL 88% v / v ácido fórmico a 140 ° C en una ampolla sellada durante 90 min. Después de la hidrólisis, las muestras fueron reducidas a la sequedad por speedvac concentración y se vuelve a 30 μ l de Milli-Q de calidad del agua. Muestras de ADN de pre y post-tratamiento biopsias fueron analizadas por 5-methylcytosine contenido por electroforesis capilar (CE), según lo informado por nosotros [30]. Para la CE el procedimiento, un fundido sin revestir-capilar de sílice (Beckman-Coulter, de 60 cm × 75 μ m; eficaz longitud, 44,5 cm) se utilizó en un sistema de CE (P / ACE MDQ; Beckman-Coulter) conectado a un procesamiento de datos Estación (32 Karat software). El funcionamiento de amortiguamiento es de 20 mM NaCO ₃ (pH 9,6 ± 1), que contiene 80 mM SDS. Atletismo condiciones eran 25 ° C con una tensión de servicio de 20 kV. - En la columna de absorbancia se vigila a 223 nm. Antes de cada plazo, el sistema capilar fue condicionado por un lavado con el correr de amortiguación por 2 min. Buffers y lavado soluciones fueron preparadas con agua Milli-Q y filtrada en todo 0.45-μ m filtros. Hidrolizado muestras, previamente filtrada a través de poro 0,45 μ m filtros, se inyecta a presión (0,5 psi) durante 15 años. La relativa metilación de ADN de cada muestra se tomó como el porcentaje de C ^m en total cytosine: ^m C área del pico × 100 / (C + ^m área del pico pico zona C).

Mundial de la metilación del ADN fue evaluado por el cytosine de extensión de ensayo [31], que se basa en el uso de la metilación sensibles endonucleasa de restricción que dejar un 5 'guanina pendiente de ADN después de la división, con la consiguiente extensión de nucleótido único con radiomarcada [(3) H] DCTP. Brevemente 1 μ g de ADN de muestras de tejido tumoral fue digerida la noche a la mañana con BssHII según el fabricante. Nucleótido único extensión de reacción se realizó en un 25 μ l de mezcla de reacción que contiene 0,25 μ g de ADN, 1X buffer II, 1 mM MgCl, 0,25 U de DNA polimerasa (Perkin Elmer, Branchburg, Nueva Jersey ^[3 H] dCTP (Ci / mmol) y Incubaron a 56 ° C durante 1 hora, luego colocado en hielo. La mezcla de reacción se aplica luego a la columna sephadex G25. Para la cromatografía en columna, cada columna sephadex G25 fue centrifugada por 10 seg., A 5000 rpm para eliminar el búfer y cargados Con la mezcla de reacción. Después de cargar las muestras a la columna, la radiomarcada ADN se recogió por centrifugación de la columna y se mezclan con líquido scintillation para la determinación de la radiactividad. Los resultados se expresaron como el cambio porcentual de la media de los controles que son muestras de tumor Pacientes pre y post-tratamiento sin BssHII digestión.

Un total de 16 pacientes fueron estudiados. Todos ellos son la quimioterapia o la radiación ingenuo y tenía un tumor macroscópico accesibles para biopsia punch. Su edad media fue de 51,8 (35-75 años), todos los casos fueron histología escamosa y escenifica como etapa FIGO IIB y IIIB. El estado de ejecución fue 0-1 en todos los pacientes (Tabla 3].

Todos los pacientes completaron el medicamento recetado y la hidralazina informó de que el tratamiento fue bien tolerado. Los efectos secundarios como evaluados por el Common Toxicity Criteria se mostró en la Tabla 4. Grado 1 fatiga, dolor de cabeza y palpitaciones se observaron en el 50% de los pacientes; náuseas grado 1 estuvo presente en el 37% de los casos, siendo grado 2 en sólo un paciente. Sólo 2 de cada 16 pacientes presentó mareos grados 1 y 2, respectivamente. Ningún paciente dejó de tratamiento debido a efectos adversos. Hemos observado ningún efecto secundario dosis relación.

Metilación análisis de las biopsias tomadas antes y después de 10 días de administración de hidralazina se realizó en los 16 pacientes. Resultados de la metilación de los genes analizados fueron variables. En general, el 70% (89 de 128) el pretratamiento de las muestras analizadas (8 genes de cada uno de los 16 pre-tratamiento biopsias) tenían por lo menos un gen metiladas, y de los 16 pacientes tuvieron al menos un gen metiladas. Análisis por genes individuales mostraron las siguientes tasas de metiladas genes: APC (94%), ER (25%) FHIT (88%), GSTp1 (88%), MGMT (81%), p16 (19%), RAR β (62 %), Y DAPK (100%), independientemente de la dosis de hidralazina utilizada, el tratamiento posterior a la biopsia mostró una tasa variable desmetilación de acuerdo a la genética, que varía de 15% (2 / 13 muestras) para el gen MGMT, a 67 % De la desmetilación de la gen p16 (2 de cada 3 muestras), (Figura 1A]. Representante de los casos los resultados se muestran en la Figura 1B. Correlación entre la desmetilación nivel de dosis y análisis reveló los siguientes resultados: a 50 mg al día, el 40% de los genes metiladas sufrido desmetilación; a 75 mg fue 52%, en dosis de 100 mg la tasa fue de 43%, y el 32% de los 150 Mg (Figura 1C].

Todos los casos mostraron expresión de actina β. La expresión de genes mostró que el 90% (116 de 128) de las muestras tumorales expresó el mensajero en el pre-tratamiento y post-tratamiento biopsias independientemente de la condición de metilación, por lo tanto, no son informativos. Por otra parte, hubo sólo 12 casos informativos. De esos 12 casos, tres (25%) (que tiene sólo la banda metiladas pretratamiento) no mostraron re-expresión después del tratamiento (2 / DAPK, 1/GSTp1 casos). Estos tres casos recibieron la dosis de 50 mg. En los restantes 9 casos (75%) de la expresión de genes se volvió a inducidos después del tratamiento. Estos nueve casos se comportó de la siguiente manera: Cinco casos fueron RT-PCR negativos pretratamiento (sólo metiladas banda) y convertido positivos post-tratamiento, mostrando metiladas y unmethylated bandas (FHIT dos casos -100 y 150 mg de dosis-MGMT dos casos -75 y 150 Mg de dosis, GSTp1 uno de los casos -50 mg). Tres casos RT-PCR negativos pre-tratamiento con metiladas banda que se convirtió al unmethylated y de expresión positiva en el período posterior a la terapia biopsia (DAPK y ER genes en 75 mg, GSTp1 en dosis de 150 mg), y por último, una RT-PCR negativo en La biopsia pre-tratamiento a pesar de haber unmethylated bandas metiladas y que se convirtió al RT-PCR positiva acompañada de la banda sólo unmethylated (GSTp1 caso a 75 mg). Cuadro 5, Figura 2D. Tres casos representativos se muestran en la Figura 2A, B, C.

Debido a que la toma de muestras de tumor puede dar lugar a muestras de tejido con distinto grado de "contaminación" por no malignos que pueden afectar el resultado de la metilación en el post-tratamiento, biopsias, todas las muestras fueron analizadas por un patólogo. Los resultados mostraron que en todas las muestras de biopsia del contenido de las células malignas varía de 30 a 70%. Un representante es mostrado en la Figura 3A. Además, razonó que si se heterogeneidad tumoral de una magnitud para producir diferentes patrones de metilación en los tumores, independientemente del tratamiento, y luego con un tumor multimuestreo metilación posterior análisis de cada uno de los fragmentos del tumor hará que las zonas con diferente patrón de metilación. El análisis de la pieza quirúrgica de un paciente sin tratamiento mostraron que la metilación de DAPK el promotor del gen fue la misma en los cuatro fragmentos del tumor. Figura 3B.

El estado de metilación del gen H19 impreso se ha investigado en el ADN extraído de células de sangre periférica. Como se muestra en la figura 4, que no ha habido cambios en el patrón previsible de las bandas se observó después del tratamiento, todos los pacientes mostraron bandas con el metiladas y unmethylated conjunto de los cebos. Un cuadro de la metilación también se observó en todos los pacientes analizados para el "normalmente metiladas" secuencia clon 1,2. Ningún caso mostró desmetilación en este locus.

Mundial de la metilación del ADN tumoral fue evaluada por dos métodos, electroforesis capilar y cytosine extensión. Suficiente ADN para realizar la electroforesis capilar era sólo disponible en cinco casos (cuatro pacientes que toman 100 mg, y una toma de 150 mg / día, respectivamente). La relativa metilación de ADN de cada muestra se tomó como el porcentaje de d ^m C en el total de cytosine. Figura 5A muestra la relativa metilación en estos casos. Sorprendentemente, relativa metilación en todos los casos fue entre 34,2 y 38,4% y no hubo cambios en los niveles de metilación después de hidralazina tratamiento (37,3% ± 0,81 y 36,3 ± 1,1% pre y post-tratamiento, respectivamente). Un electropherogram muestra la separación de los analitos de interés, y C ^m C pico se muestran en la Figura 5B. En el ensayo cytosine extensión, en la medida de [(3) H] dCTP después de la incorporación de enzimas de restricción de tratamiento es directamente proporcional al número de unmethylated CpG (cleaved) sitios. Los resultados de este análisis no mostraron cambios estadísticamente significativos en las muestras tumorales pre y post-tratamiento como el porcentaje de aumento en la incorporación radiofármaco fueron 15% ± 31,3% y el 7% ± 16,7% respectivamente, en la Figura 5C.

Los tumores malignos, con frecuencia silencio genes que controlan el crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis a través de la metilación del ADN en sus regiones promotoras y, en consecuencia, su reactivación por los inhibidores de la metilación del ADN ha suscitado un interés considerable como terapia anti-tumoral. El presente centrarse en la metilación del ADN ha abierto una nueva manera de probar clínicamente la capacidad de diversos compuestos como gen supresor tumoral reactivators transcripcional. Hemos informado anteriormente de que hidralazina induce in vitro e in vivo, y desmetilación transcripcional reactivación en el mRNA y los niveles de proteína de la ER, RAR β genes p16 y [26]. El presente estudio confirma nuestros resultados anteriores en un mayor número de pacientes que recibieron diferentes dosis de hidralazina niveles para un periodo de 10 días. Nuestros resultados demuestran que la hidralazina puede demethylate y re-expresar los genes supresores de tumor no tratados previamente, en pacientes con cáncer de cuello uterino en todas las dosis probadas. Tesis efectos no van acompañados de cambios en la metilación del ADN tumoral global evaluada por dos métodos, y la falta de desmetilación en el impreso y el gen H19 "normalmente metiladas" clon 1,2 mononucleares de sangre periférica en las células.

Hidralazina, una amplia difusión agente vasodilatador periférico, se han utilizado mucho para la presión arterial alta, insuficiencia cardíaca y embarazo asociada a trastornos hipertensivos [32 - 34]. Por lo tanto, su evaluación como agente demethylating en un ensayo clínico de los pacientes con cáncer podría proceder sin mayores preocupaciones con respecto a la toxicidad inesperada y efectos secundarios a largo plazo al margen de su conocida capacidad para inducir a un lupus similar condición [35]. Evaluación de los agentes demethylating ADN tumoral en pacientes con tumores sólidos es problemático debido a la necesidad de repetidas muestras de tumor. El cáncer cervical es de fácil acceso para la toma de muestras repetidas tumor y, por tanto, optamos por estudiar los pacientes con diagnóstico reciente de cáncer de cuello uterino. Con el fin de evitar la demora de tratamiento en el grupo de estudio, que prevé el presente estudio entre la fecha de diagnóstico y el inicio de la quimiorradiación. Además, tres publicaciones recientes han puesto de relieve algunos de los genes supresores de tumor que se metiladas en tumores primarios del cuello del útero [36 - 38]. Nuestros resultados demuestran que el 70% de las muestras analizadas pretratamiento tenido al menos un gen metiladas, y de los 16 pacientes tuvieron al menos un gen metiladas. La metilación frecuencia osciló entre el 3 / 16 (19%) a 16/16 (100%) de los genes p16 y DAPK, respectivamente. (Figura 1A]. A pesar de que nuestro mundo es la frecuencia de metilación de genes notablemente similares a las frecuencias por otros autores [36 - 38] encontró que el 86%, 74% y 79%, respectivamente, nos encontramos con diferencias en las frecuencias de metilación de genes individuales más probable que se derivan de la Diferentes poblaciones de pacientes analizados, como pre-invasoras frente a la enfermedad invasora, histologies tumor, y las etapas clínicas (Tabla 6]. Sin embargo, nuestros resultados y los obtenidos en otros estudios, como se muestra en el cuadro 6, sugieren que el cáncer de cuello uterino es un tumor de buen modelo para evaluar el efecto de ADN demethylating agentes a un pequeño número de genes que se encuentran constantemente metiladas en alta proporción. Como era de esperar, hay genes "plenamente" unmethylated o "plenamente" metiladas pero también observó casos que muestran tanto metiladas y unmethylated bandas. Tan ambiguas como patrón de metilación evaluados por PCR específica de metilación se observó cuando los pacientes se estudiaron muestras de tumor que, probablemente, el resultado de cierto grado normal de los tejidos / células biopsia de la contaminación. Esto puede aumentar las preocupaciones sobre si el efecto demethylating mostró post-tratamiento es consecuencia del tratamiento, y no debido tumor de la heterogeneidad, sin embargo, en todos los pretratamiento y post-tratamiento biopsias el componente fundamental del tumor maligno de células (Figura 3A); Por Por otra parte, si desmetilación fueron el resultado de la casualidad que se espera tener los casos en ambas direcciones, es decir, los tumores que demethylated metiladas, y demethylated tumores que metiladas. Este último nunca ocurrió, que apoya firmemente que la demethylating efecto fue causado por hidralazina. Para obtener más información sobre la cuestión de la heterogeneidad tumoral, multi-muestra un tumor y análisis de metilación presentado a cada uno de los fragmentos que contienen tumor de las células malignas. Como se muestra en la Figura 3B, no se habían producido cambios en el patrón de metilación en las cuatro zonas tumorales del tumor. Este resultado apoya la observación de que desmetilación es un efecto de la hidralazina.

Hidralazina se considera una droga segura con la hipertensión y la tierra que van desde la falta de dosificación de 50 mg día a 400 mg / día [33, 34]. Sin embargo, las dosis mayores producen efectos secundarios sintomáticos principalmente derivados de sus efectos cardiovasculares. Con base en esto, nos pareció importante para determinar la dosis más baja posible que desmetilación del ADN inducidas que se utilizarán en los futuros ensayos clínicos. En el presente estudio hemos demostrado que en un rango de dosis entre 50 mg y 150 mg al día durante 10 días, hidralazina, no sólo induce la desmetilación de genes en aproximadamente la mitad de los genes evaluados / tumores, pero también observó re-expresión en dos tercios de El informativo casos. Sin embargo, debido al limitado tamaño de la muestra de este estudio no hemos podido establecer si la eficacia de este gen es demethylating agente o paciente-dependiente.

En la actualidad existe escasa información acerca de la eficacia del tratamiento del cáncer, demethylating y re-expresar genes de los diferentes perfiles de ADN demethylating agentes en la relación clínica. Hay tres informes de evaluación de ensayo clínico 5-aza-2'-deoxycytidine. Dos de ellas se realizaron en pacientes con síndrome de myelodysplasic recaída de leucemia y pacientes. Daskalakis et al., Utilizando el ensayo cuantitativo Ms-SNuPE encontrado basal hipermetilación del gen p15 en 15/23 pacientes (65%), que disminuyó en nueve de 12 pacientes analizados secuencialmente después de al menos un curso de una dosis baja de decitabine. Como era de esperar, la reactivación de la expresión de la proteína p15 se encuentra en las biopsias de médula ósea, cuatro de los ocho pacientes analizados en este estudio. Curiosamente, la respuesta (3 CR) se observó en los nueve pacientes en los que el gen p15 se produjo desmetilación [39]. Más recientemente, un estudio en la fase I con dosis crecientes de decitabine (5, 10, 15 o 20 mg / m ² IV durante 1 hora al día, 5 días a la semana durante dos semanas consecutivas) que se encuentran respuestas en 11/18 pacientes (61%) Sin embargo, no significativa disminución de la metilación p15 tras el tratamiento con decitabine independientemente de la respuesta se observó. Además, en los tres pacientes que mostraron> 50% desmetilación, evaluada por el ensayo de COBRA no hubo respuesta. Los autores especularon sobre la pobre sensibilidad de esta técnica para explicar sus resultados [40]. La evaluación de estos análogos de los nucleósidos en tumores sólidos también ha mostrado resultados inconsistentes. Aparicio et al., Informó de un estudio en la fase I usando 5-aza-2'-deoxycytidine en pacientes con tumores sólidos avanzados utilizando la escalada de dosis de 20, 30, 40 mg / m ² utilizando una de 72 horas de infusión continua cada 28 días. El cuantitativos Metil-Light reacción se utilizó para evaluar los cambios en la metilación promotor en 19 genes, pero no pruebas consistentes de la desmetilación de genes fue documentado a pesar de la neutropenia de grado 4 se encontró en casi un tercio de los pacientes. Este último hallazgo argumenta en contra de su uso como agente demethylating ADN en los tumores sólidos, porque a pesar de la toxicidad tal estado de equilibrio los niveles alcanzados durante el estudio (0.1-0.2 μ M) están por debajo de los niveles necesarios demethylate in vitro a los promotores de genes [41]. Por otro lado, un número de genes mostraron aumento de la metilación, que se podrían derivar de la citotoxicidad de este nucleósido análogo. Es bien sabido que la mayoría de los agentes citotóxicos conducir a un aumento de la metilación del ADN in vitro y en pacientes con cáncer [42].

Entre los no análogos de nucleósidos demethylating agentes, MG98, un oligonucleótido antisentido DNMT1, ha sido probado en un estudio en la fase I para el tratamiento de tumores sólidos. En contraste con los estudios antes mencionados se hizo ningún intento de evaluar la metilación de genes en tumores DNMT1 aunque se investigaron los niveles de mRNA en células de la sangre periférica, no se observó disminución coherente [25].

Nuestros resultados demuestran que la hidralazina es muy prometedor en cuanto a su genética y demethylating gen supresor tumoral reactivación de las actividades, sin efectos secundarios significativos. Es de notar que una dosis-efecto en el nivel de frecuencia de desmetilación no se observó. Un análisis de correlación farmacocinética habría sido útil para la interpretación de estos hallazgos, sin embargo, la farmacocinética de esta droga es relativamente bien conocida, y algunos supuestos se puede hacer. Después de una sola dosis de 1 mg / kg dosis oral después de la quinta y 1 mg / kg dosis administrada cada 12 horas, las concentraciones máximas se obtienen en el rango de 0.12-1.31 y 0.10-1.39 M μ μ M, respectivamente, y los valores oscilan entre las AUC: 4.0 - 3.2-38.5 y 30,4 μ M-minuto, respectivamente [43]. Estas concentraciones fueron probablemente realizados en nuestros pacientes a las dosis utilizadas, que están cercanas a las concentraciones necesarias para alcanzar desmetilación de genes y re-expresión in vitro [26]. No está claro el motivo por el que dicha variable observó tasas de desmetilación de genes independientemente de la dosis utilizada, esto puede ser el resultado del pequeño número de pacientes estudiados, así como la variabilidad adicionales impuestas por el acetylator fenotipo, que puede variar de 30 a 70% de acuerdo Algunos estudios realizados en la población hispana de América Latina [44].

Después de años caracterizar el papel de la metilación del ADN en el cáncer, ha quedado claro que tanto hipometilación e hipermetilación son por su propia causante de cáncer, o al menos la promoción de cáncer, en modelos animales. Esto ha llevado a considerar el uso de demethylating agentes para el tratamiento del cáncer de dos filo espada [45]. Ese examen es discutible como los profundos niveles alcanzados desmetilación del ADN en modelos animales se puede apenas farmacológicamente reproduce en los pacientes. El presente estudio demuestra que la hidralazina a las dosis utilizadas no sólo no demethylate genes que son "normalmente metiladas" como H19 y 2,1 clon, pero también deja de producir mundial desmetilación del ADN como evaluada por electroforesis capilar, que es un método poderoso y preciso a Cuantificar metiladas y unmethylated cytosines [46], y, por extensión cytosine ensayo que también es un método sensible para subrayar los patrones de metilación anormal [31]. Sólo podemos especular sobre la naturaleza de estos hallazgos. En el nivel individual de genes, una posible explicación podría ser que ciertos "normalmente metiladas" genes podría ser dentro de un ambiente proclive a la rápida re-metilación y / o que ciertos genes tienen mayor "disponibilidad" de los elementos que componen el mecanismo de metilación , Por lo que el agente se demethylating dejar de producir desmetilación de estas secuencias por lo menos a un nivel detectable por los actuales métodos de análisis. Este punto de vista es apoyado por la denuncia de que en ratones de 5 azacytidine no cambia el estado de metilación H19 [47]. En lo que respecta a cambios de metilación del ADN a nivel mundial más probable es sólo una cuestión de la dosis como hemos pruebas in vitro que produce hidralazina mundial hipometilación del ADN en las células MCF-7 como evaluados por los mismos métodos utilizados aquí. Por otra parte, los cambios en el contenido global ^m C inducida por la hidralazina no son suficientes para ser detectadas por los métodos que utiliza.

En conclusión, la hidralazina utilizada en dosis estándar para el tratamiento de condiciones cardiovasculares es un medio eficaz y demethylating gen supresor tumoral transcripcional reactivator sin causar disminución en el contenido de ADN ^m C para los tumores sólidos. Nuestros resultados están de acuerdo con lo informado por Chan et al., Que han encontrado importantes grados de desmetilación latente en todos los líticas y virus de Epstein-Barr promotores examinados por PCR metilación específica de cáncer nasofaríngeo en los pacientes tratados con 5-azacytidine [48]. Un estudio clínico de fase II utilizando hidralazina en combinación con quimioterapia citotóxica estándar se está planificando como prueba de concepto de que la reactivación de los genes supresores de tumor silenciados por la metilación del ADN aumenta la eficacia de la quimioterapia en tumores sólidos.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

PZ, SP B, E PC, TB C, L TC, y un CB realizó el análisis de metilación de genes y experimentos de expresión; LC cuidado de los pacientes; AR-V, y KS realizaron análisis de la electroforesis capilar; GC EA y leer críticamente y contribuyeron A la discusión; J CV, realizó los análisis patológicos, y un estudio de la Dirección General de concibió y escribió el manuscrito.

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Http://www.biomedcentral.com/1471-2407/5/44/prepub