Malaria Journal, 2005; 4: 20-20 (más artículos en esta revista)

Práctica protocolos de PCR para la genotipificación Plasmodium vivax utilizando Pvcs y Pvmsp1

BioMed Central
Mallika Imwong (noi@tropmedres.ac) [1], Sasithon Pukrittayakamee (sasithon@tropmedres.ac) [1], Anne Charlotte Grüner (gruner@cochin.inserm.fr) [2], Laurent Rénia (renia@cochin.inserm . Fr) [2], Frank Letourneur (letourneur@cochin.inserm.fr) [3], Sornchai Looareesuwan (tmslr@mahidol.ac.th) [1], Nicholas J White (nickw@tropmedres.ac) [4] , Georges Snounou (snounou@mnhn.fr) [6]
[1] Departamento de Medicina Clínica Tropical, Facultad de Medicina Tropical de la Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia
[2] Département d'Immunologie, INSERM U567, CNRS UMR8104, Institut Cochin, Université René Descartes, Paris 75014, France
[3] Laboratoire Commun de Séquençage, Institut Cochin, Université René Descartes, Paris 75014, France
[4] Wellcome Dependencia de la Facultad de Medicina Tropical de la Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia
[5] Centro de Vacunología y Medicina Tropical, Churchill Hospital, Oxford, UK
[6] Unidad de Parasitologie Bio-Médicale, URA2851 CNRS, Institut Pasteur, París, Francia
[7] Parasitologie Comparée et Modèles Expérimentaux USM307, CNRS IFR101, Muséum National d'Histoire Naturelle, CP52, 61 Rue Buffon, 75231 París Cedex 05, Paris, Francia

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Resumen
Antecedentes

Plasmodium vivax es la segunda de mayor prevalencia de parásitos del paludismo que afecta a más de 75 millones de personas cada año, principalmente en América del Sur y Asia. Además de la morbilidad importante este parásito se asocia con recaídas y una reducción en el peso al nacer. La aparición y propagación de la resistencia a los medicamentos en el Plasmodium falciparum es un factor importante en el resurgimiento de este parásito. P. Vivax resistente a las drogas ha surgido más recientemente, y la vigilancia de la situación sería ayudado, al igual que para P. Falciparum, por métodos moleculares que se pueden utilizar para caracterizar los parásitos en estudios de campo y ensayos de la eficacia de los medicamentos.

Métodos

Útiles PCR genotipo protocolos basados en loci polimórficos presentes en dos p. Vivax marcadores genéticos, Pvcs y Pvmsp1, se elaboraron. La metodología fue evaluada utilizando 100 p. Vivax colectados en Tailandia.

Resultados y Discusión

El análisis reveló que p. Vivax poblaciones en Tailandia son de muy diverso genéticamente, con infecciones mixtas genotipo encontrado en el 26% de las muestras (media multiplicidad de infección = 1,29). Un gran número de alelos distinguibles se encontraron a los dos marcadores, el 23 de Pvcs y 36 de Pvmsp1. Estos fueron distribuidos al azar en general, entre los aislamientos. Un total de 68 genotipos distintos pueden ser enumeradas en los 74 aislamientos con una multiplicidad de infección de 1.

Conclusión

Estos resultados indican que el genotipo protocolos presentados pueden ser de utilidad en la evaluación de la eficacia de los medicamentos in vivo en los ensayos clínicos realizados en las áreas endémicas y de los estudios epidemiológicos de p. Vivax.

Antecedentes

Plasmodium vivax es distribuido a nivel mundial y es la especie dominante en muchos países. La infección por esta especie se considera en general como benigno y la mortalidad es una rara resultado. 1,2 millones de habitantes de la región del sudeste de Asia y el Pacífico están en riesgo de la transmisión de la malaria, lo que representa alrededor de un tercio de la población mundial expuestos a los parásitos Plasmodium [1, 2]. La mayoría de las poblaciones en situación de riesgo en estos países (que corresponde a las agrupaciones regionales de la OMS SEARO y WPRO) residir en hypoendemic y mesoendemic áreas, en donde la mitad de las infecciones registradas se deben a la p. Vivax, lo que sugiere que la carga mundial de morbilidad por malaria vivax debe ser próxima a la de la malaria por Plasmodium falciparum. Recientemente se ha establecido que p. Vivax durante el embarazo se asocia con una reducción de peso al nacer [3], y, por lo tanto, aumentar el riesgo de la mortalidad neonatal. Así, la urgencia de elaborar y aplicar medidas para el control de P. Vivax igualdad que debe asistir a p. Falciparum.

La aparición y la propagación mundial de p. Falciparum parásitos resistentes a la cloroquina y la pirimetamina - sulfadoxina ha dado lugar a un aumento de la morbilidad y la mortalidad [4], que obliga a muchos países a abandonar estos fármacos relativamente baratos. Informes recientes de P. Vivax resistencia a estos fármacos [5 - 13] son de preocupación y medidas para limitar la aparición de la resistencia a los medicamentos a tomar. Un componente crítico de la lucha contra el paludismo es la vigilancia de la resistencia. A pesar de algunos inconvenientes, la valoración in vitro de la susceptibilidad de P. Falciparum a los medicamentos antimaláricos proporciona un medio rápido para controlar los niveles generales de la resistencia a los medicamentos. Aunque los protocolos a la cultura p. Vivax parásitos ex-vivo han sido desarrollados [14, 15], siguen siendo inadecuados para los ensayos de rutina. Así, los ensayos clínicos bien realizados, un componente esencial de la vigilancia de la resistencia, siendo la única alternativa para p. Vivax. Sin embargo, los estudios in vivo realizados en zonas endémicas son, en cierta medida, comprometida por su incapacidad para distinguir recrudescences verdadera, es decir, fracasos de tratamiento, de las re-infecciones que se manifiestan clínicamente parasitológicamente o durante el período de seguimiento, es decir, tratamiento de los éxitos. Esto ha sido en gran medida para superar p. Falciparum por la aplicación de genotipificación basada en bien caracterizado regiones polimórficas en el gen que codifica msp1, msp2 y glurp [16].

Un enfoque similar ha sido adoptada para no p. Vivax, un parásito especies menos bien estudiadas a nivel molecular de p. Falciparum [17]. Cuatro polimórficos p. Vivax solo ejemplar, los genes se han utilizado con independencia de los estudios epidemiológicos moleculares: Pvgam1 que codifica el antígeno de gametocitos, Pvcs codificación de la proteína circumsporozoite, Pvmsp1 y Pvmsp3 α merozoite para la codificación de proteínas de superficie alfa 1 y 3, respectivamente. La amplificación de Pvgam1 resultó ser asociados con artefactos [18] y por lo tanto, debe excluirse como un marcador genético. La idoneidad de Pvmsp3 α como marcador ha sido validado recientemente [19]. El grado de diversidad encontrados para las otras dos genes fue establecido principalmente a través de la secuenciación de los fragmentos amplificados.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar métodos aplicables campo de genotipo que también podría complementar los ensayos clínicos de la malaria vivax. Los genes muy polimórficos Pvcs y Pvmsp1 fueron seleccionados, por lo tanto, a desarrollar los protocolos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de amplificación y posterior análisis de las regiones polimórficas. La metodología fue evaluado y validado con muestras obtenidas de pacientes que adquirieron una p. Vivax infección en Tailandia.

Materiales y Métodos
Las muestras de sangre

Se tomaron muestras de sangre de pacientes adultos con síntomas p. Vivax malaria ingresados en el hospital de Bangkok para Enfermedades Tropicales, Tailandia entre 1995 y 1998 (n = 100). Todos los pacientes dieron consentimiento plenamente informado a la matrícula en estos estudios que fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Tropical, la Universidad de Mahidol. El diagnóstico fue establecido por microscopía en el laboratorio de la malaria a través de un examen de la nada y gotas gruesas, teñidas con tinción de Campo. Las muestras de sangre se mantuvieron a -30 ° C hasta la extracción de ADN.

Plantilla de la DNA preparación

ADN fue purificado de la muestra de sangre utilizando el ADN de sangre disponible en el comercio Kit (QIAGEN, Alemania). El volumen final de la solución de ADN utilizado como una plantilla para la reacción de amplificación fue tal que 1 μ L correspondieron a 5 μ l de sangre total. Confirmación del diagnóstico microscópico como p. Vivax y ensayos para detectar la presencia de otras especies de Plasmodium fueron alcanzados por un descritas previamente PCR basada en el protocolo [20].

Amplificación protocolos

Con el fin de aumentar la sensibilidad de la amplificación, anidadas o semi-nested PCR planteamiento se adoptó para todos los fragmentos amplificados con excepción de una de las tres regiones Pvmsp1. Oligonucleótidos fueron diseñados utilizando publicado secuencias de Pvcs y de Pvmsp1 (sus secuencias se presentan en la Tabla 1]. El óptimo Mg2 + concentraciones, temperaturas de recocido y el número de ciclos se determina individualmente para el primer diferentes pares, y se presentan en la Tabla 1.

Todas las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen total de 20 μ l, y en presencia de 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 250 nM de cada oligonucleótidos, 125 μ M de cada uno de los cuatro dNTPs, y 0,4 unidades AmpliTaq de la polimerasa (Perkin Elmer Cetus, EE.UU.). Primaria reacciones de amplificación se iniciaron con una μ l de la plantilla de ADN genómico preparado a partir de las muestras de sangre, y el que μ l de los productos de estas reacciones se utilizó para iniciar la secundaria reacciones de amplificación. El ciclismo parámetros de PCR fueron los siguientes: un primer paso de desnaturalización a 95 ° C durante cinco minutos antes de los ciclos de recocido a una temperatura definida para cada par de primers (Tabla 1] durante dos minutos, la extensión a 72 ° C durante dos minutos, Y de desnaturalización a 94 ° C durante un minuto. Después de un último paso recocido seguido de cinco minutos de prórroga, la reacción fue detenido. Productos de PCR fueron almacenadas a 4 ° C hasta el análisis.

La falta de la contaminación cruzada fue supervisada por la inclusión de múltiples, distribuidos al azar, muestras de control negativo (ADN humano o no plantilla) en cada uno de amplificación plazo. Un subconjunto de las muestras se analizaron por triplicado, a fin de confirmar la coherencia de los resultados obtenidos.

Análisis de los productos de amplificación

Los fragmentos de ADN obtenida tras la PCR fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa. Para el análisis directo de los fragmentos, 10 μ l de la amplificación de PCR fueron producto mixto con dos μ l de buffer de carga y que se aplican para geles de agarosa al 2%. Por la longitud de los fragmentos de restricción polimorfismo análisis de los productos de PCR (PCR-RFLP), 10 μ l de producto de la amplificación de PCR fueron digeridos con una enzima de restricción (New England Biolabs Inc, Reino Unido) de acuerdo con las especificaciones de los proveedores, por tres horas en un Volumen total de 20 μ l, antes de añadir cinco μ l de buffer de carga y la aplicación de 1,5% a 1,8% o geles de agarosa. Electroforesis se realizó en TBE buffer, y el ADN se visualiza en un Transiluminador ultravioleta tras tinción con bromuro de etidio. El tamaño de los fragmentos amplificados se estimó por comparación con un marcador de 100 bp escalera conjunto.

Selección de fragmentos amplificados fueron purificados usando QIAquick gel kits de extracción (QIAGEN, Alemania) y clonado utilizando el TOPO-TA Clonación kit (Invitrogen, EE.UU.). Plásmido de ADN que contiene el fragmento fue purificado de las colonias bacterianas positivos utilizando el kit QIAquick spin Miniprep (QIAGEN, Alemania) y secuenciado utilizando un secuenciador ABI automatizado. Alineamientos de secuencias se realizaron mediante el programa de Genes Jockey II (Biosoft, Reino Unido).

Resultados
La especificidad y sensibilidad de las reacciones de amplificación

Primers específicos para Pvcs y Pvmsp1 estaban destinadas a la hibridación de secuencias conservadas en todas las variantes conocidas en ese momento. La especificidad de todos los pares de la cartilla se confirmó ya que los productos de amplificación se observó sólo cuando p. Vivax ADN se incluyó en la reacción, pero no en el ADN genómico de P. Falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale o de los seres humanos fueron utilizados como plantilla. Un conjunto de una serie de 10 veces la dilución de una plantilla elaborada a partir de una muestra de sangre que contiene p. Sólo vivax, calibrado usando un protocolo descrito anteriormente [20], se utilizó para evaluar la sensibilidad de las reacciones. De conformidad detección, de 10 de genomas de parásitos se logró para Pvcs primers específicos, y de 50 para los genomas de parásitos Pvmsp1 primers específicos. Estos niveles de sensibilidad estaban de acuerdo con los análisis de muestras de la acogida un conocido número de parásitos.

Genotipo utilizando Pvcs

El gen de la proteína circumsporozoite p. Vivax, Plasmodium como para otras especies, con un dominio repetitivo central flanqueado por dos dominios conservados. La mayoría de las variaciones observadas en Pvcs ocurren en la región y repetir el inmediato antes y después de la repetición de secuencias. Así, el genotipo estrategia se centró en una amplificación de fragmentos que abarcan estas regiones (Figura 1A]. En un determinado parásito línea, la reiteración de dominio se compone de un elemento de 27 pb repetidas un número variable de veces. Las variaciones en el número de elementos repetidos resultado en el tamaño de los polimorfismos susceptibles de detección por electroforesis. Siete alélica tipos distinguibles por tamaño se observaron en el tailandés P. Vivax aislados analizados (Figura 1B], de un número acorde con las variaciones en el número de elementos de repetición (15 a 21) para Pvcs observado anteriormente [21, 22]. En p. Vivax, dos tipos de repetir elementos se encuentran, VK210 y VK247 [23], y un determinado gen exclusivamente Pvcs no llevan el VK210 tipo (tipo I sobre la base de GDRADGQPA repite) o el VK247 tipo (tipo II repite basado en ANGAGNQPG). Con el fin de diferenciar entre los fragmentos amplificados VK210 el desempeño de las que se repita el VK247 elemento, la presencia exclusiva de Alu I en el reconocimiento de los sitios de tipo VK210 y Bst NI reconocimiento de los sitios de la VK247 tipo de secuencias repetidas son explotados. Así, después de la digestión con la enzima, la amplificación de fragmentos son degradadas en fragmentos de <150 pb, fáciles de distinguir de los originales fragmentos de> 700 pb (Fig. 1C]. De esta forma, el PCR fragmentos obtenidos a partir de un aislado se pueden agrupar por tamaño y por tipo de repetición.

Con el fin de aumentar la resolución de genotipificación Pvcs como marcador, para subdividir la p. Vivax en la población un mayor número de tipos Pvcs alélica, la secuencia de las variaciones observadas anteriormente en el antes y después de la repetición de las regiones [24] se utilizaron para elaborar un nuevo protocolo de PCR-RFLP (Fig. 1D]. Para algunos Pvcs genes, la pre-consiste en repetir la secuencia de la Región I (KLKQP) que colinda directamente las reiteradas región, mientras que para otros residuos de aminoácidos que se insertan entre las dos regiones, a saber, una T, V o un residuo de tipo de VK210 Pvcs genes, o ED VK247 para residuos de tipo Pvcs genes. El Scr FI VK210 recortes de endonucleasa de restricción de tipo Pvcs fragmentos que no tienen la T / A / V de inserción después de la I Región, con lo que la reducción de 41 bp por ellos. VK247 de tipo ED Pvcs teniendo la inserción después de la Región I se cortan por la Mbo II endonucleasa de restricción y la amplificación de fragmentos con lo que se acorta en un 55 bp. Para el período posterior a repetir región, de 36 bp inserción se ha encontrado para algunas VK210 de tipo Pvcs. Esta inserción puertos de un reconocimiento para el sitio Bbs I enzima, la digestión y trunca la correspondiente PCR fragmentos de 115 pb.

Genotipificación de las 100 p. Vivax de los aislamientos de Tailandia se logró con éxito utilizando los protocolos descritos anteriormente. En total, los parásitos con una Pvcs teniendo el VK210 tipo repite sólo se encontraron en 90 aislamientos (en representación de siete polimorfismos de tamaño). Parásitos con una Pvcs teniendo el VK247 de tipo repite sólo se encontraron en nueve aislados (lo que representa sólo tres polimorfismos de tamaño), y en un aislamiento de los parásitos se encontraron ambos tipos. Así, el 10 de diferentes formas alélicas de Pvcs fueron detectados por el simple análisis de los fragmentos de tamaño y tipo de repetición. Cuando se asocia con el análisis de RFLP antes y después de la repetición de tipos, estos pueden dividirse en 23 diferentes tipos alélicos (Cuadro 2], 18 para el tipo VK210 y VK247 cinco para el tipo. Mezcla de genotipo infecciones fueron encontrados en 20 de los aislados, por los que cada uno de la multiplicidad de infección (MOI), es decir, el número total de los diferentes tipos alélica observada, fue de dos. Así, para las muestras analizadas, un total de 120 bandas se observaron, con una media de 1,2 MOI. Las variantes alélicas fueron distribuidos al azar en general, entre las 120 bandas; las frecuencias más altas, 0,2 y 0,18, se encontraron para VK210k y VK210n, respectivamente (Figura 2].

Genotipo utilizando Pvmsp1

El Pvmsp1 gen codifica un polipéptido de aproximadamente 1720 aminoácidos [25, 26], y la secuencia de comparación reveló interallele de 13 regiones conservadas y variables bloques bloques [27]. Tres regiones de la secuencia principal divergencia se encontraron a través de la comparación de la longitud completa Pvmsp1 secuencias de dos p. Vivax líneas (Sal-1 y Belem). Tres segmentos (etiquetados F1 a F3) correspondiente a estas regiones por lo tanto, fueron amplificados para un análisis más detallado (Fig. 3A].

Por el tailandés 100 p. Vivax aislados, cinco distinguibles tamaño se observaron variantes de F1 (ca. 350 bp - 450 bp), y cuatro de F3 (ca. 250 bp - 350 bp), pero sólo dos fueron observadas por el mayor (ca. 1087 bp -1150 Kb) F2 segmento (Fig. 3B]. Una variante alélica dominado en la frecuencia para cada uno de los tres segmentos amplificados (Cuadro 3): banda C para la F1 (42% de las bandas observadas), una banda de F2 (78%) y la banda D de F3 (76%). Mezcla de genotipo infecciones se observaron con poca frecuencia y sólo para la F1 (n = 3, 2 de MOI MOI 2 y 1 de 3), y de la F3 (n = 6, 4 MDI, de 2 de MOI y 2 de 3) segmentos.

Una selección de productos amplificados de F1 (n = 18) y F3 (n = 8) representante de todas las variantes de tamaño se secuenciado y comparado con secuencias previamente publicadas (Fig. 4]. El número de distintas variantes F1 resultó ser superior a la revelada por separación electroforética, desde el 11 de las diferentes variantes alélicas se observó para los 18 fragmentos derivados de la tailandesa aislamientos. Secuencia se observaron diferencias dentro de las variantes asignadas a la B, D, E o tamaño de las clases. Algunas de las bandas dentro de cada clase puede ser distinguido por el uso de geles de agarosa de mayor resolución, a pesar de que otros tenían el mismo tamaño y sólo exhiben secuencia sutiles diferencias. Un patrón similar se observó para la F3 fragmentos, en donde la secuencia distinguido seis diferentes variantes.

El F2 segmento, que es comparativamente mal polimórficos en tamaño en el tailandés aislados, que abarca las regiones polimórficas establecido como en estudios anteriores [27]. Una estrategia de RFLP fue adoptado para distinguir entre las diferentes variantes alélicas. Las endonucleasas de restricción Alu I y Mnl I, que reconocen múltiples sitios en F2, fueron utilizados para revelar extenso polimorfismo en el nivel de nucleótidos (Fig. 3C]. Así, nueve y ocho Alu I Mnl I RFLP diferentes patrones fueron observados en los 100 aislamientos Thai (Tabla 3]. La ocurrencia de patrones indicativos de la digestión parcial, o la presencia de genotipos F2 mezclados en las muestras individuales fueron excluidos ya que la suma de los fragmentos de RFLP de los tamaños no resultó mayor que la del producto no ha sido cortada por cualquier aislar y las tendencias observadas fueron No sólo se da en los aislados donde mixta genotipos se detectaron mediante polimorfismo de tamaño de la F3 o F1 segmentos. Cuando los datos de ambos análisis (tamaño y RFLP) se combinaron, 36 Pvmsp1 F2 variantes alélicas pueden ser diferenciados (Tabla 4]. Cuando la frecuencia de las variantes alélicas se considera por separado para los dos patrones de RFLP, el 50% y el 38% de las cepas fueron de un solo y Alu I-Mnl I-clasificados variante alélica, respectivamente. El resto de los aislados fueron distribuidos al azar entre las distintas variantes (Fig. 5A]. Sin embargo, al combinar los resultados de las dos enzimas de restricción, la mayoría de los alelos dominantes se encontró sólo en el 27% de los aislamientos (Fig. 5B], mientras que el resto fueron encontrados en la menor frecuencia (5% o menos).

Dos locus genotipo

Cuando el análisis del genotipo de las cuatro regiones polimórficas de los dos genes se han combinado, de 100 aislamientos de los pacientes de Tailandia resultado ser genéticamente muy diferentes. Mezcla de genotipo infecciones se detectaron en 26 de los aislados, principalmente a través de la Pvcs gen (n = 20). Sólo uno de los aislados identificados como infecciones mixtas genotipo por Pvmsp1 (n = 7) se clasificó como tal por Pvcs análisis. La media de los aislamientos MOI con un genotipo se mezclan 2,11, y que para el conjunto de los aislamientos fue 1,29.

Había 74 aislamientos donde un solo genotipo se detectó después de análisis completo de la Pvcs y Pvmsp1 marcadores. Comparación de los patrones de genotipos obtenidos para estas cepas permite determinar la contribución relativa de los loci polimórficos para distinguir entre p. Vivax poblaciones. Cuando el genotipo completo análisis se tienen en cuenta, un total de 68 genotipos distintos se enumeran. Sesenta y tres genotipos sólo se observaron en una cepa, con un máximo de tres cepas que comparten el mismo genotipo (la más alta frecuencia de genotipo = 0,040). No existen pruebas de vínculo desequilibrio podría ser detectados cuando Pvcs y Pvmsp1 fueron considerados. Si los resultados de la serie de sesiones de Pvmsp1 F1 se omiten en el análisis, 58 genotipos distintos que se encuentran, con un máximo de cuatro cepas que comparten el mismo genotipo (la más alta frecuencia de genotipo = 0,054). Incremental omisión de la serie de sesiones de Pvmsp1 F3 seguida de la de la Pvcs antes y después de repetir los resultados de PCR-RFLP se reduciría el número total de los distintos genotipos a 55 con cuatro cepas que comparten el mismo genotipo (la más alta frecuencia de genotipo = 0,054), y 49 con siete aislamientos que comparten el mismo genotipo (la más alta frecuencia de genotipo = 0,095), respectivamente.

Discusión

Poblaciones de P. Vivax, al igual que los de otras especies de Plasmodium, comprenden genéticamente distintas líneas que muestran la diversidad de una serie de factores epidemiológicos, clínicos y de relevancia biológica. Por ejemplo, la proporción de hypnozoites y el tiempo y la frecuencia de su activación, difieren entre templadas y tropicales cepas de este parásito [28]. Resistencia a los medicamentos está ligada a mutaciones genéticas de genes definen [29] y recientemente la Pvcs repetir tipo se encontró asociado a la transmisibilidad de las especies de anofelinos se define [30]. La capacidad para diferenciar genéticamente diferentes poblaciones de parásitos aumentaría un amplio espectro de las investigaciones de la biología y epidemiología de la p. Vivax.

En este artículo, el potencial de dos p. Vivax genes, Pvcs y Pvmsp1, como marcadores genéticos, se evaluaron los protocolos y prácticas para su uso en la genotipificación parásitos recogidos en el terreno los hallazgos. PCR basado en protocolos orientados cuatro regiones polimórficas de dos marcadores genéticos, uno de Pvcs y tres de Pvmsp1, y se asocia más a RFLP análisis de dos de estas regiones, la región de repetir Pvcs y la F2 fragmento de Pvmsp1, que permiten la división De las poblaciones de parásitos en un incremento del número genéticamente distintas sub-grupos.

Por Pvmsp1, tres regiones polimórficas se evaluaron de forma independiente. Los fragmentos F1, situado en la variable bloque 2 y F3 situado en la variable bloque 10, exhibidas moderada variación alélica tamaño, cinco y cuatro, respectivamente. La frecuencia de las variantes de tamaño, en particular los de F3, muestras de una sesgada distribución de frecuencias entre los 100 aislamientos tailandés consideradas en el presente estudio, con lo que sufre su utilidad como marcadores genéticos. Secuenciación se llevó a cabo para un subconjunto de F1 y F3 fragmentos amplificados del tailandés aislamientos. Este reveló que el 13 F1 y 10 F2 variantes alélicas podrían ser distinguidos. Estos resultados confirman el alto grado de complejidad para los polimorfismos observados Pvmsp1 bloque 2 y bloque de 10 observada en los aislamientos de 31 en Tailandia, Brasil, Oceanía y la India, donde 19 y 13 diferentes tipos alélicos se observaron para el bloque 2 y bloque 10, respectivamente [27] . Por lo tanto es probable que la F1 y F3 segmentos podrían ser explotados sobre la utilidad de los marcadores genéticos a través del desarrollo de tipos específicos de oligonucleótidos, que luego se utiliza en una serie de reacciones de PCR anidada. La amplificación de los fragmentos de grandes centrales F2, que se encuentra entre la variable de bloques 6 y 8, mostró dos variantes de tamaño. Sin embargo, cuando se combina con los análisis RFLP, utilizando dos endonucleasas de restricción, las variantes se subdivide en un total de 36 diferentes tipos alélicos. Por Pvcs, la población se divide en 10 subgrupos a través de tamaño y tipo repetir determinación, y en 23 subgrupos, cuando las variaciones en la secuencia antes y después de la repetición de las secuencias fueron evaluadas por RFLP.

La conclusión de este trabajo es que la repetición polimórficos de la región y Pvcs que Pvmsp1 F2 de la región pueden ser considerados adecuados marcadores genéticos de P. Vivax poblaciones, solos o en combinación. Esto se sustenta en el hecho de que la práctica de PCR-RFLP genotipo protocolos reveló la presencia de numerosos distintas variantes alélicas en una muestra de 100 aislamientos, entre los que fueron distribuidos al azar, sin pruebas de la vinculación desequilibrio entre los dos loci.

Interesante epidemiológica indicaciones pueden ser derivados de la genotipificación de la p. Vivax aislados. El paludismo se considera hypoendemic en Tailandia, donde la transmisión se limita a las regiones fronterizas con Camboya, Laos y Myanmar, rara vez supera algunas picaduras infectivas por persona y año. Un estudio de P. Falciparum diversidad, sobre la base de tres marcadores genéticos, en un campamento de refugiados ubicado en Tailandia cerca de la frontera con Myanmar, revelaron niveles de la diversidad y MOI (1,6, mezclado con genotipo infecciones observó en el 60% de los aislamientos), que fueron superiores a los previstos de la Bajas tasas de inoculación efectiva [31]. Un estudio reciente de P. Vivax parásitos recogidos en la misma región y sobre la base de dos marcadores genéticos, puso de manifiesto que las poblaciones de especies de este parásito son también muy diversas y las infecciones mixtas genotipo se observó en el 35% de los aislados [32]. Los resultados de este estudio indicaron que el 26% de las cepas fueron mixtos de genotipo, con una superficie total de MOI de los 100 aislamientos de 1,29. Cabe señalar que los tres estudios no son estrictamente comparables, ya que el número y tipo de marcadores genéticos, la determinación del genotipo y de los protocolos de recogida de las estrategias que se emplearon diferentes. Además, en el presente estudio el origen de los p. Vivax aislados no se limita a una sola área, ya que los pacientes de los cuales la sangre se recogió adquirido la infección en diversas áreas endémicas de Tailandia. No obstante, estos estudios se indica que las dos especies de parásitos distintos biológicamente similares características de la población. La producción de gametocitos infecciosas durante principios de la infección primaria en P. Vivax frente a su tardía aparición, después de la fase aguda, en p. Falciparum, y la existencia de hypnozoites únicamente en P. Vivax, podría no ser suficiente para explicar el mantenimiento de la diversidad en áreas de baja transmisión. Sustancialmente prolongada duración de las infecciones, probablemente como resultado de la resistencia a los medicamentos de bajo nivel conduce a parasitológicos (aunque no clínico) fallos, como se sugiere para la p. Falciparum [31], y / o una subestimación de la intensidad de la transmisión, tal vez la base de la gran diversidad genética y MOI observó a los dos especies de parásitos. Estos dos no son mutuamente excluyentes escenarios en consonancia con la detección de un alto nivel de infecciones mixtas especies observadas en Tailandia [33 - 36].

Se espera que las metodologías que aquí se presenta puede ser adoptado como estándar los protocolos para la determinación del genotipo de P. Vivax parásitos, no sólo por la eficacia de los medicamentos en los ensayos in vivo, sino también en el campo basado en las investigaciones encaminadas a esclarecer la biología, patología y epidemiología de esta importante especie parasitaria.

Conclusión

Estos resultados indican que el genotipo protocolos presentados pueden ser de utilidad en la evaluación de la eficacia de los medicamentos in vivo en los ensayos clínicos realizados en las áreas endémicas y de los estudios epidemiológicos de p. Vivax.

Lista de las abreviaturas utilizadas

Pvcs-Circumsporozoite gen de la proteína de superficie Plasmodium vivax

Pvmsp1-Merozoite superficie gen de la proteína 1 Plasmodium vivax

Pvmsp3 α-Merozoite superficie de la proteína alfa 3 de genes de Plasmodium vivaxPCR vivaxPCR-Reacción en Cadena de la Polimerasa

RFLP-longitud de los fragmentos de restricción polimorfismo

Contribuciones de los autores

GS, NJW y SP diseñó el estudio. GS y SP fueron responsables por el día a día de la supervisión de la obra. ACG, FL y LR y MI colaboraron para obtener y analizar las secuencias de ADN. SL y SP fueron los responsables de reclutamiento de pacientes y la gestión clínica. MI desarrollado los protocolos con la ayuda de SG, y llevó a cabo la gran mayoría de los trabajos de laboratorio. MI GS y analizados los datos y compuesto el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue parte de la Wellcome Trust de la Universidad Mahidol de Oxford Medicina Tropical de Investigación apoyado por el Programa de la Wellcome Trust de Gran Bretaña.