Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 17-17 (más artículos en esta revista)

Oogenesis en culturas derivadas de adultos humanos ovarios

BioMed Central
Antonin Bukovsky (buko@utk.edu) [1], Marta Svetlikova (msvetlik@utk.edu) [1], Michael R Caudle (MCaudle@mc.utmck.edu) [1]
[1] Laboratorio de Desarrollo, Diferenciación y Cáncer, del Departamento de Obstetricia y Ginecología, de la Universidad de Tennessee Graduate School of Medicine, Knoxville, Tennessee, EE.UU.

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Resumen

Hace diez años, informó de que los adultos humanos de las mujeres en el epitelio superficial del ovario (OSE) es una fuente de células germinales. Recientemente, se ha demostrado también que los nuevos folículos primarios se forman por ensamblaje de los ovocitos con los nidos de primitivas células de la granulosa en la corteza ovárica. Los componentes de los nuevos folículos primarios, primitivos granulosa y las células germinales, diferenciadas secuencial de la OSE, que surge de citoqueratina positivos células progenitoras mesenquimales que residen en la túnica albugínea ovárica. En el presente estudio, se determinó la posibilidad de que los ovocitos y células de la granulosa pueden diferenciar en cultivos derivados de ovarios humanos adultos. Las células fueron desguazados de la superficie de los ovarios y cultivadas de 5 a 6 días, en la presencia o ausencia de estímulos estrogénicos [rojo fenol (PhR)]. El OSE células cultivadas en el medio sin PhR diferenciadas en pequeños (15 micras) fenotipo de las células de la granulosa, y epiteliales, nerviosas, y el tipo de células mesenquimales. En cambio, OSE células cultivadas en presencia de PhR diferenciadas directamente en grande (180 micras) de las células del óvulo fenotipo. Esas células germinales vesícula desglose expuesto, la expulsión del cuerpo polar, y la superficie de zona pelúcida expresión de las proteínas, es decir, las características de los ovocitos de secundaria. Estos estudios in vitro e in vivo confirman nuestras observaciones que en adultos humanos ovarios, de OSE bipotent es una fuente de los ovocitos y las células de la granulosa. El desarrollo de numerosos ovocitos maduros de las células madre adultas del ovario in vitro ofrece nuevas estrategias para la preservación de huevo, la utilización de la FIV, y el tratamiento de la infertilidad femenina. Además, otras aplicaciones clínicas con el objetivo de utilizar las células madre, y la investigación básica con células madre y también, puede emplear las células madre embrionarias totipotentes desarrollo de los ovocitos fertilizados.

Antecedentes

El origen de los ovocitos (primaria y folículos) en los ovarios de las hembras de mamífero adulto ha sido motivo de controversia desde hace más de cien años. El resultado fue el dogma de que todos los ovocitos en hembras de mamíferos adultos persisten desde el período fetal de la vida [1]. Sin embargo, desde un punto de vista filogenético, parece contradictorio que las hembras de mamíferos, incluidos los humanos, desarrollar una única regresivas reproductiva mecanismo, que requiere la preservación de sus gametos del período fetal hasta por varias décadas. Esa preservación de larga duración podría provocar una acumulación de espontáneas o inducidas por factores ambientales alteraciones genéticas de los ovocitos de folículos primarios en reposo. Por el contrario, se ha demostrado oogenesis cultivadas en células madre embrionarias de ratón [2], y mitotically activa de las células germinales, se han registrado en los ovarios de adultos prosimian primates [3] y ratones [4]. Hemos demostrado que las células mesenquimales en la túnica albugínea ovárica (TA) distinguir en el epitelio de superficie, una fuente de las células germinales entran en los vasos sanguíneos y contribuye a la renovación folicular en hembras adultas humanos [5, 6]. Estos informes representan desafíos a los dogmas establecidos en el origen fetal de los huevos de mamíferos [7, 8].

En cuanto a la renovación folicular en hembras adultas humanas, nuestros informes proporcionan pruebas directas de que el epitelio de la superficie del ovario (OSE) es una fuente de las células germinales, y los nuevos folículos primarios se forman por ensamblaje de los ovocitos con los nidos de primitivas células de la granulosa en la corteza ovárica [5 , 6]. Componentes para la nueva folículos primarios, primitivos granulosa y las células germinales, diferenciar y secuencial de novo de células progenitoras mesenquimales que residen en el ovario TA. Parece que las células progenitoras mesenquimales primera contribuir al desarrollo de las células epiteliales similares a las células de la granulosa, y posteriormente estas células epiteliales forman nidos descender a la más profunda corteza ovárica. Oogenesis sigue después. Durante este período, las células progenitoras mesenquimales en OSE diferenciar células embrionarias con un personaje, ni el revestimiento de superficie o de ovario epitelial invaginated criptas. Estas células son una fuente de las células germinales, que reunirse con los nidos de primitivas células de la granulosa para formar folículos primarios. Sistémico concentraciones hormonales pueden influir en estos procesos. Los datos presentados aquí indican que las células de la granulosa son propensos a desarrollar durante un período de baja estímulos estrogénicos (a principios y mediados de la fase folicular). La diferenciación de las células germinales y ovocitos puede estar asociada con una alta concentración de estrógenos (período preovulatorio). La asamblea de ovocitos con células de la granulosa nidos (folicular renovación) pueden ocurrir durante la fase lútea [6]. La diferenciación de las primitivas células de la granulosa y de germen de la bipotent de células mesenquimales precursoras de la TA en adultos humanos ovarios posiblemente representa un sofisticado mecanismo creado durante la evolución de la reproducción femenina. Esto contrasta con la continua preservación de las células madre germinales en los varones [9], y las mujeres prosimian primates y ratones [3, 4].

En la cultura, de OSE someterse a una epithelio células mesenquimales-transición. Estas células son inicialmente citoqueratina (CK) positivo, pero perder CK expresión con el paso del tiempo y en la cultura [10]. Sin embargo, la introducción de la E-cadherina, el tipo de células mesenquimales pueden diferenciarse hacia atrás en el fenotipo epitelial [11]. Múltiples células progenitoras mesenquimales mostrar un fenotipo y capaces de diferenciación en distintos tipos de células se han obtenido de otros tejidos adultos [12 - 16]. Epitelial-mesenquimal y epitelial-mesenquimal transiciones puede reflejar una plasticidad de las células progenitoras en un microambiente. Pueden producirse secuencialmente (epitelial-mesenquimal seguida de la transición epitelio-mesenquimal) bajo la influencia de la matriz extracelular, citoquinas (factor de crecimiento transformante β, el factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento epidérmico, BMP2 y BMP4), moléculas de adhesión ( Integrinas, E-cadherins), receptores de membrana, uniones intercelulares, vías de señalización (MAPK) o factores de transcripción (β-catenina), comúnmente producidos en el embrión, y con menor frecuencia en los organismos adultos. Esas transiciones son manifestaciones de la plasticidad de células y dar lugar a cambios dramáticos - en el linaje de los compromisos ciertos tipos de células (revisado en [17]].

En la cultura, además de su característica morfología, los ovocitos también pueden ser identificados por actividad de la fosfatasa alcalina, aunque inespecífico resultados han sido descritas en diferentes tejidos [18]. Sin embargo, la zona pelúcida (ZP), las proteínas y algunos antígenos de ZP, como el PS1 meiotically expresó antígeno carbohidratado y bomba de calor, zona solubilizados porcina (HSPZ) proteínas, son los marcadores más específicos. De hecho, se han detectado en las células de la OSE el conejo, gato, mono, babuinos y humanos [6, 19, 20]. Por lo tanto, ZP expresión de las proteínas en las células OSE sugiere una relación a los ovocitos. Los ovocitos también pueden expresar CK18, un marcador de la Balbiani cuerpo, pero no CK5, 6,8,17 OSE y marcadores de las células de la granulosa (revisado en [6]]. Además, los ovocitos también expresar la intermedia de filamentos de vimentina, una proteína que desempeña un papel importante en la maduración y fecundación de los huevos [21].

Nuestra meta para el presente estudio fue investigar epitelial-mesenquimal y epitelial-mesenquimal transiciones OSE en cultivos de células de los adultos humanos ovarios. Un enfoque in vitro permite el control de las condiciones en el medio inicial de la composición, por ejemplo, la presencia o ausencia de estímulos estrogénicos, y la determinación de los productos secretora de las células cultivadas en el medio condicionado. El estudio de las culturas OSE fue inicialmente una parte de un proyecto más amplio para establecer cultivos de fibroblastos primarios del suelo pelviano (levator ani fascia) y ronda los ligamentos uterinos. Nuestros estudios preliminares indicaron que piso pélvico fibroblastos crecen mejor en presencia de estímulos estrogénicos. También se detectó la presencia de ovocitos fenotipo de las células en algunas culturas OSE. Así, en experimentos de la presente, nos OSE células cultivadas en la presencia o ausencia de estímulos estrogénicos. Fase contrato microscopía y anticuerpos contra HSPZ, PS1, CK18, CK5, 6,8,17, y vimentina fueron utilizados en individuales y dobles de color peroxidasa inmunohistoquímica para identificar los ovocitos de las células de la granulosa y en las culturas de adultos humanos derivados de ovarios.

Materiales y métodos
Colección de OSE y las culturas de las células

Todos los productos químicos y bienes de consumo, salvo que se especifique lo contrario, fueron adquiridos de Sigma Chemical Co, St Louis, MO. Cultivadas de células se obtuvieron de ovarios asociados a la histerectomía fresco / salpingo-ooforectomía bilateral especímenes (cinco mujeres, edad 39 - 52 años). La cirugía se realizó por indicaciones médicas, incluyendo dolor pélvico crónico, fibromas uterinos, y / o sangrado uterino (dismenorrea severa) no responde a tratamiento conservador. El estudio fue aprobado por el Consejo de revisión institucional y se obtuvo el consentimiento de los pacientes.

Con el fin de impedir la pérdida de células de OSE, no se trató de limpiar la superficie del ovario de la contaminación de sangre que acompaña a la cirugía antes de su recogida. En consecuencia, la contaminación con eritrocitos marcados, junto con nuestra incapacidad para distinguir tipos de células en este momento, obstaculizado nuestra capacidad para contar las células hasta que el soporte se haya cambios después de 24 horas de la cultura. La superficie de los ovarios intactos se raspó suavemente en la aséptica campana de flujo laminar estéril con un cuchillo de acero inoxidable cirugía cuchilla N º 21 (Becton Dickinson, AcuteCare, Franklin Lakes, NJ), dejando el borde detrás de la pala pasa el cuchillo (se refiere a los datos En Figs 1, 2, 3]. Este procedimiento fue seleccionado con la intención de incluir OSE y algunas adyacentes TA células mesenquimales. En algunos casos, un segundo tipo de cultura también se estableció, en donde las células recogidas de la superficie de ovario fueron enriquecidos con células espontáneamente en libertad (sin raspado) de los ovarios disecado (se refiere a los datos en la Fig. 4]. El objetivo de este planteamiento fue probar la actividad de la vía alterna para el origen de las células germinales de las criptas del epitelio cortical (ver Fig. 5 bis y Ref. [6] para más detalles). Esas células fueron pasados a través de un estéril 70 μ m de nylon de células colador (BD Biosciences, Bedford, MA) para evitar la contaminación con mayor tipo de células y estructuras.

Las células fueron recogidas en platos de Petri estéril de cultivo de tejidos que contienen el medio suplementado con inactivado por calor 20% de suero fetal bovino (SFB; Gibco / BRL, Grand Island, NY) y los antibióticos (50 μ g / ml de gentamicina, 100 U / ml penicilina, y 100 Μ g / ml estreptomicina). El cultivo de tejidos se utilizan los medios de comunicación, ya sea Dulbecco modificada de Eagle Media / Ham 's F12, de color rojo fenol libre (DMEM/F12; sin estímulos estrogénicos) o Dulbecco modificada de Eagle Medio que contiene 25 mM HEPES, 4500 mg / L de glucosa, y rojo fenol (MEDM-HG ; Con estímulos estrogénicos). La posible influencia de otras hormonas esteroides o promotores de la esteroidogénesis presentes en el suero no se puede descartar. Sin embargo, en la misma concentración sérica, existen diferencias evidentes en la evolución y maduración de ovocitos cultivados en los medios de comunicación con y sin PhR (Fig. 4h-j]. No había otro tratamiento impuestas durante la cultura.

Las células fueron hilar abajo (1000 × g, 5 min, 24 º C), diluido en 0,75 - 1,5 ml de completarse los medios de comunicación, sin semillas, bien en 3 o 6 pocillos de una placa de 24 pocillos (250 μ l por pocillo) (Fisher Ciencia , Pittsburgh, PA), y cultivadas en un ambiente humidificado con 5% de CO 2 a 37 ° C. El número de pozos fue elegido por el tamaño de los ovarios. Las células recogidas de los pequeños ovarios fueron sembradas en 3 pozos, y la más grande de ovarios en seis pozos. Todos los ovarios participan en el experimento fueron anovulatorios, ya que no se detectaron cuerpo lúteo. El medio de cultivo se cambió una vez después de las 24 horas. Esta izquierda únicamente adherente (viable) en células de la cultura, y elimina las células no adherentes y de la mayoría de la contaminación de los eritrocitos. Los cultivos de células fueron seguidas diariamente por microscopía de contraste de fases y células vivas evaluada por inmunohistoquímica después de 5-6 días a partir de la siembra inicial. La viabilidad de las células se desprende de su activo movimiento, los cambios en la forma y el movimiento de sus núcleos (compare Fig. 4e y 4f]. El número de células adheridas en un solo bien, de 24-así placa ~ osciló entre 100 a finales de 1000 durante el período de cultivo (día 5 o 6).

Habitaciones individuales y dobles de color peroxidasa inmunohistoquímica

La mediana fue de aspiración de los pozos de los 24-así placa, y las células se deja secar en virtud de un ventilador antes de colocarlos en una campana ventilada noche a la mañana. Se trata de un procedimiento que hemos utilizado para criostato secciones. El fondo de los pozos se secaron en posición vertical y encontró macroscópicamente seco a los pocos segundos. Las células fueron fijadas con un 96% de etanol durante 5 minutos, se deja secar de nuevo, y se incubaron durante la noche (4 ° C), con primaria anticuerpos contra las proteínas ZP: conejo anti-calor solubilizados porcina zona [19] (HSPZ, 1: 20) o PS1 anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce meiotically expresó ZP antígeno carbohidratado [20, 22] diluidos 1:10 en solución tamponada de fosfatos (PBS), pH 7,22. El HSPZ y PS1 anticuerpos fueron donados por el doctor Dunbar, y otros HSPZ de anticuerpos por el doctor Prasad. También utiliza el ratón anti-humano CK18, clon CY90, Sigma (diluido 1:50), de ratón anti-humano CK5, 6,8,17, clon MNF116, DAKO Corporation, Carpinteria, CA (diluido 1:50), y el ratón Anti-humano vimentina, clon V9, DAKO Corporation (diluido 1:50).

Como control, el HLA-DR anticuerpos donados por los Dres. Hilgert y Horejsi (cultivo de tejidos sobrenadante diluido 1:5), que no reacciona con las células OSE, se utilizó. Hemos utilizado un HLA-DR anticuerpos no reaccionan con fibroblastos, granulosa, epitelial, germinal o ovocito tipos de células, a fin de determinar el tejido macrófagos activados, pero no encontramos ninguna tales células en el día 5 o 6 culturas. Ello no excluye la posibilidad de que el tejido macrófagos activados pueden haber estado presente durante las fases iniciales de la cultura.

Después de varios lavados en PBS (a temperatura ambiente), las células se incubaron con peroxidasa correspondiente etiqueta secundaria de anticuerpos - cabra anti-IgG de conejo, antes de la absorbida con suero humano (Immunoresearch Jackson, West Grove, PA), diluido 1:50, o la peste porcina IgG anti-ratón (donado por el Dr Peknicova), diluida 1:50 absorbida y riñón de rata con homogenado de eliminar los antecedentes, tal como se describe anteriormente [6]. Después de lavados adicionales en PBS (a temperatura ambiente), el obligado anticuerpos se visualizaron por diaminobenzidine sustrato como se describe anteriormente [6], pero sin hematoxilina counterstain, cubierto con PBS, y las imágenes capturadas como se describe a continuación. Las células teñidas con CK18 o ZP se procesaron más de doble color inmunohistoquímica para identificar co-expresión de otras proteínas, y visualiza con azul cromógeno sustrato como se describe anteriormente [6]. Por último, las células fueron lavadas con PBS que contenía cubiertas 0,01% azida como conservante.

El procesamiento de imágenes

Dos observadores independientes evaluaron las células vivas por contraste de fases y posterior inmunohistoquímica utilizando un microscopio invertido (NIKON, Nikon Inc, Instrumento División, Garden City, NY) equipado con un DEI-470 Sistema de cámara CCD de vídeo (optrónica Ingeniería, Goleta, CA) Con detalle la mejora. Las imágenes de vídeo fueron capturados por CG-7 color frame grabber (Scion Corporation, Frederick, MD), el apoyo de la imagen pública Scion programas desarrollados en los Institutos Nacionales de Salud (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD), y portado a Windows XP, 2002 liberación (Microsoft Corporation, Redmont, WA). Para obtener cifra paneles, el vídeo capturado imágenes se copiarán en Microsoft ® Power-Point ® 97 SR-2 (Microsoft Corporation). Cada imagen (incluidos los controles) se copiarán en Microsoft Photo Editor 3.0 (Microsoft Corporation), y la saturación de color azul ajustada (70 de brillo, contraste 70, gamma 0,30). En total, más de 100 imágenes son capturadas y almacenadas.

Resultados y discusión
Oogenesis in vitro del epitelio superficial del ovario (OSE) las células

Presentamos los datos de pura OSE culturas de los dos casos investigados, ya sea en virtud de PhR-(47 años de edad) o PhR + medianas condiciones (40 años), y puro OSE y cultivos mixtos (OSE + estroma compartimentos; un paciente) estudió con ambas condiciones (edad 39 Años). Culturas de los otros dos pacientes (edades de 42 y 52 años) consistió en células mesenquimales.

Oogenesis en "mixta" de ovario culturas
Conclusión

En conjunto, nuestras observaciones muestran por primera vez que las células de la granulosa (Figs. 1e y 1f] y ovocitos (Figs 2 y 3] pueden desarrollar directamente de las células cultivadas OSE derivados de ovarios humanos adultos. Esto confirma nuestras observaciones in vivo que en adultos humanos ovarios, de OSE bipotent es una fuente de los ovocitos y las células de la granulosa. Además, el desarrollado in vitro de ovocitos someterse a la primera división meiótica, (Fig. 5b], después de que pasen a ser apto para la fertilización. Ovocitos también pueden desarrollar en cultivos que contienen componentes del estroma ovárico. "Creemos que esos ovocitos pueden proceder de la migración de las células germinales o invaginaciones OSE (cortical criptas, Fig. 5 bis]. El desarrollo y la maduración de ovocitos parece ser estimulada por los estrógenos. Dependiendo de las condiciones de la cultura (tipo de medios utilizados), el procesamiento de las células recogidas, la edad de los ovarios, el compromiso de las células vecinas, y otros factores locales y hormonales, las células progenitoras mesenquimales en el ovario culturas, puedan diferenciar en otros tipos de células, incluidas las granulosa Células, o persisten sin cambios.

La capacidad de producir huevos maduros de los adultos de mamíferos in vitro de ovarios tiene varias aplicaciones potenciales en la reproducción humana y animal. En primer lugar, en comparación con la recogida de ovocitos folicular, la técnica es más fácil (el desguace de la superficie del ovario, con o sin componente cortical) y el rendimiento podría ser más alto para la FIV y la medicina veterinaria, ya que la diferenciación primaria de ovocitos in vitro puede proporcionar un Mayor número de secundaria (maduro) huevos. En segundo lugar, para fines de fertilización in vitro, esta técnica puede ser eficaz en mujeres con falla ovárica prematura, que carecen de folículos en los ovarios. En tercer lugar, el desarrollo y la diferenciación de los precursores de OSE de ovocitos in vitro puede ayudar a comprender mejor el proceso de renovación de los ovocitos in vivo, y la función de acompañamiento de la granulosa y células mesenquimales en la regulación de la maduración de los ovocitos o de preservación. En cuarto lugar, las células congeladas OSE (ovocito de las células madre) de las mujeres más jóvenes puede ser preservado para su posterior producción de huevos frescos. Esto puede prevenir la aparición de alteraciones genéticas fetales, que a menudo se asocian con los embarazos en edad materna avanzada, posiblemente debido a la falta de renovación en el envejecimiento folicular ovarios. Además, la colonización de ovarios premenopáusicas con jóvenes ovocitos y células madre granulosas podrá establecer una nueva cohorte de folículos primarios. Esto puede resultar en un 10 - a 12 años de retraso de la aparición de la menopausia natural. Por último, el ovario de las células madre pueden servir como células progenitoras para varios tipos de células para la investigación con células madre, y la fertilización de ovocitos humanos maduros evolucionado podría resultar en la producción de células madre embrionarias totipotentes para fines de investigación y aplicaciones terapéuticas.

Agradecimientos

Esta investigación cuenta con el apoyo de los Médicos de Educación Médica y la Fundación de Investigación, Knoxville, TN, y el Departamento de Obstetricia y Ginecología UT GSM fondos. Nirmala B. Upadhyaya, MD, y los motivos Copas, MD, del Departamento de Obstetricia y Ginecología, y Van Meter E. Stewart, MD, del Departamento de Patología, UT GSM, a condición de ovarios y de las muestras de tejido ovárico hystero-salpingo - Oophorectomies. Damos las gracias al Dr Bonnie S. Dunbar y el doctor Sarvamangala V. Prasad, del Departamento de Biología Molecular y Celular, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, para el tipo de regalo de la PS1 y HSPZ anticuerpos anti-ZP. Dr Ivan Hilgert Vaclav Horejsi y el doctor de la Academia Checa de Ciencias, Praga, República Checa, gentilmente a la de anticuerpos HLA-DR, y el doctor Jana Peknicova de la Academia Checa de Ciencias, Praga, República Checa, a condición de la lucha contra la peste porcina IgG de ratón-peroxidasa conjugada.