BMP-6 inhibe el crecimiento de células B maduras humanos; inducción de la fosforilación y Smad upregulation de Id1

Los miembros del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) superfamilia teniendo importancia fundamental en el control de la proliferación celular, la diferenciación, la migración y la apoptosis [1]. Estas citocinas pueden dividirse en tres subgrupos: TGF-β, la activinas / inhibins, y las proteínas morfogénica de hueso (BMPs), de los cuales este último constituyen la familia más grande. 30-38 kDa BMPs son hetero-o homodimeric proteínas identificadas inicialmente por su capacidad de inducir ectópica de cartílago y la formación de hueso [2, 3]. Varios estudios han demostrado una función esencial de estas proteínas durante la embriogénesis, y más recientemente, también en tejidos adultos [1]. TGF-β ha sido intensamente estudiado, en condiciones normales y malignas de las células hematopoyéticas y es uno de los más potentes de los reguladores endógenos negativos conocidos a la fecha. [4]. En cambio, el efecto de BMPs en el sistema inmunitario no ha sido ampliamente investigado. En ese sentido, BMP-2, -4 y -7 se han encontrado para el control de la diferenciación de las células madre hematopoyéticas [5] y principios de desarrollo de las células T [6, 7]. BMP-6 se ha informado a reducir el número de adoquines de la zona de formación de las células de las células hematopoyéticas normales humanos [8]. Por otra parte, BMP-2, -4, 6 y -7 tenido un antiproliferativo y un efecto proapoptótico sobre el mieloma múltiple las células [9 - 11]. Además, por la expresión de genes de perfiles, BMP-6 aumentó significativamente el valor predictivo para una firma de varios genes de prueba y se asoció con un mal resultado en difusas los linfomas de células B grandes (LBDCG) [12].

BMP-6, al igual que los demás miembros de BMP, y las señales a través de la ligadura de heterodimerzation BMP tipo I [activin-como-kinasa (ALK)] y del tipo II threonine kinasa serina-receptores, que posteriormente se propaga la señal abajo por fosforilantes proteínas Smad. BMP-6 puede señal a través de la ligadura de los receptores tipo I de la Ley RIA, BMP-RIA, y BMP-RIB y el tipo II de receptores BMP-RII, Ley-RIIA-RIIB y de la Ley, que llevan a la fosforilación de los receptores Smads (Smad-1, Smad-5, y Smad-8). El R-Smads entonces forman complejos con el co-Smad (Smad4) y se trasladaron en el núcleo en el que ejerza la regulación de genes [1, 13].

Dada la función informó de BMP-6 en células B malignas y células progenitoras hematopoyéticas, quisimos explorar su papel potencial en humanos de células B normales. Se estudiaron los efectos de BMP-6 en la proliferación y la apoptosis en reposo y estimulado células B. Además, la expresión de los receptores BMP y BMP-6 inducida por la activación de la vía de señalización Smad con la consiguiente regulación de los genes diana Id1-Id4, se resolvieron. Finalmente, se investigó si las células B también son capaces de producir BMP-6.

Los efectos de BMP-6 normales y neoplásicas en células hematopoyéticas, nos llevó a investigar los efectos de BMP-6 en las células B normales humanos. Todos los experimentos en este estudio fueron realizadas en el marco de suero libre de condiciones que los FCS se ha demostrado que interfiere con la señalización BMP-[14] (propias observaciones). Para estudiar el efecto de las BMP-6 en la proliferación, las células B de voluntarios sanos fueron estimuladas con anti-IgM y / o CD40L en la presencia o ausencia de BMP-6 durante tres días. Se encontró que BMP-6 condujo a una reducción media del 35% de IgM anti-síntesis de ADN inducida (n = 8; p ≤ 0,0002, Figura 1A]. Se obtuvieron resultados similares para las células B tratados con anti-IgM y CD40L (26% de reducción media, n = 6, p ≤ 0.023). El BMP-6 inducida por la inhibición de la proliferación es dependiente de la dosis en los dos células B periféricas (Figura 1B] y el linfoma de Burkitt Ramos línea celular (40% de reducción de la síntesis de ADN, la figura 1C]. El BMP-6 efectos podrían ser contrarrestados por la adición de un inhibidor extracelular Noggin (Figura 1D]. Del mismo modo, una combinación de los receptores solubles BMP BMP-RIB-BMP-Fc y Fc RII-también neutralizar los efectos de BMP-6 (datos no presentados). A continuación, queríamos probar si BMP-6 tienen diferentes efectos sobre ingenuo y células B de memoria. Naïve (CD19 ⁺ CD27 ^-) y la memoria (CD19 ⁺ CD27 ^+), células B se aislaron de sangre periférica de células de la clasificación de immunobead-aisladas células CD19 ⁺ B [15], y la prueba de su capacidad de proliferar en presencia de BMP - 6. Sin embargo, BMP-6 inhibido IgM anti-síntesis de ADN inducida en las dos subpoblaciones a una medida similar, con una media de reducción de la síntesis de ADN de 45% (n = 5, p ≤ 0.004) para ingenuo células B y 48% (n = 5, p ≤ 0.001) de las células B de memoria (Figura 1E].

A continuación, hemos querido establecer si BMP-6 también podría afectar a la viabilidad de las células B normales. Viabilidad celular se determinó por yoduro de propidio (PI), después de la tinción de la cultura, con o sin BMP-6 durante 48 horas. Curiosamente, BMP-6 mostraron una pequeña pero reproducible aumento medio de la muerte de la célula del 17 al 23% (n = 5, p ≤ 0.003) en estimulado IgM anti-CD27 ⁺ células B de memoria. Por otra parte, Ramos células mostró un incremento medio en la muerte de la célula del 20 al 50% (n = 3, p <0001, la figura 3] BMP-6 después del tratamiento. En cambio, la muerte de las células CD19 ⁺ del total de células (n = 6, p ≤ 0,32; datos no presentados) o CD27 ^- IgG ^- ingenuo células B no se vio afectada significativamente (n = 5, p ≤ 0,65, la figura 2 ).

El conocimiento detallado acerca de la expresión de diferentes receptores de BMP en células B no está disponible actualmente. Para aclarar aún más el papel de los BMPs humanos en las células B, se realizó occidental blot para el tipo I y tipo II receptores BMP. Este análisis reveló que la Ley de los receptores tipo I-RIA, BMP-RIB y el tipo II de receptores BMP-IRD y de la Ley de RIIb se expresan en reposo humanos de células B (Figura 4]. Ramos células expresaron la Ley de los receptores tipo I-RIA, débilmente BMP-RIB y el tipo II de receptores BMP-IRD, pero más débilmente de lo normal de células B (Figura 4]. HL60 células fueron utilizados para la comparación y débilmente expresado Ley-RIA y BMP-RII.

En conjunto, estos datos muestran que las células B normales humanos y Ramos células expresan un conjunto de los receptores BMP, previamente de obligar a BMP-6 [16].

Al vinculante ligando, el receptor transphosphorylates tipo II y tipo I activa el receptor. Tipo I puede receptores de señales a través de varias vías. Se examinó el efecto de las BMP-6 en la fosforilación Smad, como la activación de Smad se considera como una importante vía de señalización por BMPs [17]. B células se cultivaron en el suero libre de los medios de comunicación durante la noche y luego tratadas con BMP-6 para varios tiempos. Proteínas totales se prepararon lisados, y los importes de las formas de fosforilados Smad1/5/8 fueron determinados por el oeste blot. Curiosamente, el tratamiento con 500 ng / ml BMP-6 induce la fosforilación de Smad. El BMP-6 induce la fosforilación fue elevado a la mayor brevedad punto a prueba (15 minutos), y se mantuvo alta durante al menos 48 horas (Figura 5]. Una fosforilación similar se observó en células Ramos, pero no en células HL60 (Figura 6]. Además, la prueba también conocida abajo si otras vías de señalización de BMP-6 podría ser activado por BMP-6 en las células B humanos. Sin embargo, no observamos cambios significativos en el nivel de fosfato STAT3 o fosfato p38 a BMP-6 tratamiento de las células B (datos no presentados).

A continuación, queríamos explorar si la BMP-6 induce la fosforilación de Smad 1/5/8 también podría inducir cambios transcripcional de genes diana. En este sentido, los inhibidores de las proteínas de ADN obligatorio (ID) se consideran algunos de los principales destinatarios de los genes de señalización Smad [17]. Por lo tanto, las células B se pre-incubaron durante la noche en VIVO X-15, y luego cultivadas en el medio por sí solas o en presencia de BMP-6 para varios tiempos antes de la preparación del total de ARN. El importe de Id1-Id4 ARNm se cuantificó en tiempo real RT-PCR. Curiosamente, se observó una específica de cuatro veces upregulation de Id1 mRNA en BMP-6-B, las células tratadas (Figura 7]. La sobre regulación de mRNA Id1 era característica de una temprana de genes inducibles, con upregulation máximo dos horas después de la adición de BMP-6 y regresó a la línea de base después de 24 horas. En cambio, no se observaron cambios significativos para Id2 y Id3 ARNm, mientras que Id4-transcripciones no eran detectables (Figura 7, los datos no presentados).

Western blot reveló que el BMP-6 inducida upregulation de Id1 mRNA también se correlacionó con upregulation de proteína Id1 también. El aumento en el nivel de proteína Id1 fue detectable después de una hora y el aumento de hasta 24 horas después de BMP-6 Además, que muestran un 16 veces upregulation comparación con t0 (p ≤ 0,020, n = 4) (Figura 8 y 9]. De acuerdo con el ARNm de datos, no en consonancia cambio en la cantidad de Id2 y Id3 proteína se observó (Figura 8 y 9]. Hemos sido capaces de bloquear la Id1 específicas banda con un bloqueo de péptido (datos no presentados). En conjunto, estos datos sugieren que Id1 podría ser un posible objetivo de genes para mediar los efectos de BMP-6 en las células humanas B, mientras que Id2 y Id3 no parecen estar involucrados.

El hecho de que BMP-6 se ha informado a actuar como un estimulador autocrino en condrocitos [18] y ovarium [19], nos llevó a investigar si las células B normales humanos podría producir BMP-6 a la estimulación. Ramos células, que se han descrito para expresar BMP-6 mRNA endógena [20], y la línea celular Jurkat T, sirvió como controles positivos y negativos, respectivamente. Endógena BMP-6 niveles de mRNA en las células B normales se han cuantificado en tiempo real RT-PCR después de la estimulación con anti-IgM para diferentes puntos temporales. Curiosamente, la sobre regulación de BMP-6 mRNA fue característica de la pronta a intermedio de genes inducibles con máxima upregulation cuatro horas después de la adición de anti-IgM. El nivel de BMP-6 mRNA fue de nuevo a la base de referencia después de 24 horas tras la estimulación (Figura 10]. Además, ambos FCS y humanos AB-suero se asociaron con una upregulation de BMP-6 mRNA (Figura 11]. Curiosamente, en otro estudio hemos encontrado que las células T humano normal no expresan BMP-6 mRNA después de la activación (Sivertsen et al, manuscrito en preparación). A continuación, hemos querido detectar las proteínas BMP-6 en las células B normales y probado diversos anticuerpos disponibles comercialmente. Sin embargo, en nuestras manos estos anti-BMP-6 anticuerpos no sólo reconocer la recombinante de proteínas BMP-6 y no la proteína nativa.

Estudios recientes han demostrado un importante papel de los miembros de BMP superfamilia de las células madre hematopoyéticas, a principios timocitos [6, 7], y células B malignas [8, 11, 12], pero una función para BMPs humanos normales en células B no ha sido previamente . El presente estudio demostró un significativo efecto antiproliferativo de la BMP-6 en la sangre periférica de células B CD19 ^+. Además, el BMP-6 inducida por la muerte de las células CD27 ⁺ en las células B de memoria, así como en una línea celular de linfoma de Burkitt (Ramos). Es importante destacar que, BMP-6 indujo una rápida y notable aumento de la fosforilación Smad-1/5/8. Además, el BMP-6 inducida Smad fosforilación fue seguido por una selectiva upregulation de Id1 mRNA y la posterior Id1 proteína.

En el presente estudio, el demostrado efecto antiproliferativo de la BMP-6 en el tratamiento de IgM anti-células B fue significativa y dependiente de la dosis. Es importante destacar que el efecto anti-proliferativo de BMP-6 podría ser completamente neutralizadas por el uso de un inhibidor natural, Noggin. Esto está en consonancia con otros, que muestran que Noggin puede funcionar como un antagonista de BMP-6 [21, 22]. Además, la combinación de soluble BMP-RIB-BMP-Fc y Fc RII-proteínas de fusión también neutralizar el efecto anti-proliferativo de BMP-6 en las células B humanos. Curiosamente, como para otros miembros de la familia TGF, bifuncional efectos también se han demostrado para los BMPs. Considerando que varios de los BMPs se ha demostrado que promover la proliferación en diversos tipos de células incluyendo condrocytes [23], [24] el hígado y las células de la granulosa [25], antiproliferativa y efectos de inducción de la apoptosis ha sido reportado en B y las células T linaje. Efectos similares como se demuestra por BMP-6 en las células B humanos en el presente estudio, se demostró por BMP-2, 4, 6 y -7 en células de mieloma humano [9 - 11]. Otros miembros de la familia BMP-También se ha informado de inducir la apoptosis, incluyendo ratón en el linaje de células B [26]. Además, BMP-4 inhibe la proliferación thymocyte [6]. En conjunto, estos datos sugieren que el papel de los BMPs en la regulación de la proliferación y la apoptosis de células tipo es altamente dependiente.

Para examinar la forma en BMP-6 ejerce sus efectos funcionales en las células B, analizamos la expresión del receptor de BMP occidental blot. Humanos de las células B periféricas se encontraron para expresar el BMP Ley de los receptores tipo I-RIA y BMP-RIB, y la tipo II y los receptores BMP-IRD y de la Ley RIIb-, que después de la señal de varios BMPs vinculantes, incluyendo BMP-6 [16, 13]. Para seguir estudiando BMP-6 inducida de señalización, de la activación de varios trayectos es posible. La principal vía de señalización se conoce hasta el momento, es la activación de los R-Smads [13, 27]. En ese sentido, BMPs han demostrado ejercer efectos antiproliferativos en células B linaje a través de la fosforilación de Smad-R [11, 28]. Además, el BMP-2 se ha demostrado que induce la activación de STAT3 en células de mieloma [9]. Sin embargo, la fosforilación de R-Smad no se investigó en ese estudio. BMP-2 también ha demostrado inducir la fosforilación de p38 [29]. Por lo tanto, la fosforilación de p38, STAT3 y Smad1/5/8 BMP-representan importantes vías de señalización mediada que los efectos de los BMPs e incluso hablar cruzadas entre estas vías se ha comunicado [29, 30]. En el presente estudio, no hemos podido detectar BMP-6-inducida por los cambios en el estado de fosforilación de la STAT3 o p38 en células B periféricas humanos. En lugar de ello, una rápida y marcada de fosforilación de Smad1/5/8 fue revelado. En un estudio paralelo, hemos encontrado que otras BMPs también indujo la fosforilación de Smad1/5/8 periférica en células B (datos no presentados). Estamos actualmente estudios de microarrays para identificar las vías de señalización y de genes objetivo diferente que se rige por las diferentes BMPs humanos en células B.

Upregulation de Id1 través Smad1/5/8 fosforilación es un mecanismo conocido para BMP-6 señalización en otros sistemas celulares [31, 32] y la regulación de las proteínas Id-se piensa que es un mecanismo importante para Smad de señalización [17]. En el presente estudio, en tiempo real RT-PCR experimentos reveló un cuádruple upregulation para Id1 en BMP-6-B, las células tratadas, en tanto que la suma de Id2-Id4 sigue siendo la misma. De acuerdo con este, el oeste blot demostró una upregulation de proteína Id1, mientras que la cantidad de Id2 y Id3 los niveles de proteína se mantuvo sin cambios. Anteriormente, Id1 se ha considerado que no se expresa en las etapas posteriores de desarrollo de las células pro-B [33, 34], y su expresión constitutiva ha informado de que afecte el desarrollo de las células B del ratón [35]. Por lo tanto, nuestra demostración de la función del tiempo upregulation de Id1 ARNm y proteínas en la madurez normal de las células B humanos es de particular interés. En este sentido, cabe destacar que la señalización TGF-β y madura a principios de células B induce tanto Id2 y Id3 expresión [36, 37], pero no Id1 (datos no presentados). Curiosamente, estos resultados ponen de manifiesto que varios miembros de la familia TGF-β regulan ID de proteínas diferente. Id2 y Id3 se consideran principalmente el ID de proteínas expresadas en las células B maduras [38]. El presente estudio también encontró Id2 y Id3 proteína en las células B, que se expresó más que Id1 células B en reposo. Sin embargo, BMP-6 no indujo cambios significativos en la expresión de la proteína de Id2 y Id3. Se cree que las proteínas Id bloque de promover la proliferación y diferenciación en diversos tipos de células [39, 33]. Id proteínas actuar como dominante negativo de los inhibidores de E-Pax5 función de las proteínas y por la formación de dímeros con estas proteínas, lo que los hace incapaces de obligar a ADN. Se ha propuesto que el equilibrio entre E-proteínas, y Pax5 Id proteínas podrían tener un papel importante en activar células B [38]. En ese sentido, E-proteínas han estado implicados en la promoción y la inhibición de la supervivencia y el crecimiento de células en diferentes puntos de linfocitos en desarrollo [40]. La muerte y antiproliferativa efecto inductor de BMP-6 en las células B, con la consiguiente upregulation de Id1 proteína es, por lo tanto, en línea con la opinión de que la ID de proteínas son necesarios para la inducción de la detención del crecimiento y la apoptosis de los linfocitos B-progenitores por TGF-β [40 ].

Además, la ID de proteínas se conocen como partes importantes de vías de señalización implicadas en el desarrollo, ciclo celular y tumorigénesis [32]. Es bien sabido que varios miembros de la familia Id se sobreexpresa en una variedad de tumores humanos y, en general, Id1 parece ser el miembro de la familia que más se sobreexpresa en una variedad de tumores malignos humanos [41], incluyendo el mieloma múltiple [42, 32] . Además, nuestras conclusiones de que BMP-6 activa vías de señalización intracelular en las células B humanos podría ser de potencial importancia fisiopatológica en el linfoma y la inflamación. Alto BMP-6 mRNA expresión en LBDCG Se ha demostrado que se correlaciona con resultados desfavorables [12]. En este sentido, es de interés que la expresión de Id1 dirigidos a los linfocitos B-aberrante resultado en el desarrollo de las células B, la apoptosis masiva, y el posterior desarrollo de linfomas de células B [35]. Por otra parte, BMP-6 ha sugerido que desempeñar un papel en la artritis reumatoide (AR) [43, 44] y niveles elevados de Id1 y Id3 se han encontrado en la synovia de la AR-pacientes [45]. En conjunto, estos resultados apuntan a un papel importante para el ID de proteínas en la regulación de la homeostasis de células B normales y en las enfermedades, en donde las células B están implicadas. Por lo tanto, será aún más importante para dilucidar el papel de Id-1 en humanos de células B selectivo por más de la inhibición de la expresión o Id-1 la expresión génica.

Teniendo en cuenta el rol de BMP-6 en las células B maduras humanos demostrado aquí, la identificación de BMP-6 la producción de las células in vivo con la posibilidad de interacción con la ingenua y la memoria células B podría contribuir a la comprensión de la biología de células B maduras. Alto BMP-6 mRNA expresión en LBDCG se ha detectado por la expresión de genes de perfiles [12]. Además, la producción de BMP-6 transcripciones de las células B normales activado se detectó en el mismo estudio. De nota, un autocrina BMP-6 bucle ha sido informado por otros en los condrocitos y en el ovarium [46, 19, 18]. Por lo tanto, hemos querido explorar la posibilidad de que un autocrina BMP-6 bucle de las células B en humanos. Analizamos la expresión de BMP-6 mRNA en la sangre periférica de células B por PCR en tiempo real, y aquí el informe de upregulation endógeno BMP-6 transcripciones después de la estimulación con FCS, suero humano AB-y, lo que es más importante, anti-IgM. Sin embargo, nuestros intentos de estudio BMP-6 niveles de proteína no tuvieron éxito debido a los problemas con inespecíficos vinculante de la anti-BMP-6 a prueba de anticuerpos, y la falta de tinción específica en el control de las células conocidas para expresar BMP-6 mRNA. Por el contrario, la proteína recombinante fue fácilmente detectado. En ese sentido, algunos investigadores han detectado proteínas BMP-6 en los seres humanos, sobre todo en el tejido no patógena. La posibilidad de BMP-6 humanos en la producción de las células B está en línea con un trabajo reciente que informó de la producción de BMP-6 en las células B del ratón, la infiltración de la médula ósea de ratones con artritis inflamatoria [43]. En este estudio, un papel para inflammatoric BMPs en el proceso de la artritis se sugirió. El upregulation del BMP-6-después de las transcripciones IgM-crosslinking es fisiopatológicos de interés [12]. Una pérdida de TGF-β-respuesta ha sugerido a ser una contribución fundamental para la transformación maligna [47, 48] y similares mecanismos oncogénicos se han postulado para BMPs. Líneas de pruebas [49] sugieren que en las primeras etapas de la carcinogénesis, BMP-6 no es un promotor del tumor, pero suprime los tumores benignos y malignos resultado. Estos resultados están en buen acuerdo con resultados anteriores de otros TGF-β miembros de la familia, incluido el TGF-β1, y BMP-4 [50], lo que indica que celulares BMP contexto de la meta de células podría definir los diferentes efectos observados. En contraste con el upregulation BMP-6 de transcripción en las células B, no hemos podido detectar BMP-6 transcripciones en sangre periférica humana CD4 ⁺ o células T CD8 ⁺ (reposo o estimulación con anti-CD3 y anti-CD28; datos no Muestra), en consonancia con las conclusiones de líneas de células T [20] y de las células T en ratones [43]. Otras posibles fuentes de BMP-6 para madurar las células B in vivo pueden ser otras células del sistema inmunitario o de tejidos con el contacto con el sistema hematopoyético. Una fuente bien reconocida por BMP-6 es la producción de huesos humanos y de la médula ósea estroma [51, 8]. Por otra parte, cabe destacar que la vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC) altamente expresar BMP-6 mRNA [52], y el endotelio vascular ha informado a producir BMP-6 [53]. Estos estudios podrían implicar un papel para BMP-6 en transendothelial migración de las células B. BMP-6 mRNA se ha demostrado en líneas celulares de macrófagos murinos, pero no en los seres humanos [54]. De acuerdo con estos resultados, otras líneas celulares humanas de los neutrófilos y monocitos origen se han descrito como negativa para el BMP-6 transcripción [20]. Que sepamos, no hay actualmente ningún informe acerca de BMP-6 producción de las células dendríticas humanas.

En conclusión, nuestros resultados muestran que BMP-6 induce la activación de la señalización intracelular Smad maduras en humanos de células B consecutivos con la producción de la proteína Id1. Además, nos informan de que BMP-6 tiene un efecto antiproliferativo en células B estimuladas con anti-IgM solo o la acción combinada de IgM y anti-CD40L. Además, el BMP-6 induce la muerte celular en las células B de memoria activada y Ramos células. En conjunto, estos resultados proporcionan un fundamento de examinar más a fondo la función de señalización de BMP-6 en células B normales de la biología, así como en condiciones patológicas como células B malignas y trastornos autoinmunes.

Si no se especifica, todas las células se cultivaron en VIVO X-15 ™ (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) en suero libre de medio a 37 ° Cy 5% de CO ₂ en el aire.

Sangre periférica fue proporcionada por el Banco de Sangre en el Hospital Regional de Buskerud con el acuerdo formal por los pacientes, y la aprobación por el comité de ética regional. Altamente purificada descanso humanos de los linfocitos B (células CD19 ⁺⁾ fueron aisladas de la sangre periférica por rosetting inmunomagnética con piedras (Dynabeads M450; Dynal, Oslo, Noruega), tal como se describe [55]. Este procedimiento produce menos del 0,5% de las células T, las células NK 0,1%, 0,5% y monocitos como juzgados por la tinción de inmunofluorescencia indirecta.

Las siguientes líneas de células humanas de neoplasias linfoides se mantuvieron en RPMI 1640 (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS), 100 unidades / ml penicilina G, y 100 unidades / ml de sulfato de estreptomicina, pero - Suero de hambre durante al menos cuatro horas y cultivadas en VIVO X-15 ™ cuando se incluyen en los experimentos: EBV negativos-BL líneas celulares Ramos (ECACC 85030802), HL60 (JCRB0085).

Los siguientes son los reactivos utilizados en las concentraciones indicadas: recombinante humana (rhu) BMP-6 (1 μ g / ml, si no se especifica otra cosa), rhu BMP-RIB/ALK-6/Fc Quimera (5 μ g / ml), rhu BMPR - II / Fc Quimera (5 μ g / ml), y el ratón Noggin recombinante (5 μ g / ml) fueron adquiridos de los sistemas de I + D (Abingdon, Reino Unido); Anti-IgM F (ab) 2 fragmentos de anticuerpos policlonales de conejo a la cadena pesada de IgM (37,5 μ g / ml) se obtuvo de Dako, Copenhagen, Dinamarca y rhu CD40 ligando (CD40L, 10 ng / ml) fue un regalo de Immunex Corp (Seattle, WA).

Anticuerpos humanos contra la Ley de los receptores BMP-RIA-, BMP-RIB, BMPR-II, la Ley y la Ley-RIIA-RIIb se compraron de R & D Systems (Abingdon, Reino Unido). Detección de la BMP-6-proteína se ha probado con los siguientes anticuerpos: cabra policlonal anti-BMP-6 (Santa Cruz, San Diego, CA, EE.UU.), mouse monoclonal anti-BMP-6 y cabra policlonal anti-BMP-6 De R & D Systems (Abingdon, Reino Unido), y mouse monoclonal anti-BMP-6 (Chemicon International Inc, Temecula, CA, EE.UU.).

BMP-Caracterización de vías de señalización se hace mediante el uso de anti-fosfato Smad1, -5, y 8-anticuerpo policlonal (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.). Los niveles de expresión de Id1-3 proteínas se detectaron con anticuerpos policlonales de conejo y la detección fue bloqueado con el bloqueo péptido Biotecnología de Santa Cruz (Santa Cruz, San Diego, CA, EE.UU.). Como secundaria de anticuerpos anti-ratón sirve, la lucha contra la cabra o IgG anti-conejo-peroxidasa de rábano (HRP) de Dakocytomation AS (Copenhague, Dinamarca) para el análisis de inmunoblot. Anti-β-actina fue de Santa-Cruz. De Becton Dickinson (San Jose, CA), que compró anti-CD19-PE, anti-CD19-FITC. Los anticuerpos utilizados para la selección de células CD19 eran anti-PC5 de Immunotech SA (Marsella, Francia) y anti-CD27 PE de Becton Dickinson, Pharmingen Biosciences (San Diego, CA, EE.UU.).

Altamente purificada CD19 ⁺ CD27 ^- o CD19 ⁺ CD27 ⁺ células se obtuvieron mediante la tinción de células CD19 ⁺ con anti-CD27 y CD19 PE PC5 mAbs durante 30 minutos a 4 ° C, seguido de un lavado con PBS y la clasificación sobre FACS DiVa de Becton Dickinson.

B células de sangre periférica o de las líneas de células cultivadas fueron lisadas en buffer de lisis (10% de glicerol, β-mercaptoetanol 5%, 0,0625 M Tris-HCL [pH 6,8], dodecil sulfato de sodio [SDS] 2,5% w / vol). Proteínas totales (30-100 μ g) de cada muestra, se ha ejecutado el 10% o 12% SDS / poliacrilamida (SDS / PAGE) geles y borró en filtros de nitrocelulosa (Protran; Schleicher y Schuell GmbH, Dassel, Alemania). Bloqueo, la incubación y el lavado de los filtros con anticuerpos primarios se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante a temperatura ambiente (RT). Después de un lavado con TBS/0.1% de Tween-20 (TBS-T), los filtros se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) junto a la secundaria de anticuerpos (véase más arriba) durante 60 minutos a TA. La actividad enzimática fue visualizado por el mayor sistema de quimioluminiscencia, ECL ⁺ PLUS (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido). Densitométrica análisis se realizó mediante el escaneo de una hyperfilms Personal Densitometer SI (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Cuantificación de Id1, Id2 y Id3 proteína se calculó por la normalización de la proteína específica a bandas de β-actina usando el software Image Quant 5,5 (Molecular Dynamics).

Endógena expresión de los genes BMP-6 fue examinado por transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa. Total RNA se aisló ARN usando Absolutamente ™ RT-PCR Miniprep Kit (Stratagene Europa, Amsterdam, Países Bajos), con arreglo a las instrucciones del fabricante. La cuantificación del ARN total aislado se logró mediante el uso de espectrofotométrico OD ₂₆₀ mediciones. Igual cantidad de ARN se transcribe a continuación, invertir cDNA con TaqMan ^® Reactivos Transcripción Reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Para medir la expresión de mRNA BMP6, Id1-Id4 y PGK1 PCR se llevaron a cabo con TaqMan ^® universal maestro de la mezcla. Primers y sondas fueron proporcionados por ensayo-on-Demand (Applied Biosystems). Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 25 μ l (BMP-6) o 20 μ l (ID1). El cDNA añade a cada reacción fue equivalente a la aportación de 20 ng de RNA total. La expresión genética se cuantificó utilizando el método estándar de la curva (BMP6), o el método comparativo C _T (Id1) como se describe en el Boletín ABI7700 usuario 2 (Applied Biosystems). La expresión fue normalizado a nivel de la expresión PGK1. PGK1 se eligió, porque se ha demostrado que tiene un nivel bajo de expresión variabilidad de los especímenes de linfocitos [56]. Los niveles de expresión en las células B son entonces relacionadas con los niveles de expresión en las células Ramos.

Para la estimación de la síntesis de ADN, las células CD19 ⁺ (7,5 × 10 ⁴ cells/0.2 ml) o Ramos células (1 × 10 ⁴ cells/0.2 ml) se cultivaron en microtiter triplicado en los pozos. Las células fueron pulsados con el 3,7 × 10 ⁴ Bq ^[3 H] timidina (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) de los últimos 16 h de un 72-h de incubación. Las células fueron recolectadas utilizando una cosechadora automática de células (Instrumento Packard Company, Meriden, CT, EE.UU.), y ^[3 H] timidina incorporación se determinó en un contador scintillation (TopCount, Packard Instrument Company Inc, Meriden, CT).

Muerte celular se midió por el colorante vital exclusión de prueba por la tinción de las células con 5 μ g / ml de yoduro de propidio ([PI]; Calbiochem Corp; La Jolla, CA; 5 mg / ml) durante un minuto en hielo. Por lo menos 1000 células por muestra se ejecutan en un flujo FACSCalibur BD cytometer.

La significación estadística de las diferencias entre los grupos se determinó a través de los pares de dos colas con técnicas de prueba de Wilcoxon, mediante la aplicación de SPSS10.1 software (SPSS Inc, Chicago, IL, EE.UU.). Los valores de p inferior a 0,05 se consideró significativo.

BMP, la proteína morfogénica ósea

LBDCG, difuso de células B grandes linfoma

Id, inhibidor de la ADN obligatorio

Smad, el nombre Smad se origina a partir de la proteína de Drosophila, MAD y el Caenorhabditis elegans proteínas, pequeñas-2, 3 y 4

STAT, transductor de señales y activador de la transcripción

CK diseñado y llevado a cabo experimentos, supervisó la investigación, y escribió el papel. EAS diseñó y llevó a cabo experimentos, supervisó la investigación. MEH diseñado y llevado a cabo experimentos, supervisó la investigación. LF diseñado y llevado a cabo experimentos. EBS diseñado experimentos, supervisó la investigación, y escribió el papel. JHM designed and conducted experiments, oversaw research, and wrote paper.