Cancer Cell International, 2005; 5: 13-13 (más artículos en esta revista)

Caracterización morfológica de una célula humana glioma l ine

BioMed Central
Camila ML Machado (c970334@dac.unicamp.br) [1], André Schenka (schenka@hotmail.com.br) [2], José Vassallo (glaujv@fcm.unicamp.br) [2], Wirla MSC Tamashiro ( Wirlatam@unicamp.br) [1], Estela M Gonçalves (estelamg@unicamp.br) [3], Selma C Genari (sgenari@nutricell.com.br) [3], Liana Verinaud () [verinaud@unicamp.br 1]
[1] Departamento de Microbiología e Inmunología, Instituto de Biología, Universidad Estatal de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil
[2] Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad Estatal de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil
[3] Departamento de Biología Celular, Instituto de Biología, Universidad Estatal de Campinas, Campinas, São Paulo, Brasil

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Resumen

Un humanos continua línea de células malignas, de nombre NG97, se ha establecido recientemente en nuestro laboratorio. Esta línea celular se ha subcultured en serie más de 100 veces en el estándar de medios de cultivo que no presenten signos de senescencia celular. La NG97 línea celular tiene un tiempo de duplicación de alrededor de 24 h. Inmuno análisis de marcadores gliales demostrado que las células son positivas para la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) y la proteína S-100, y negativos para la vimentina. Bajo microscopio de contraste de fase, de las culturas NG97 variable mostró células con características morfológicas, como pequeñas células redondeadas, fusiforme células (células de tipo fibroblástico), y-al igual que las células dendríticas. Sin embargo, en la confluencia sólo pequeñas células fusiformes redondeadas y se puede observar. En microscopía electrónica de barrido (SEM) mostraron pequeñas células redondeadas microextentions heterogéneas, incluyendo vesículas y filopodios. - Al igual que las células dendríticas son planas y presenta extensas prolongaciones, la realización de los distintos contactos con las pequeñas células redondeadas, mientras que las células fusiformes presentan sus superficies dominadas por microvellosidades.

Creemos que el conocimiento sobre NG97 línea celular puede ser útil para una comprensión más profunda de las características biológicas e inmunológicas de los gliomas.

Antecedentes

Los gliomas malignos son el tipo más común de tumor cerebral en adultos. Estos tumores son altamente invasivas y, a pesar de múltiples modalidad de tratamiento la media de supervivencia de los pacientes es todavía menos de 1 año.

Culturas de las células malignas constituyen un material excelente y permanente para el estudio de la biología de estos tumores como, por ejemplo, la caracterización de los antígenos específicos, los factores bioactivos producidos, la determinación de la proliferación celular, y la heterogeneidad de las características genotípicas y fenotípicas (Pohl et al. 1999; Tsujino Et al. 1997; Bodmer et al. 1989; Di Tomaso et al. 2000; Halffter, et al. 1998; Bigner et al. 1981).

Recientemente, hemos establecido una línea celular humana glioma de tejido obtenido de un paciente con diagnóstico de glioblastoma multiforme del lóbulo temporal derecho. El examen histológico reveló un astrocitoma de grado III según la clasificación de la OMS. Esta línea celular, llamada NG97, ha sido sub-estándar cultivadas en medios de cultivo sin alimentador capa de colágeno o revestimientos. La inyección de células en NG97 congénita athymic mice inducir la formación de masas tumorales sólidas que se pueden retrasplante cada 4 semanas. Estos tumores presentan características de los gliomas malignos caracterizados por células pleomorfismo, necrosis y agresivo crecimiento (Grippo et al. 2001).

El presente trabajo se llevó a cabo para estudiar la cinética de crecimiento, la expresión de proteínas marcadoras y características morfológicas de los primeros pasajes células presentes en la NG97 línea celular.

Resultados
Marcadores

Inmuno análisis de marcadores gliales en el NG97 células demostrado que un gran número de células fueron positivas para GFAP y proteína S100 (Figura 1A y 1B, respectivamente). GFAP presenta un difuso perinuclear condensación, y la proteína S-100 se observó de manera uniforme en el citoplasma y irregularmente observado en el núcleo de algunas células. Por otra parte, la vimentina fue indetectable en esta línea celular (Figura 1C]. Figura 1D muestra un representante de control de todos los experimentos de inmuno.

Estudios de microscopía

Inicialmente, NG97 células formadas principalmente flotantes agregados en la cultura y sólo pequeños frascos, se observaron células redondeadas (Figura 2A]. En la 13 ª paso-como las células dendríticas aparecen en la cultura (Figura 2B]. Estas células presentan extensas prolongaciones hacer varios contactos con las pequeñas células redondeadas y mostró extra numerary nuclear (Figura 2C]. A medida que la cultura se convirtió en densa, un tercer tipo celular parece presentar una morfología fusiforme (similares a las células de fibroblasto). En la confluencia, sólo pequeñas células fusiformes y se puede observar en la cultura (Figura 2D].

El microscopio electrónico de barrido de las pequeñas células redondeadas mostró heterogeneidad de prolongación citoplasmática, incluyendo vesículas y filopodios (Figura 3A y 3B]. De las células dendríticas como se ilustra en las figuras 3C a través de 3F. Estas células presentan alto grado de aplanamiento celular, la ausencia de vesículas y, en numerosas y extensas prolongaciones citoplasmáticos. Se les atribuye a la toma de contacto con el sustrato de pequeñas células redondeadas. El tercer tipo de células morfológicamente distinto se presenta en las figuras de 3G y 3H. Estas células fusiformes presentan numerosas microvellosidades en la superficie.

Cinética de crecimiento

Hasta el 13 º paso, cuando sólo pequeñas células redondeadas se ve en la cultura, una lenta tasa de crecimiento se observó (datos no presentados). En la 13 ª pasaje, cuando los otros dos tipos de células apareció en la cultura, las células entró en una fase de crecimiento exponencial. El tiempo de duplicación de la población NG97 línea celular fue de aproximadamente 24 horas a 37 ° C y la saturación de densidad celular se llegó a las 10 × 10 5 células / cm 2 (Figura 4]. La alta tasa de crecimiento se observó en las sucesivas pasajes

Discusión

En este estudio de las características básicas NG97 línea celular se describen. La línea celular fue investigado en el paso de 13 a 15. Nuestros resultados muestran que NG97 línea celular retiene la expresión de GFAP, que es un marcador fiable de astrocytic células, y la proteína S100 que fue originalmente identificado como cerebro específicas (Moore, 1965). La literatura ha demostrado, en general, una correlación negativa entre el grado de malignidad y expresión de la proteína S100 y GFA en la mayoría de los gliomas humanos (Jacques et al., 1981; Duffy et al., 1982). Sin embargo, las células son NG97 tumorigénicos en ratones desnudos, lo que indica que las células neoplásicas y son malignos. Además, estos dos marcadores bioquímicos están presentes en los xenoinjertos de NG97 células en ratones nude (Grippo et al., 2001). Curiosamente, la vimentina, que ha sido identificado en algunas líneas de células de glioma humano (Roessmann et al. 1983; Rutka et al. 1998) no era detectable en NG97 células. Hedberg y Chen (1986) encontraron que un tumor suprarrenal humanos línea celular, de nombre SW-13, expresó filamentos de vimentina y clones derivados de estas células se caracterizan por carecer de cualquier citoplásmico detectable filamentos intermedios (vim -). Más tarde, Sarria et al. (1994) demostraron que los núcleos de la SW-13 vim - células a menudo parecían ser muy dobladas, formando lóbulos prominentes y hendiduras. Sin embargo, los autores también mostraron que el efecto de filamentos de vimentina en el invaginaciones o plegable en el núcleo no es un absoluto, y plantear la posibilidad de que esta configuración nuclear podría ser un efecto indirecto de una diferencia metabólica entre las células que contienen o de la falta organizado vimentina Filamentos. A todas luces, nuestros resultados indican que NG97 línea celular en la ausencia de una red organizada de filamentos de vimentina no afecta a la forma del núcleo.

Heterogéneos tipos de células pueden encontrarse en NG97 culturas. A principios de los pasajes, las culturas creció más lento y se presentó sólo el pequeño, redondeado células. En la 13 ª pasaje, como las células dendríticas-aparecen en la cultura. No es claro para nosotros el exacto eventos que conducen a la aparición de este tipo de células en la cultura. Se postula que uno pequeño, redondeado células se acumula formando una desequilibrada divisiones extra numerary nuclear en la célula que segrega algunos productos capaces de inducir alteraciones en las otras células. Más elaborar experimentos pondría a prueba esta posibilidad. Además, como las células dendríticas de presentar numerosas y extensas prolongaciones citoplasmática, que puede estar asociado con la comunicación entre esta célula y los pequeños. Parece también que-al igual que las células dendríticas proporcionar un anclaje a la pequeña células redondeadas, que a su vez presentan un aumento en el filopodias para mejorar las conexiones de sustrato. De la nota, cuando-al igual que las células dendríticas aparecen en la cultura hemos observado un aumento de la tasa de crecimiento celular. Futuros análisis de la prueba debe de ser-al igual que las células dendríticas son capaces de modular el crecimiento celular.

Fusiforme células aparecen cuando la cultura se convierte en denso. Estas células son mayoría en monocapas y presentar un gran número de microvellosidades en la superficie que propicia un íntimo contacto con el medio ambiente. De la misma manera, otros estudios de esta célula ayudará a desvelar más secretos NG97 línea celular.

Conclusión

NG97 crecer células in vitro como tres sub poblaciones con distintas características morfológicas y apariencia, sin duda, constituyen un cometido de células gliales-line desde son positivas para GFAP y la proteína S-100. Hasta 13 º pequeño paso sólo se observaron células redondeadas en la cultura y la cinética de crecimiento es muy lento. Desde este punto, otros dos tipos de células dendríticas y presentar fibroblástica características se puede observar que los resultados se hicieron evidentes en el caso de sobrecrecimiento de las células. La posibilidad de que estas células son capaces de modular el crecimiento celular no puede ser descartado y ahora son objeto de investigación en nuestro laboratorio.

Esta línea celular puede resultar útil para los estudios celulares y moleculares, así como en los estudios de tratamiento de los gliomas.

Métodos
Glioma Cultura

NG97 células se cultivan en frascos de plástico (25 cm 2) con medio RPMI 1640 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), complementada con 50 μ M 2-ME, 2 mM L-glutamina, 100 μ g / ml garamycin y el 20% Suero bovino fetal inactivado (a medio terminar). Los cultivos fueron incubados a 37 ° C en una atmósfera que contiene 95% de aire y 5% de CO 2. El medio se cambió después de intervalos de 48 hs, y cuando llegó a la confluencia de la cultura, la subcultura se realizó por tratamiento con tripsina 0,05% y 0,02% de ácido ethylenediaminetetraacetic (EDTA).

La inmunocitoquímica

Inmuno análisis de los marcadores glial (GFAP, vimentina y proteína S-100) se realizó mediante el uso de anticuerpos específicos adquiridos de los Sistemas de Dako Envision + / HRP (Dako Corporation, Carpinteria, CA). Brevemente, las células fueron cultivadas NG97 cosechada (en el paso 15), lavarse utilizando baja velocidad de centrifugado (150 × g, 10 minutos) y ressuspended completo en medio. A continuación, las células se cito-centrifugated diapositivas sobre vidrio, secado a temperatura ambiente durante 15 minutos y fijadas en acetona fría durante 15 minutos a -20 ° C. Después de un minucioso lavado con 0,5% de BSA en PBS, las células fueron tratadas con policlonal de conejo anti-GFAP, monoclonal anti-vimentina y policlonal de conejo anti-S100 anticuerpos de acuerdo con el fabricante de 'instrucciones. El obligado principal anticuerpo fue con peroxidasa etiquetados polímero conjugado con el ratón, ya sea secundaria o de anticuerpos de conejo. Posteriormente, las láminas fueron incubadas con un sustrato mezcla de 3,3-diaminobenzidine (DAB) y el 0,02% de H 2 O 2. Las células fueron entonces counterstained con haematoxilin y eosina (HE). Control de las diapositivas que la tinción positiva para los antígenos específicos se utilizaron para asegurar correcta tinción y la estabilidad de los reactivos utilizados. Controles negativos incluyen la omisión de la primaria de anticuerpos.

Microscopía de contraste de fase

Crecimiento células se desliza sobre la cubierta se observaron con un microscopio de contraste de fase (Olympus IX50 con un PMC35Dx foto micrográfica de sistema).

El microscopio electrónico de barrido

NG97 células fueron cultivadas en la confluencia de sub 13 mm ronda cubrir slip completo en medio. Las células fueron fijadas con glutaraldehido al 2,5% y el 4% paraformaldehido en buffer fosfato (pH 7.4) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las células fueron posteriores a la fijada en el 1,0% de tetróxido de osmio (OsO 4) durante 10 minutos, lavados en buffer fosfato 0,1 M (pH 7,2) y deshidratados en una serie de etanol de grado. Cover desliza punto crítico se seca utilizando líquido de CO 2 como fluido de transición. Los ejemplares se pulverice fría recubiertos con oro y observó en un JEOL JMS 5800 LV microscopio electrónico de barrido (SEM) tensión de aceleración de 10 kV.

Curva de crecimiento

NG97 células se obtuvieron de 13 o de paso para la determinación de las curvas de crecimiento. En pocas palabras, semi confluente trypsinized culturas y las células se resuspendió en medio para completar el recuento. Células (1 × 10 4) se chapada en cada pocillo de una placa de 12 pocillos y cuenta de tres pozos se hicieron al día durante 10 días. Trypsinized células fueron contados en el hemacytometer cámara y los números fueron en promedio para cada intervalo de tiempo. Cell población duplicada en un tiempo fue calculado a partir de la fase lineal de la curva de crecimiento, y la densidad de saturación es la meseta punto de la curva de crecimiento después de la fase de crecimiento lineal.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Este trabajo es parte de una Tesis de Maestría por Camila Machado ML

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a la Sra PARA Rosemeire de Paula y la Sra Dirce Gabriel L. excelente para la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Fundo de Apoio ao Ensino e Pesquisa da Unicamp (FAEP / UNICAMP; # 210/03).