Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 21-21 (más artículos en esta revista)

Cultura de mioblastos esqueléticos humanos de donantes de edad más de 40 años: la dinámica de crecimiento de las células y la expresión de marcadores de diferenciación

BioMed Central
Andreina Baj (bajandre@libero.it) [1], Alessia A Bettaccini (mabodio@tin.it) [1], Rosario Casalone (rosario.casalone @ ospedale.varese.it) [1], Andrea Sala (andrea.sala @ Uninsubria.it) [2], Paolo Cherubino (paolo.cherubino @ uninsubria.it) [3], Antonio Q Toniolo (antonio.toniolo @ uninsubria.it) [1]
[1] Department of Clinical and Biological Sciences, University of Insubria Medical School, 21100 Varese, Italy
[2] Department of Surgery, University of Insubria Medical School, 21100 Varese, Italy
[3] Department of Orthopedics, University of Insubria Medical School, 21100 Varese, Italy

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Resumen
Antecedentes

Local myogenesis, neoangiogenesis y homing de las células progenitoras de la médula ósea parecen contribuir a la reparación del miocardio infartadas. Implantación en corazón tejidos autólogos de mioblastos esqueléticos se ha asociado con la mejora de la función contráctil en modelos animales y en seres humanos con isquemia miocárdica aguda. Desde el infarto cardíaco es más frecuente en individuos de más de 40 años de edad, verificar si la cultura métodos disponibles en nuestro laboratorio fueron suficientes para obtener un número suficiente de diferenciación de mioblastos de músculo esquelético biopsias obtenidas de pacientes de 41 años de edad a 91.

Métodos y resultados

No importa la edad de los donantes, diferenciadas las células musculares esqueléticas podrían ser producidos in vitro en cantidades suficientes para la terapia celular (≥ 300 millones). Usando desmina como citoplásmica marcador, en torno al 50% eran cultivos celulares diferenciadas a lo largo de los linajes y expresó myogenic adecuado de proteínas del músculo esquelético (miosina tipo I y II, actina, actinina, spectrin y distrofina). Citogenético no se detectaron alteraciones en las células musculares cultivadas que había experimentado al menos un 10 población doublings. Molecular métodos empleados para la detección de infecciones virales persistentes demuestran que el VHC no se replican en las células musculares cultivadas de un paciente con infección crónica por el VHC.

Conclusión

La propuesta de la cultura métodos parecen prometedores para los pacientes de mayor edad no sólo en el ámbito de la medicina cardiovascular, sino también en los campos urológicos y ortopédicos.

Antecedentes

El concepto de implantación terapéutica de las células autólogas capaz de reproducir y especializados en la diferenciación de la progenie ha generado gran interés. Este enfoque está siendo intensamente investigado sobre todo en la medicina cardiovascular para la regeneración del corazón infartadas [1]. Músculo esquelético tiene una excelente capacidad de responder a las necesidades de crecimiento, la remodelación, la actividad física, y la lesión. Desde myofibers adultos son terminales diferenciadas, la regeneración del músculo esquelético es su mayoría dependen de una población residente de células denominadas células satélite (SC). Estas células se encuentran debajo de la lámina basal, pero por encima de la membrana plasmática de myofibers [2]. Cuando fisiológicamente necesario, se activan SC, proliferar, diferenciarse y, en última fusible en myotubes que madura en myofibers [2]. El proceso de regeneración del músculo esquelético está influenciada por la naturaleza de la lesión (por ejemplo, traumática, química, isquémica), la composición de la matriz extracelular, la disponibilidad de factores de crecimiento producidos por las células inflamatorias, células vasculares, y de las neuronas motoras [3]. SC nucleares más pequeñas tienen un tamaño en comparación con los adyacentes núcleo de la myotube, y una mayor cantidad de heterocromatina nuclear en comparación con la de la myonucleus [4]. Quiescente SC muestran poco la actividad transcripcional. Después de la activación, que aparecen como una hinchazón en la myofiber con citoplásmica procesos que se extienden de uno o de ambos polos de la célula. En adultos músculos esqueléticos, SC Se ha estimado que representan el 1% y el 12% de las células en el músculo adulto. La activación de la SC durante la regeneración muscular requiere upregulation de Myf5 y MyoD, activadores de la transcripción myogenic factor regulador familia (MRF). La expresión de estos factores determina la transición de las células myogenic en mioblastos [3]. Expresión de Pax3, Pax7, Sox15, la fuerza multinacional, cyclooxygenases y otros factores de regulación es también necesaria para la activación SC [5 - 7]. Expresión de la tarde MRFs (myogenin y MRF4) precede a la producción de proteínas musculares específicos (por ejemplo, la miosina de cadena pesada y muscular creatina kinasa). Expresión del citoesqueleto (desmina) y de superficie (M-cadherina, Syndecan-3 y -4, VCAM-1, CD56, la glucoproteína Leu-19, CD34) como lo demuestra inmunoticción suele ser explotado para seguir myogenic diferenciación [3, 8, 9].

En el último decenio, la evidencia experimental que se ha ido acumulando el implante de mioblastos cultivados puede representar un enfoque eficaz para la reparación de daños miocardio [1, 10 - 12]. El beneficio funcional de intramyocardially trasplantados autóloga o heteróloga mioblastos esqueléticos se ha establecido en diferentes modelos animales (rata, hámster, ovejas) en el que el daño del corazón fue determinada principalmente por la isquemia [13, 14]. En los seres humanos, myoblast implantación ósea autólogo se ha practicado sólo en los casos de disfunción ventricular izquierda producida por el daño isquémico [15, 16]. Recientemente, el implante de mioblastos autólogos se ha propuesto también en la fijación de miocardiopatía dilatada [17], la incontinencia urinaria [18, 19], el daño muscular traumática [20], enfermedad muscular congénita [21]. Como atractivo en comparación con otros tipos de células, mioblastos esqueléticos tienen varias propiedades clínicamente atractiva, incluidas las autodonaciones de origen, la facilidad de adquisición, la suficiente capacidad de expansión in vitro, y la capacidad de diferenciación adecuada a in vivo de implantes.

El presente estudio se inició para determinar si el cultivo de células disponibles en la actualidad métodos eran adecuados para la obtención de un número suficiente de células diferenciadas de las biopsias musculares de los donantes de edad más de 40 años. Esta última condición se estableció, ya que, con la excepción de las lesiones traumáticas, la mayoría de los anteriormente enumerados condiciones clínicas surgir en pacientes mayores de 50 años. En este contexto, debe tenerse en cuenta que, para la terapia celular, un número importante de células implantables (es decir, ≥ 10 8) son necesarios dentro de 1-2 meses de la aparición de la enfermedad. Además, la ampliación de las células in vitro deben ser suficientemente diferenciadas a lo largo de los linajes myogenic, libre de alteraciones genéticas demostrable, y libre de contaminantes macromoléculas [22] y de los microorganismos.

Métodos
De células de los donantes y de la cultura de las células del músculo esquelético

Salvo que se especifique lo contrario, los reactivos químicos, medios de cultivo de tejidos, las enzimas y los factores de crecimiento humana recombinante se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Plasticware se obtuvo de los Halcones (Becton Dickinson, de Milán, Italia). Certificado de doble filtrado de suero fetal bovino (SFB) producidos en un país libre de EET se obtuvo de HyClone (Logan, UT). Cinco pacientes de 41 a 91 años de edad dieron su consentimiento informado para la biopsia muscular en el curso programado de corazón o cirugía ortopédica. Biopsias musculares de por lo menos 1 cm de longitud fueron obtenidos en la abdominal o recto del cuádriceps femoral. Los especímenes fueron despojado de la grasa visible y tejido conectivo y ponderada. Cada biopsia proporcionado 0,6 a 1,9 g de tejido muscular. El tejido se sumerge en una pequeña alícuota de Hepes de búfer Ham's F12 suplementado con imipenem, vancomicina y anfotericina B (en la persona de concentración de 10 mg / L), con fuerte picada tijeras para obtener fragmentos de aproximadamente 1 mm de diámetro. Digestión enzimática se llevó a cabo en medio Ham's F12 que contiene 1,5 mg / ml Pronase E (inespecífico de la proteasa Streptomyces griseus), más el 0,03% EDTA a 37 ° C durante 30 min con agitación ocasional. Después de 5 minutos de sedimentación en 1 g, el sobrenadante fue recogido y almacenado a temperatura ambiente. Pildoradas tejido desechos fueron sometidos a ciclos de 2-3 además de lo anterior proceso de la digestión. Cobrados sobrenadantes fueron filtradas a través de un 100 μ m de malla de nylon (Becton Dickinson) y se centrifuga a 400 g durante 8 min. El pellet se resuspendió suavemente en la proliferación medio (PM). Células viables se determinó por el método de exclusión con azul de tripan. PM consistía en una mezcla de 1:1 de Dulbecco modificado Eagle's F12 medio y medio (DMEM/F12), que contiene L-glutamina (2 mM), penicilina (50 unidades / ml), gentamicina (50 mg / L), y completada con: 18% de SFB inactivado por calor, gamma-irradiados fetuin bovina (50 μ g / ml), Hu recombinante EGF (10 ng / ml), Hu bFGF recombinante (1 ng / ml), Hu insulina recombinante (10 μ g / ml), la dexametasona (0,4 μ g / ml). Diferenciación medio (DM), que consiste en DMEM/F12 complementado con antibióticos, el 10% de SFB y Hu insulina recombinante (10 μ g / ml). Suspensiones de células obtenidas de cada una biopsia fueron inicialmente chapada en dos o más frascos T-75 (es decir, ≥ 150 cm cuadrados) en función del peso de los tejidos procesados. Culturas fueron incubadas a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2. Treinta y seis horas después de la galvanoplastia, adherente suavemente las células fueron lavadas y el medio de cultivo se cambió. Célula de pasajes se realiza por la luz del tratamiento con tripsina-EDTA en el momento apropiado indicado por la observación microscópica (es decir, 70-80% monocapa confluency). El primer paso se llevó a cabo de 6 a 10 días después de la galvanoplastia. Para minimizar myogenic diferenciación en myoblast mayor densidad, pasajes posteriores se realizaron cada 3-4 días.

La proliferación de las células

Antes de cada paso, las culturas se examinaron con un microscopio invertido equipado con una cámara digital. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 10 × azar 8-10 campos por la cultura y la registraron. El recuento de las células adherentes se obtuvieron con un sistema computarizado de análisis de imágenes (Image PP; Amplimedical, Mira, IT) y expresada como número de células por milímetro cuadrado. Después de trypsinization, el número de células viables se determinó por el método de exclusión con azul de tripan. Los dos métodos fueron concordantes con los resultados de un acuerdo en el 12%. Los resultados se expresan como el número total de células viables en distintos momentos después de la iniciación cultura.

Inmunomarcación de la célula muscular monocapas

Monocapas de células que se había ampliado de 35 a 40 días en la tarde y se trypsinized chapada con PM en la sala de dos y diapositivas (Nunc; PBI, de Milán, Italia). Dos-tres días más tarde, después de eliminar con cuidado el medio, monocapas de células fueron fijadas con paraformaldehido fría 2,5% en buffer fosfato-salina (PBS) durante 15 min a 4 ° C, lavadas con PBS, permeabilized con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 15 min, se lavan de nuevo con PBS y bloqueado durante 60 min en buffer TRIS-salina (50 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH7.6), que contiene 0,2% de BSA, el 0,2% de SFB, el 0,01% de Tween 20, 0,01% de azida sódica [Ensayo de inmunofluorescencia (IFA) de amortiguación]. Un ratón anticuerpo monoclonal (mAb) a la intermedia de filamentos de desmina (clon D33) que se expresa durante el desarrollo muscular se obtuvo de DakoCytomation (Milán, Italia). MAbs esquelético a la miosina de cadena pesada lentitud de tipo I (clon NOQ7.5.4D; concretas para frenar la miosina HC de músculo cardíaco y esquelético), esqueléticas miosina de cadena pesada tipo II rápido (clon MI-32; específica para una rápida HC de la miosina esquelética, pero no Cardíaca o del músculo liso), A-actina sarcomérica (clon C5C; específicas para alfa-esqueléticos y alfa-actina cardíaca), A-sarcoméricas actinina (clon EA-53; específicas para alfa-alfa-esquelético y cardíaco actinina localizado en la Z Banda) se obtuvieron de Sigma-Aldrich. MAbs a spectrin (clon RBC2/3D5; específicas de los eritrocitos y músculo se utilizó como un marcador de la integridad de membrana) y la varilla de dominio mediados de distrofina (clon Dy4/6D3; específicas para el esquelético, cardíaco y el músculo liso de que las formas de distrofina Anclas el citoesqueleto a la membrana plasmática) se obtuvieron a partir de Novocastra Laboratories (Newcastle upon Tyne, Reino Unido). Monocapas de células fueron lavadas con buffer de IFA y se incubaron 60 min con el anticuerpo primario a temperatura ambiente. Después de tres lavados con buffer de IFA, láminas fueron incubadas con FITC-etiquetados ovejas IgG anti-ratón (diluido 1:800 en azul Evans contienen buffer) por 60 min en la oscuridad. Después de tres lavados más, diapositivas montadas con un anti-fundido que contiene medio (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se examinaron con un microscopio de fluorescencia (BX60; Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara digital (Nikon, Tokio, Japón) . Frente al citoplasma de las células que muestra tinción fueron contados en la magnificación × 200-400. Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas sobre el número de células examinadas (por lo menos 500 células por diapositivas fueron contados; experimentos fueron por duplicado).

Análisis citogenético

Cuando más de 3 × 10 8 células viables fueron obtenidos por cultivo in vitro (es decir, más de-35 días post-plating), una alícuota de cada cultura se trypsinized y chapada en dos diferentes cámara de diapositivas. Las células fueron cultivadas en la tarde, tratados con colchicina durante 30 min, sometido a tratamiento hipotónico, fijados en metanol: ácido acético (3:1), y se procesa de acuerdo con los métodos estándar [23]. Cincuenta metafases fueron analizados por QFQ de bandas-con un sistema automatizado de citogenética (Genikon; Nikon) siguiendo las normas del Sistema Internacional de Nomenclatura citogenética Humanos [24].

Screening importante de los virus humanos

En el momento de la biopsia muscular, muestras de sangre de cada paciente fueron analizadas para VHB, VHC, VIH y marcadores de la serología convencional (DiaSorin, Saluggia, Italia) y por pruebas moleculares (Cobas Amplicor, Roche Diagnostics, Monza, IT). Cuando más de 3 × 10 8 células viables se había obtenido in vitro por expansión, una parte alícuota de cada cultura fue probado por métodos de amplificación de genes para la importante presencia de los virus humanos capaces de causar infecciones persistentes. Se extrajo el ADN de un congelado alícuota de 0,5 ml que contienen PM 3 × 10 6 células utilizando un kit comercial (QIAamp DNA mini kit de sangre; Qiagen, Milán, Italia). Se utilizó PCR para detectar el genoma de los virus de ADN humano (CMV, EBV, HBV, parvovirus B19). ARN total fue extraído a partir de 3 × 10 6 células por el método de tiocianato guanidinium (Life Technologies, Gaithersburg, MD). CDNA se obtuvo de 2 μ g de ARN con Mo-MLV transcriptasa inversa junto con hexamer cebadores aleatorios (Clontech, Palo Alto, CA). RT-PCR se utilizó para detectar el VIH y el VHC genomas. Cobas Amplicor rutina de los métodos se utilizaron para el VHB, el VHC y el VIH. Publicado primers se utilizaron para detectar CMV, EBV, y parvovirus B19 genomas [25]. La sensibilidad de los métodos empleados fue ≤ 100 genómica equivalentes / reacción. CMV, EBV, el parvovirus B19 y los amplificados fueron analizados en gel de agarosa al 2% mediante la tinción de bromuro de etidio y se fotografiaron en un Transiluminador con la ayuda de una cámara digital (Kodak Image estación 440CF; Celbio, Pero, IT). Muestras clínicas positivas para EBV, CMV, VHB, parvovirus B19, el VHC, o el VIH-1 se utilizaron como controles positivos. La amplificación de la beta-globina (PCR) o GAPDH (RT-PCR) se ha utilizado para normalizar los datos.

Resultados
El crecimiento de cultivos de células musculares primarias

Como se muestra en el Cuadro 1, la edad de los donantes de células musculares varió de 41 a 91 años. Los centros de tejidos obtenidos a partir de cada una biopsia ponderados entre 0,6 y 1,9 g. La cinética de crecimiento de las células usando las condiciones de cultivo descrito se ilustra en la Figura 1. Treinta y seis horas después de galvanoplastia, el número de células adherentes presentes en cultivos primarios de los 5 pacientes investigados varió de 0,16 a 1,58 millones. Pico de células expansión se produjo entre el día-42 días-49 y de la cultura. En estos tiempos, el número total de células viables en cultivo varió de 446 a 1739 millones. De 42 a 49 días posterior a la galvanoplastia, el número total de células viables tendido a una meseta. Curiosamente, existe una relación directa entre el peso inicial de bioptic tejido y el máximo número de células in vitro ampliado. Esto es evidente al comparar los tejidos pesos reportados en la Tabla 1 con la cinética de datos de la Figura 1. El número medio de células doublings población que se requiere para alcanzar el número de células pico, fue 11,24 ± 0,73 (media ± DE, de 5 de primaria de diferentes culturas). Calculado significa tiempos de duplicación celular investigado cultivos primarios varió de 3,56 a 4,60 días. En general, la media del tiempo de duplicación de la célula fue 3,98 ± 0,38 días (media ± DE, n = 5). A partir de estos datos, no hay relación aparente entre la edad de la célula donante y la media del tiempo de duplicación de células en cultivo (Cuadro 1]. En virtud de los empleados condiciones de cultivo, el promedio de veces más el número de células adherentes contados-1,5 en el día posterior a la era enchapado 2490 (gama 1096 - a 3.631 veces).

Los aspectos morfológicos de primaria de las culturas humanas músculo esquelético se muestran en la Figura 2. La morfología de adherente SC se muestra en la Figura 2A (día-5 post-plating). Figuras 2B y 2C muestran monocapas de células cultivadas en la tarde para 7 y 10 días, respectivamente. La experiencia con el músculo culturas de los adultos donantes muestra que la evolución de las condiciones ambientales de mioblastos cultivados de PM a DM es seguida por la fusión de células dentro de unos días. La fusión se utiliza sólo para confirmar la presencia de mioblastos. Confluentes de mioblastos en el proceso de fusión para formar myotubes se muestra en la Figura 2D.

Expresión de marcadores de diferenciación de las células musculares cultivadas

La expresión de determinados marcadores de músculo esquelético fue investigado por inmunofluorescencia indirecta fijo en monocapas de cultivos primarios in vitro para la ampliación de 35 a 40 días. El cuadro 2 muestra el promedio de reacción primaria de las culturas con diferentes anticuerpos anti-músculo. El general de la positividad con anti-desmina mAb (un marcador de filamentos intermedios que manchas de las células musculares, pero no fibroblastoid células) era del 49,6% (rango 40 a 53%), lo que indica que aproximadamente la mitad de la in vitro de células ampliado población diferenciados a lo largo de Myogenic el linaje. Como se muestra en el Cuadro 2 y Gráfico 3, los anticuerpos para el núcleo myofibrillar proteínas miosina tipo I lento y A-sarcoméricas producido en bandas de filamentos de actina y las imágenes teñidas de aproximadamente un tercio de mioblastos cultivados. Miosina tipo II rápido (específicas para esqueléticos, pero no las células del músculo cardíaco) y A-sarcoméricas actinina anticuerpos manchadas filamentos más continua producción de un patrón en un 20-30% de las células. El patrón de manchas producidas por anticuerpos spectrin distrofina y fue notablemente diferentes, ya que se limita esencialmente a la periferia de la membrana de las células y parches en el 30-40% de las células.

Cariotipo de las células musculares cultivadas y la detección de los virus humanos

Análisis citogenéticos y de la búsqueda de los virus humanos se realizaron en cultivos de células musculares cultivadas en la tarde de 35 a 40 días. Normal diploide cariotipos se obtuvieron del músculo culturas de todos los pacientes investigados. La figura 4 muestra un representante metafase normal y el cariotipo de los pacientes de sexo masculino # 5.

En el momento en que las culturas son objeto de análisis citogenético, las muestras fueron también procesadas para la detección de patógenos virales humanos. Después de la extracción de DNA y RNA, PCR y RT-PCR se utilizaron los métodos para detectar el genoma de CMV, EBV, HBV, parvovirus B19, el VIH y el VHC. Todas las culturas dieron resultados negativos al virus con primers específicos. La amplificación de beta-globina (PCR), GAPDH (RT-PCR), y virus de controles positivos constantemente dio los resultados esperados (datos no presentados). En el momento de la biopsia muscular, la RT-PCR ha demostrado que los pacientes # 4-VHC fue positivo tanto en la sangre (53000 equivalentes de genoma / ml) y en la biopsia muscular. Curiosamente, el genoma del VHC no se detectó en las células musculares cultivadas obtenidas de la biopsia a su paso los números 3, 6, y 9, lo que indica que el VHC no se replican en cultivos de células musculares.

Discusión

Actualmente dispone de técnicas de cultivo de tejidos permiten procesar biopsias de músculo esquelético de los pacientes tienen más de 40 años como para obtener un gran número de aislados (no fusionados) células que se diferencian a lo largo de myogenic linajes. Local myogenesis, neoangiogenesis y homing de las células progenitoras de la médula ósea parecen contribuir a la reparación de muy infartadas miocardio [16, 26]. Implantación de mioblastos esqueléticos [27, 13, 28], y los factores de protección angiogenéticas [29 - 31], las células madre hematopoyéticas [10], ha sido asociada con la mejora de la función contráctil en diferentes modelos animales de infarto de miocardio. Implantación de mioblastos esqueléticos también ha sido propuesto para nonischemic cardiomiopatía [17]. Notas de advertencia sobre el uso de médula ósea procedentes de células madre para la regeneración del corazón derivan de los últimos experimentos en ratones en los que las células autólogas hematopoyéticas no son capaces de diferenciar en cardiomiocitos y no proporciona beneficios en el transcurso del simulacro funcional tratados de control de animales [32, 33].

En los seres humanos, los estudios clínicos de fase I comenzar a demostrar los beneficios clínicos de trasplante autólogo myoblast [22, 12, 34, 14, 15, 11] y, en menor medida, de la autotransfusión mesenquimales y células hematopoyéticas [16, 35, 36] .

Con el fin de hacer posibles aplicaciones clínicas a mayor escala, las condiciones de los seguros y reproducible in vitro expansión de los humanos músculo esquelético debe ser ajustado. Con este fin, cinco puntos son de particular relevancia: 1) el tratamiento de bioptic de tejidos como el músculo adecuado para obtener células madre; 2) la utilización de medios de cultivo libres de componentes no humanos, 3) los métodos para evaluar la diferenciación de las células cultivadas a lo largo de myogenic Linajes, 4) a los métodos de pruebas alteraciones genéticas de las células que se implanta; 5) los métodos para asegurar la ausencia de microorganismos patógenos (virus que causa infecciones persistentes y de los agentes de las EET). En el presente estudio, varias de estas condiciones se han cumplido. Bioptic especímenes han sido procesados con una amplia difusión bacteriana proteasa con resultados agradables. Selección preliminar de las células madre de músculo-activado por fluorescencia de clasificación y / o anticuerpos no se ha intentado en este estudio, pero parece prometedor [37]. El medio empleado se ha complementado con el seleccionado cuidadosamente los factores de crecimiento humana recombinante. Además de fetuin de SFB y sin embargo sigue siendo indispensable. Recientemente, los medios de comunicación complementado con suero autólogo humanos que se han propuesto y parece estar asociado con resultados clínicos superiores [22]. En particular, no se informó de arritmias malignas entre los 20 pacientes y el post-LV infarctual fracción de eyección mejoró significativamente. Myogenic diferenciación de mioblastos humanos obtenidos con la técnica propuesta ha sido comparable a lo informado por otros. Uso de desmina en el citoplasma de marcador, aproximadamente el 50% de las células cultivadas de los adultos a lo largo de los donantes fueron diferenciadas myogenic linajes. Este resultado es comparable a lo que se informó anteriormente, ya sea usando el marcador desmina [9] o el marcador CD56 de superficie [15]. Caracterización detallada reveló que amplió cultivos de células musculares mantenido la habilidad para expresar las proteínas del músculo esquelético adecuado (miosina tipo I y II, actina, actinina, spectrin y distrofina). Desde la regulación de la miosina pesada cadena de la expresión génica está fuertemente regulada por transcripcional acontecimientos y por el ejercicio físico [38], y dado que en los sujetos de edad las fibras musculares co-expresión de la miosina tipo I y tipo II miosina son más frecuentes que en los sujetos jóvenes [39] , Inmunomarcación de las células cultivadas in vitro, no debe esperarse que estrictamente reproducir lo observado en secciones de tejido.

De particular interés para aplicaciones clínicas citogenético es que no se detectaron alteraciones en las células cultivadas que había experimentado al menos un 10 población doublings. Esto es especialmente tranquilizador ya que el investigado se obtuvieron muestras de los adultos / viejos donantes y las alteraciones cromosómicas, se sabe que se producen a una mayor frecuencia en los tejidos de adultos / viejos pueblos [40]. En estudios futuros, la nueva tecnología podría ofrecer CGH superior, de menor sensibilidad para la detección de los cambios citogenéticos [41]. Por último, métodos moleculares para el común de la humanidad virus están ampliamente disponibles y deben ser empleadas en los ensayos clínicos humanos para validar myoblast culturas antes de la implantación. De interés, la observación es la oportunidad de que el VHC no replicar en una cultura musculares derivados de un donante con infección por el VHC. Este resultado está de acuerdo con las observaciones experimentales que muestran que el VHC no tiene efectos en el hígado miofibroblastos [42].

Conclusión

Los resultados indican que en alrededor de un mes es posible producir in vitro de aproximadamente mil millones de debidamente diferenciadas las células del músculo esquelético de los donantes humanos, independientemente de la edad. La experiencia clínica indica que aproximadamente 300 millones de autotrasplante de células musculares esqueléticas son suficientes para la terapia celular del corazón infartadas [15, 14]. Por lo tanto, una intervención temprana puede ser posible por la tramitación de una biopsia de músculo de alrededor de 2 gramos. La propuesta de métodos de cultivo de tejidos también pueden constituir una base sobre la que se prevé aplicaciones en el ámbito urológico, [18, 19] y ortopédicos campos [20, 21].

Lista de abreviaturas utilizadas

BFGF base el factor de crecimiento fibroblástico

DM differentitation medio

DMEM/F12 Dulbecco modificada Eagle medio más Ham's F12 medio

FEAG del factor de crecimiento epidérmico

FBS suero bovino fetal

FITC fluoresceine isotiocianato

HCV virus de la hepatitis C

IFA ensayo de inmunofluorescencia

PM proliferación mediano

QFQ quinacrina bandeo cromosómico

SC células satélite

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Concepción y diseño del estudio (AQT, AS, PC); Desarrollo de los métodos de cultivo de tejidos y la detección de virus (AQT, AB, AAB); El estudio genético de las células cultivadas (PO); Manuscrito preparación (AQT, AB, AS, PC ). Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

El trabajo apoyado por: Banca del Monte di Lombardia (BML, de Milán, Italia) y el Centro de Neurociencias de la Universidad de Insubria (Varese, Italia). A. Baj es un doctorado Estudiante de la Universidad de Pavia, Italia. AA Bettaccini cuenta con el apoyo de una beca de la Escuela de Medicina de la Universidad de Insubria (Varese, Italia).