Behavioral and brain functions : BBF, 2005; 1: 5-5 (más artículos en esta revista)

La exposición prenatal al alcohol no afecta el aprendizaje y el laberinto radial hipocampo musgo en tres tamaños de fibra puras cepas de ratón

BioMed Central
Frans Sluyter (frans_sluyter@yahoo.co.uk) [1], Laure Jamot (ljamot@trophos.com) [2], Jean-Yves Bertholet (berthole@biomedicale.univ-paris5.fr) [3], Wim E Crusio (Wim_crusio@yahoo.com) [4]
[1] Social, Genética y del Desarrollo Centro de Investigación de Psiquiatría del Instituto de Psiquiatría Kings College de Londres, Reino Unido
[2] Trophos SA Parc Scientifique de Luminy - Case 931 13288 Marseille Cedex 09 Francia
[3] Institut de Psychologie Centro Henri Piéron Universidad de París V 71 avenue Edouard Vaillant 92100 Boulogne-Billancourt Francia
[4] Laboratoire de Neurosciences Cognitives, CNRS UMR 5106 Avenue des Facultés 33405 Talence Francia

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Resumen
Antecedentes

El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la exposición prenatal alcohol-laberinto radial sobre el aprendizaje y la neuroanatomía hipocampo, en particular a la dimensión de las intracomunitarias y infrapyramidal musgo de fibra (IIPMF) terminal campos, en tres cepas puras de ratones (C57BL/6J , BALB / cJ, y DBA/2J).

Resultados

A pesar de que prevé una modificación de los tamaños de aprendizaje y IIPMF, no se detectaron efectos. La exposición prenatal de alcohol, sin embargo, interferir en la reproducción en animales C57BL/6J y disminución de peso corporal y el cerebro (en la interacción con el genotipo) en la edad adulta.

Conclusión

La exposición prenatal de alcohol influyó en el laberinto ni radial ni el tamaño de la terminal IIPMF campos. Creemos que la investigación futura debe apuntar a diferentes objetivos, ya sea cuando se utilizan modelos de ratón para el síndrome de alcohol fetal (por ejemplo, más complicado paradigmas de comportamiento, diferentes subestructuras hipocampo, el cerebro u otras estructuras), o la participación de diferentes modelos de animales.

Antecedentes

Desde hace tiempo se sabe que la exposición prenatal al alcohol puede tener efectos devastadores. En 1968, Lemoine et al. Publicó un documento, en francés, que se describe "des anomalías dans les alcooliques padres de los lactantes" [1]. Cinco años más tarde, Jones y Smith [2] seguido con su ahora clásico documento sobre el síndrome de alcohol fetal (FAS), que es el nombre dado a un grupo de física y mental de defectos de nacimiento que son el resultado directo de una mujer bebe alcohol durante el embarazo. Estos defectos pueden incluir retraso mental, deficiencias en el crecimiento, disfunción del sistema nervioso central, anormalidades craneofaciales, y desajustes de comportamiento (para una enumeración, véase, entre otros, [3], y http://www.acbr.com/fas/index. Htm].

Desde entonces literalmente miles de estudios y se han hecho importantes avances en el conocimiento del FAS se han hecho, no menos en la causa de los modelos animales, entre ellos el ratón [4, 5]. Estos modelos fuertemente paralela a la respuesta fisiológica de alcohol en el desarrollo humano y han dado lugar a valiosos conocimientos en la susceptibilidad al alcohol de partes específicas del embrión en desarrollo. Una de las regiones más vulnerables del cerebro, por ejemplo, es el hipocampo, que se cree es una de las principales metas de prenatal de alcohol y, por tanto, responsable de muchas alteraciones neuroconductuales [6]. Así, Riley et al. [7] encontró efectos de la exposición prenatal del alcohol sobre el comportamiento a ser similares a los de las lesiones del hipocampo, mientras que la disfunción del hipocampo como consecuencia de la exposición prenatal de alcohol también se ha evaluado en el aprendizaje espacial tareas como la navegación Morris agua tarea (véase, entre Otros, [8]]. Sin embargo, se ha prestado poca atención a la vulnerabilidad genética del embrión en desarrollo a la exposición prenatal de alcohol, en particular, genéticamente determinada, las diferencias en la sensibilidad de los países en desarrollo hipocampo. Estas diferencias podrían genéticamente determinado, al menos en parte, explicar una de las preguntas más importantes en la etiología de la FAS: ¿por qué sólo un pequeño porcentaje de mujeres alcohólicas dan a luz a niños con FAS fetal, mientras que otras bebidas alcohólicas, las mujeres que la misma no importe.

El objetivo de este estudio fue determinar si los diferentes genotipos con distinto hipocampo opuestamente anatomía son afectados por la exposición similar a la del alcohol prenatal. Con este fin, las mujeres embarazadas de tres cepas de ratón muy puras, C57BL/6J, BALB / cJ, y DBA/2J, que varían en la anatomía del hipocampo (por ejemplo [9, 10]], fueron expuestos a un 12% de alcohol como su solución Única fuente de líquido en toda la gestación. A raíz de esto, los hijos varones se puso a prueba por su capacidad para dominar de ocho brazo radial laberinto, una tarea de navegación espacial conocido a depender de una intacta hipocampo. Posteriormente, los animales fueron sacrificados y los tamaños de las hipocampo intra e infrapyramidal musgo de fibra (IIPMF) terminal fueron determinados campos. Necesarios grupos de control (sin tratamiento y par-alimentado).

Resultados

El cuadro 1 muestra el número de parejas reproductoras utilizado (emparejamientos), el número de embarazos en parejas resultantes, y el número de embarazos que conduzca a nacidos vivos en los nueve diferentes (3 × 3 grupos de cepas). Aunque el etanol expuestos C57BL/6J mujeres se quedan embarazadas a tasas similares de otros animales, como los grupos de tratamiento y de las cepas, estos embarazos como resultado significativamente menor nacidos vivos que en la par-alimentados y grupos de control (χ 2 = 9,5, df = 2, p < ; 0,01).

La Figura 1 muestra el número total de errores (resumió desde el día 3 hasta el día 5). Sólo la cepa de origen afectados esta variable (F 2,96 = 5,0, p <0,01). C57BL/6J hizo menos errores que BALB / c (z = 3,2, p <0,01) y DBA / 2 (z = 2,5, p <0,05). El tratamiento no tuvo efecto alguno, ni solo, ni en la interacción con la cepa. La Figura 2 muestra el funcionamiento velocidades radiales en el laberinto. Similar a la cantidad de errores, sólo la cepa de origen afectados esta variable (F 2,96 = 13,9, p <0,001), de nuevo con C57BL / 6 machos diferentes de las otras dos cepas (vs BALB / c: z = 5,0; P <0,001; vs DBA / 2: z = 4,8, p <0,001).

Cuerpo y el cerebro pesos se presentan en las figuras 3 y 4, respectivamente. El origen de la cepa influido en ambas variables (peso corporal: F 2,96 = 104,3, p <0,001; cerebro peso: F 2,91 = 86,1, p <0,001). BALB / c pesaba más de C57BL / 6 (z = 3,1, p <0,01) y DBA / 2 (z = 14,2, p <0,001). Esta última cepa, a su vez, pesaba menos de C57BL / 6 (z = 7,2, p <0,001). C57BL / 6 varones tuvieron mayor cerebro pesos que BALB / c (z = 5,0, p <0,001) y DBA / 2 (z = 11,7, p <0,001). Además, BALB / c había cerebrales superiores pesos que DBA / 2 (z = 9,1, p <0,001). La exposición prenatal al alcohol afectados ambas variables. Pesos corporales fueron afectados con independencia del origen del genotipo (F 2,96 = 6,6, p <0,01) con ratones expuestos a etanol prenatal que pesen menos de control (z = 3,5, p <0,01) y par-alimentados (z = 3,2, p <0,001) los animales. El efecto sobre el peso del cerebro depende de los antecedentes de la cepa (cepa × tratamiento: F 4,96 = 3,8, p <0,01). Esta interacción efecto fue causada principalmente por la BALB / c cepa donde prenatal de alcohol disminuyó cerebro de peso (frente a par-alimentado: z = 3,6, p <0,001; vs control: z = 3,1, p <0,01), mientras que no se Se observaron efectos significativos en las otras dos cepas.

Los resultados del hipocampo datos se presentan en la Tabla 2 y Figura 5. Cuele se observaron efectos de las siguientes variables: regio inferior (F 2,73 = 8,0, p <0,001), el estrato lacunosum-moleculare (F 2,73 = 18,9, p <0,001), el estrato radiatum (F 2,73 = 5,6, p <0,01), suprapyramidal MF (F 2,73 = 6,0, p <0,01) y IIPMF (F 2,73 = 132,0, p <0,001). DBA / 2 mostraron una menor regio inferior de lo C57BL / 6 (z = 3,7, p <0,001) y BALB / c (z = 2,9, p <0,001). C57BL / 6 mostraron un mayor estrato lacunosum-moleculare que DBA / 2 (z = 6,1, p <0,001) y BALB / c (z = 4,3, p <0,001), mientras que BALB / c hombres tenían un mayor estrato lacunosum-moleculare Que DBA / 2 machos (z = 2,4, p <0,05). C57BL / 6 exhibieron menor estrato radiatum y suprapyramidal MF que DBA / 2 (z = 3,3, p <0,01 y z = 3,4, p = 0,001) y BALB / c (z = 2,4, p <0,05 y z = 2,8; P <0,01). C57BL / 6 mostraron mayor tamaño que IIPMF DBA / 2 (z = 16,2, p <0,001) y BALB / c (z = 10,8, p <0,001). BALB / c había IIPMF tamaños más grandes que los DBA / 2 (z = 7,0, p <0,001).

La exposición prenatal de alcohol no afecta a ninguna de las variables hipocampo, ni como principal factor, ni en la interacción con el fondo.

Discusión

Estos datos demuestran que, en tres cepas puras de ratones (C57BL / 6, BALB / c, y DBA / 2), la exposición prenatal al alcohol no afecta ni la memoria espacial ni hipocampo neuroanatomía. La exposición prenatal de alcohol hizo el cuerpo y el cerebro influyen en el peso y en algunas cepas reducido drásticamente las tasas de nacidos vivos en C57BL / 6 animales.

Una primera advertencia es, por supuesto, la observación de que el bajo número (2) de C57BL / 6 cachorros prenatalmente expuestos a etanol se opone a que existan conclusiones de que la cepa. Todavía decidió incluir estos animales en el presente informe porque simple inspección visual de los datos muestra que incluso en el caso de estos dos solos supervivientes ni siquiera existe una tendencia hacia las diferencias en el comportamiento o la morfología del hipocampo, como es el caso de los otros dos Cepas. Por supuesto, los tamaños de las muestras son mucho más adecuados para las cepas BALB / c y DBA / 2, de manera que las conclusiones sobre la base de esas cepas son mucho más fuertes.

En resumen, nuestros resultados sobre el comportamiento de ambos neuroanatomía y parecen no estar en consonancia con los que, por ejemplo, que se resumen en Berman y Hannigan [11], que llegó a la conclusión de que la exposición prenatal alcohol constantemente producido importantes déficits en el aprendizaje espacial y / o la memoria. Un vistazo más de cerca, sin embargo, reveló que la mayoría de los estudios en animales sobre los efectos de la exposición prenatal de alcohol se han llevado a cabo en ratas y ratones no. Por ejemplo, una encuesta reciente de la literatura, utilizando PubMed, reveló pocos los estudios que utilizaron ratones como modelos experimentales para la exposición prenatal de alcohol, y, a nuestro conocimiento, no existen estudios que participan múltiples (> 2) endocriadas de ratones en el análisis de Las relaciones cerebro-conducta con respecto a la exposición prenatal de alcohol. Que sólo hemos podido encontrar un estudio [12] que incluía dos cepas puras (C57BL/10 y DBA / 1), que reaccionaron de manera diferente a la exposición temprana de alcohol. Por ejemplo, el campo abierto, la actividad se redujo en C57BL/10, pero no en DBA / 1 de los ratones, mientras que la agresión es más afectados en DBA/1s. La mayoría de los estudios del ratón, sin embargo, investigó los efectos de la exposición prenatal del alcohol sobre diversos aspectos neuroconductuales en una sola cepa, a saber, C57BL / 6 ratones. Así, Opitz et al. [13] intubados embarazadas C57BL / 6 hembras con alcohol de 14-18 días de gestación y se investigó si esta afectado el laberinto radial en su descendencia. Como fue el caso en el presente estudio, ningún efecto de la exposición prenatal de alcohol en el laberinto radial fue encontrado y podría, por lo tanto, se llegó a la conclusión de que el laberinto radial no está afectado por la exposición prenatal de alcohol en ratones. Se debe tener en cuenta, sin embargo, que podría haber otras razones por las cuales este efecto no se observa. Una posibilidad es que los niveles de alcohol en la sangre eran bajos en este estudio, un argumento planteado igualmente por Opitz et al. En su discusión de sus datos [13]. Desde que decidió no molestar a los embarazos, tomando muestras de sangre (la razón es que el estrés prenatal se convertirá en un factor de confusión), no hemos podido determinar la concentración de etanol en sangre (BAC). Por ello, 'nuestro' BAC podría haber sido demasiado baja para tener un efecto. Sin embargo, el peso del cerebro, así como el peso se vieron afectados en estos experimentos por la exposición prenatal al alcohol, un hallazgo que recuerda Wainwright et al. [14]. Además, los nacidos vivos se redujo drásticamente en los C57BL / 6, pero los dos cachorros machos que obtuvo fueron fenotípicamente completamente normal. Hay que señalar, además, que la concentración de alcohol utilizados en el presente estudio fue casi tres veces mayor que los utilizados por los autores anteriores [15, 16], que informaron de efectos significativos sobre la BAC (35-100mg/dl) en sus ratones hembra. Un estudio más reciente en la que las concentraciones de etanol lentamente se aumentó a 10% durante el embarazo mostró aún mayor BAC en la madre (que varían de 50 a 150 mg / dl) [17]. Tomados en conjunto estos resultados hacen que sea muy poco probable que el etanol no es suficiente el desarrollo de los embriones a que se había llegado a tener efectos significativos.

Otra explicación de la falta de un efecto en el aprendizaje puede ser que este tipo de laberinto radial no es lo suficientemente exigente, y que otras pruebas de aprendizaje espacial sería más apropiado para la detección prenatal de alcohol efectos. Sin embargo, Wainwright et al. [14] No se observó ninguna aparente efectos de la exposición prenatal del alcohol sobre las medidas de rendimiento en una tarea de navegación agua F2 en un cruce entre C57BL / 6 y DBA / 2 machos. Por lo tanto, otros tipos de pruebas de aprendizaje, menos espacial, como el rompecabezas de la casilla [18], tal vez podría revelar efectos del alcohol prenatal. A este respecto, es interesante observar que en los adultos C57BL / 6 ratones de la exposición prenatal de alcohol debilita la eficacia de reinforcers [15], perjudica el desarrollo de la aversión condicionada al sabor [13], y aumenta la sensibilidad a la anfetamina [16]. También queremos señalar que la tarea radial-laberinto utilizado aquí es muy sensible y ha sido utilizado con éxito en el pasado para mostrar los defectos de aprendizaje que no, o apenas, detectables en una tarea de navegación del agua [19]. Una alternativa para explicar la ausencia de efectos podrían ser las especies de ratones con características específicas que es menos vulnerable al alcohol per se que las ratas. Cabe señalar, sin embargo, que otros tratamientos que afectan a la fibra de musgo hipocampo proyecciones, como postnatal temprano hipertiroidismo, han neuroanatómica similares (y de comportamiento) en la rata y el ratón [20, 21]. Una última posibilidad es que los efectos dependen de la edad de los ensayos. Por ejemplo, podría haber una ventana de tiempo, en la que los efectos sean visibles. Cualquiera de los efectos podría ser temporal o puede que sólo aparecen en una edad más avanzada (ver [11] para una discusión).

Otro resultado llamativo de este estudio es la baja tasa de ejecución de C57BL/6J mujeres. De los 13 embarazos sólo una mujer dio a luz a una camada viable. Los otros doce dado lugar a embarazos aún cachorros nacidos, o de la madre murió al dar a luz, o se comen las crías de sus madres inmediatamente después de su nacimiento. Ya sea que este hallazgo refleja una mayor sensibilidad en el desarrollo de los embriones C57BL/6J al alcohol o las concentraciones más altas de alcohol en la sangre de la madre o una combinación de ambos no puede inferirse de estos experimentos. Aunque la camada nacida sólo podría no ser una muestra representativa, los machos de esta basura apareció para llevar a cabo igualmente bien en el laberinto radial como su par-alimentados y control de las contrapartes; tampoco lo fue el tamaño de la terminal IIPMF campos afectados.

Conclusión

Resumiendo, en este diseño experimental, que utiliza tres diferentes cepas puras de ratones, la exposición prenatal de alcohol influyó en el laberinto ni radial ni el tamaño de la terminal IIPMF campos. Creemos que la investigación futura debe apuntar a diferentes objetivos, ya sea cuando se utilizan modelos de ratón para el FAS (por ejemplo, más complicado paradigmas de comportamiento, diferentes subestructuras hipocampo, el cerebro u otras estructuras), o la participación de diferentes modelos de animales, incluidos los de pez cebra [22] o cuy [ 23].

Métodos
Animales

Los sujetos eran ratones machos de las puras cepas C57BL/6J, BALB / cJ, DBA/2J y que se sabe que difieren en su sensibilidad al etanol (por ejemplo [24]]. Los ratones fueron mantenidos en condiciones controladas de laboratorio: temperatura 24 ± 2 ° C; 12:12 luz-oscuridad calendario con luces a las 8:00 AM; habitación; alimentos (UI RAU) y el agua del grifo ad libitum; libre de polvo la ropa de cama de aserrín . Los animales fueron destetados a 29 ± 1 días, y se alojan cada macho con una hembra (preferiblemente un littermate) Plexiglas en una jaula (42 cm × 27 cm × 17 cm). El estudio fue realizado en la Universidad René Descartes (París V; URA CNRS 1294, Génétique, Neurogénétique et Comportement). Todas las ratas fueron nacidos y criados en las instalaciones de París animal, que son SPF y aprobado por el Ministerio francés de Agricultura.

La exposición prenatal de alcohol

Ocho días antes del apareamiento, las mujeres ratones de los tres manchas son soluciones habituado al alcohol como su única fuente de líquidos (4% de etanol los 4 primeros días, el 8% de etanol los últimos 4 días). Las hembras fueron entonces acoplado con hombres experimentados de la misma cepa y, a lo largo de la gestación, expuestos a una solución de etanol al 12% como su única fuente de líquido. Dos grupos de control se incluyeron, en primer lugar, un par-alimentados grupo que tuvo un consumo isocalóricas solución de dextrinas (Amisol) y una misma cantidad de los alimentos como los consumidos por el alcohol expuestos presas y, en segundo lugar, un grupo de control que recibió los alimentos y el agua del grifo Ad libitum. Aunque el consumo de alimentos y líquidos que no fueron medidos, no evidentes diferencias en el consumo se notan. Se ha demostrado que los voluntarios llevan a beber paradigmas significativamente elevados niveles de alcohol en la sangre en las mujeres embarazadas [17]. El embarazo fue confirmado por la inspección visual de las mujeres. Luego del parto de sus hijos quedó con la madre biológica y el agua del grifo sustituido a la solución de alcohol.

Radial laberinto de formación

A la edad de 3-4 meses los animales se pusieron a prueba en el laberinto radial. 8-El laberinto del brazo radial utilizada en estos experimentos fue similar a la original utilizada por Schwegler y Crusio (por ejemplo, refs [25, 26]]. La parte central de la radial-laberinto mide 20 cm de diámetro. Sus armas (25 cm de largo, 6 cm de alto, 6 cm de ancho) se cerraron y de Plexiglas transparente. Al final de cada brazo es una partición perforada detrás de los alimentos frescos que se depositaron "pellets". De esta manera, los animales no pueden oler la presencia o ausencia de una recompensa. Todas las armas fueron reforzadas por la colocación de una pequeña bolita de alimentos detrás de una barrera de la prevención bajo el animal de ver si una determinada brazo seguía con cebo o no. El laberinto fue siempre orientada en el espacio de la misma manera. Varias pistas extra-laberinto se proporcionaron cerca de las armas. Un parto se utilizó el procedimiento de la utilización transparente guillotina puertas a la entrada de cada brazo. Las puertas se mantienen cerradas y bajar por 5 segundos después de los animales devueltos a la caja central. El laberinto radial se colocó directamente en el suelo para evitar la posible elevación inducida por la ansiedad.

Veinticuatro horas antes de la prueba los animales fueron trasladados a la sala de pruebas. Los animales se habituado para 1 día y posteriormente capacitados por 5 días. La habituación consistió en una exploración de 15 min ensayo con libre acceso a todas las armas, pero sin una recompensa de alimentos. Inmediatamente después compañero de las mujeres fueron eliminados de la casa y todas las jaulas de animales de experimentación, ahora solo alojados, fueron privados de alimentos. Durante las sesiones de capacitación animales fueron pesados diariamente y mantenerse en el 80-90% de su peso original. Entre períodos de sesiones en el laberinto se limpian con un paño seco. En los dos primeros días, los ensayos se acaba después de 15 minutos o después de que el animal había comido todas las recompensas, el que llegó primero. De allí en adelante, sin límite de tiempo se impuso y los ensayos fueron terminados cuando los animales han encontrado recompensa a las 8 de alimentos. La situación de los animales no comen todos los premios ocurrido con frecuencia en los primeros dos días, pero nunca en los días 3 a 5. Por esta razón, los datos de los días 1 y 2 no se incluyeron en el análisis. Anteriores experimentos han demostrado que el aprendizaje significativo se produce muy rápidamente y que la cepa o efectos mutacionales fiable puede ser demostrado con este método [27]

Dos variables se muestra, que representa un rendimiento de aprendizaje y el otro corriendo velocidad. El aprendizaje se mide por el número de errores mientras que la actividad se representa como el promedio de distancia recorrida (cm) por segundo. Un error si se cuenta a un animal entrado en un brazo visitado o que no ha comido la recompensa. Promedio de velocidad se calcula dividiendo la distancia recorrida por la cantidad de tiempo necesario para completar un proceso.

Histología y Morfometría

Histológica de los tratamientos se realizaron a lo descrito previamente por Schwegler y Lipp [28] ver también [29]. En pocas palabras, los ratones fueron profundamente anestesiados y perfundidos intracardially con sulfuro de sodio y glutaraldehído. Este método permite una buena fijación y preparación de tejidos para la tinción de Timm. Cerebros fueron removidos, pesada, y después de 24 horas fijado en el 3% de glutaraldehído con 20% de sacarosa y posteriormente cortado horizontalmente en 40 μ m secciones de criostato Timm después de que el sulfuro de plata se aplicó la tinción.

Los métodos utilizados para la visualización y la medición de los campos hipocampo terminal fueron similares a las descritas anteriormente (por ejemplo [30]]. La toma de muestras se inició a nivel midseptotemporal, directamente por debajo de la mayoría de la extensión ventral septal polo de la fascia dentata. Tomando cada sección segunda, el 5 de las secciones horizontales definidas por animal fueron pseudo-azar la muestra, alternando entre la izquierda y la derecha hipocampo. Las áreas de los estratos oriens, pyramidale, radiatum, lacunosum-moleculare, y el musgo de fibra terminal campos (hilus, suprapyramidal MF, y dentro de ellos y infrapyramidal MF; véase la figura 6] se midieron sobre un sistema de análisis de imagen (Samba, Alcatel) y Se expresaron como porcentaje de toda la regio inferior (hilus + CA3) para corregir las posibles pequeñas variaciones en el plano de corte o de tejidos de encogimiento. Este método se ha demostrado que el rendimiento fiable y replicable resultados [28].

Análisis estadístico

Uso de las pruebas χ 2-el número de parejas reproductoras utilizado (parejas), los embarazos, los partos y se compararon para cada cepa. Los embarazos se compararon con el número de parejas, y los nacimientos en relación con el número de embarazos. El laberinto radial de los datos de los días 3 al 5 se analizaron mediante dos vías con medidas repetidas ANOVAs cepa y el tratamiento como factores principales. Ambos factores entre los sujetos consistió en tres niveles (cepa: C57BL/6J, BALB / cJ, y DBA/2J; tratamiento: el alcohol expuestos, par-alimentados, y el control). El hipocampo datos se analizaron por medio de ANOVAs de dos vías, siendo ambos factores idénticos a los mencionados análisis. Cuando sea necesario, en pareja comparaciones se hicieron usando medios mínimos cuadrados. Todos los ANOVAs se realizaron mediante el procedimiento GLM SAS.

De los autores Contribuciones

FS participó en la interpretación de los datos y redactó el manuscrito, LJ llevó a cabo el laberinto radial de las pruebas realizadas y la histología, JYB participado en el diseño del estudio y se llevó a cabo el análisis morfométricos, y WEC concebido del estudio, participó en su Diseño, llevado a cabo el análisis estadístico, y participó en la interpretación de los datos y redacción del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

El apoyo de una subvención (no 92/02) del Institut de Recherches Scientifiques sur les Boissons (IREB, París, Francia) para WEC.