PLoS Biology, 2005; 3(6): (más artículos en esta revista)

Cuando dos es mejor que uno: elementos de Microscopía Intravital

Biblioteca Pública de la Ciencia
David W pistón
Resumen

¿Cuáles son las bases técnicas de microscopía de dos fotones? ¿Cuáles son las ventajas de la utilización de dos fotones frente a la microscopía convencional microscopía confocal?

En los últimos 20 años, muchos estudios de células biológicas se han trasladado de la celda de un solo nivel a los centros de tejidos, e incluso a los animales enteros. Este progreso ha sido conducido por la evolución de microscopía de fluorescencia molecular que permiten observaciones dentro de las células de un solo tejido o de los animales intactos. Concurrencia de la evolución de las sondas fluorescentes, sobre todo la clonación de la Green Fluorescent Protein, y su uso en animales transgénicos, también han impulsado este movimiento. La clave de la tecnología instrumental para este trabajo es la microscopía óptica de secciones; en esta técnica, en lugar de la fijación y físicamente seccionando una muestra, el investigador obtiene un 3-D de un conjunto de datos intacto (y que es más importante, en vivo) muestra. La más común es la técnica de la sección óptica microscopía confocal, fluorescencia que se crea en toda la muestra y un pinhole confocal se coloca delante del detector de manera que sólo se centran en la fluorescencia se registra. Para muestras en vivo, cuyas células pueden ser asesinados por la excitación de la luz (a través de foto-toxicidad, en particular de las longitudes de onda azul y ultravioleta), microscopía confocal puede no ser una opción. Una óptica más recientemente desarrollado método de la sección es de dos fotones de excitación microscopía (que también va por los nombres de varios de fotones de microscopía y microscopía óptica no lineal). Como se describe a continuación, de dos fotones de excitación ofrece ventajas muy importantes para el de imágenes de alta resolución de muestras de espesor de vida (tan profundo como de 1 mm). Lo que es más importante, de dos fotones de imágenes está ahora listo para el gran momento, porque instrumental de los avances que han hecho tan fácil de usar como cualquier otra técnica de microscopía de fluorescencia.

Fluorescencia de excitación

Para entender de dos fotones de excitación y sus ventajas para las imágenes, es útil para entender un poco sobre la fluorescencia. Fluorescencia es el proceso de absorción y re-emisión de la luz. Normalmente, una sola partícula de luz (fotón) es absorbida por una molécula fluorescente, provocando un estado excitado, que posteriormente se relaja por emisión de otro fotón. La excitación de la luz ultravioleta es, por lo general, de color azul, o verde. Toda vez que un fotón que tiene la correcta energía para causar el estado excitado entra en contacto con una molécula fluorescente, que puede ser absorbido. En cambio, la excitación de dos fotones de fluorescencia depende de la absorción simultánea de dos fotones (cada uno de los cuales contiene la mitad de la energía, por lo general rojo o infrarrojo, que se necesitan para hacer que el estado excitado). Por esta simultánea absorción ocurra, los fotones deben ser tan lleno de gente que hay una buena probabilidad de dos fotones simultáneamente estar en el mismo lugar que la molécula fluorescente. En un período de dos fotones de excitación microscopio, los fotones se hacinan en el tiempo y el espacio. Los fotones son hacinados en el tiempo mediante el uso de pulsos cortos de luz, que son alrededor de 100 femtoseconds (una décima parte de una millonésima de una millonésima de segundo) de duración. Esto hace que alrededor de un millón de veces más fotones que se presente al mismo tiempo que se presente en una constante ola normal láser del tipo comúnmente utilizado en microscopios confocales. Los fotones son hacinados en el espacio, centrándose a través del microscopio de lente objetivo. Como un solo rayo láser se centra en el microscopio, los fotones convertido en más de un millón de veces más lleno de gente todavía. La combinación de pulsos cortos y la concentración de la multitud de fotones por un factor de más de un billón.

Incluso con los altos poderes utilizados, el único lugar que los fotones se lleno de gente suficiente que dos de ellos estén en contacto con una única molécula fluorescente a la vez se encuentra en una pequeña región en el centro del microscopio. Esta región, llamada el volumen focal, es el único lugar de dos fotones que se produce excitación. Esta localización de dos fotones de excitación conduce a las ventajas para el tejido profundo de las imágenes. Si el estándar de microscopía de fluorescencia es como sondeando el contenido de una casa por un potente foco que brilla en la casa desde el exterior, de dos fotones de excitación es más como teniendo una linterna en todo el interior de la casa, todos los de la excitación se genera en el interior de la muestra.

Alta resolución, de alto contraste

Como ya se ha dicho, la principal ventaja de dos fotones de excitación es su capacidad de permiso de alta resolución y alto contraste de imagen intacta de las profundidades de tejido vivo. Figura 1 muestra un tiburón intacta plexo coroideo que se ha manchado con fluoresceína en el espacio extracelular . Figura 1A muestra una imagen confocal de 70 μ m tomado en la muestra, que exhibe mínimo contraste entre el brillante células fronteras y la oscuridad espacios intracelulares. Figura 1B muestra la misma sección adquiridos con dos fotones de excitación, el contraste es mucho mayor. De hecho, incluso con una sección mucho más profundo (140 μ m en la muestra) (Figura 1C], de dos fotones de excitación aún prevé similar contraste.

Una cuestión que a menudo se pregunta es, ¿cómo puede este enfoque profundo ir? La respuesta, por supuesto, depende del tipo específico de los tejidos, pero una buena regla general es que una imagen puede más profundo de 6 veces con excitación de dos fotones que con microscopía confocal. Hay dos razones para esta penetración más profunda. La primera es que no hay fuera de foco en la absorción de dos fotones de excitación microscopio. Debido a que los fotones son sólo lleno de gente suficiente para la excitación de dos fotones en el microscopio se centran, no son absorbidos por las moléculas fluorescentes a medida que pasan a través de la muestra. En microscopía confocal, la excitación de los fotones pueden ser absorbidos en cualquier lugar de la muestra. Por lo tanto, un mayor porcentaje de los fotones de excitación llegar a la concentración en dos fotones de excitación, y esta ventaja crece como el foco mayor de integración en la muestra. Mayor excitación conduce a una mayor señal, y, a su vez, a un aumento de contraste en la imagen.

La segunda razón para una mejor penetración en profundidad es que la excitación de dos fotones de imágenes es menos sensible a la dispersión en la muestra (Figura 2]. Este concepto no ha sido bien entendido, y se ha informado incorrectamente en muchos papeles. Se dice a menudo que debido a que el rojo y el infrarrojo fotones utilizados en la excitación de dos fotones son menos dispersos por el tejido, estos fotones puede penetrar más profundamente. Si bien es cierto que los fotones son dispersados poco menos de azul o verde fotones, esta diferencia es pequeña en comparación con las diferencias en la sensibilidad a la dispersión entre confocal y de dos fotones de excitación microscopía. En microscopía confocal, de excitación fotones que se encuentran dispersas en la muestra pueden causar fluorescencia en cualquier lugar de la muestra. Como el láser de potencia se aumenta en un intento de profundizar más en la imagen de muestra, debido a la fluorescencia de excitación dispersos también aumenta. Esto lleva a una bruma de fondo en la imagen que se reduce el contraste.

La fluorescencia emitida fotones también pueden ser dispersos, ya que salen de la muestra. Cuando un fotón fluorescente está dispersa, que no pasan a través de la pinhole confocal, y, por lo tanto, no será detectado. Esto reduce la señal, que a su vez disminuye el contraste de la imagen. Así, tanto la dispersión de la luz y la excitación de fluorescencia emitida provocar una reducción en el contraste en la imagen confocal. Por dos fotones de excitación, ni de dispersión caso es perjudicial para la imagen. En cuanto a la dispersión de los fotones de excitación, realmente no hay posibilidad de dispersión de dos fotones en el mismo lugar al mismo tiempo, de modo que incluso en una gran dispersión de la muestra, es posible aumentar la potencia de excitación sin generar antecedentes bruma. En cuanto a los fotones emitidos, de dos fotones de excitación microscopio recoge la mayor parte de la fluorescencia dispersos, ya que no existe una pinhole necesita (el único lugar de fluorescencia se está generando es en el punto focal). Estas dos razones, combinadas, permiten dos fotones de excitación de imágenes de alto contraste para proporcionar imágenes de las profundidades de los tejidos intactos, a pesar de las limitaciones en la disponibilidad de energía de láser por lo general limitar la profundidad de penetración a menos de 1 mm en el tejido. Más detalles acerca de las ventajas de la excitación de dos fotones de imágenes se presentan en otra parte [1-3].

Buscan Profundidad

Las ventajas de dos fotones de excitación microscopía son verdaderamente efectivos para el tejido profundo de imágenes. Si bien la técnica puede ser usada para la imagen más delgado muestras, tales como las células individuales, que por lo general no ser mejor que usando microscopía confocal o deconvolución. En realidad, estos otros métodos se adaptan mejor a este tipo de muestras y delgado también ofrecen mejor resolución espacial. Además, puede haber otros problemas relacionados con el de dos fotones de excitación debido a la gran aglomeración de fotones. Con estas altas intensidades, es posible activar otros procesos no lineales, lo que puede conducir a un aumento de photobleaching fotodaño y, posiblemente, negando las ventajas de la excitación de dos fotones en delgado muestras.

Es de esperar que para ese complicado fenómeno físico, es algo de tiempo antes de dos fotones de excitación encontrado su camino en la investigación biológica. De hecho, de dos fotones de excitación fue predicho teóricamente por Maria Goppert-Mayer en 1931 su tesis doctoral en la Universidad de Göttingen (Gotinga, Alemania) [4], y fue verificado experimentalmente en un temprano experimento por láser Kaiser y Garrett en 1961 [5]. No fue hasta la invención de los poderosos, que láseres ultrarápidos Denk et al. Lograron que los dos fotones en el uso de la microscopía en 1990 [6]. Desde entonces, ha habido considerable interés, y la mayoría de las principales instituciones de investigación han hecho algunos esfuerzos para crear una excitación de dos fotones microscopio. A pesar de las ventajas inherentes, aunque, de dos fotones de excitación microscopios son sesión inactiva en muchos de estos laboratorios. Hay un par de razones para ello. En primer lugar, el Ti: Zafiro de láseres que han estado disponibles durante los últimos 15 años son fiables y "manos libres" de un láser-jock perspectiva, pero ha demostrado ser difícil para un típico laboratorio de biología de los láseres para mantener en óptimas condiciones de funcionamiento. En segundo lugar, muchos investigadores no tienen proyectos que se adapten bien a los puntos fuertes de dos fotones de excitación microscopía. En estos casos, los resultados fueron mejores que con frecuencia no microscopía confocal, y por lo tanto, el extra para mantener los gastos generales Ti: Sapphire láser no fue bien justificada.

En estos días, ninguno de estos problemas se aplica. Los láseres son más nueva disponible en una sola caja, totalmente fuera de las manos, y controlada por ordenador. Esto permite que cualquier investigador para uso de dos fotones de excitación. Además, los problemas que están bien adaptadas a la aplicación de dos fotones de excitación finalmente han encontrado el uso de este poderoso enfoque. Por ejemplo, como lo demuestran dos documentos en esta cuestión [7, 8], los investigadores pueden ahora para caracterizar las actividades y el movimiento de cada uno de los linfocitos en los ganglios linfáticos intactas [7] y [8] timo, haciendo observaciones directas de los fenómenos que ha Sólo se deduce el uso de otros enfoques. Junto con el ahora maduro instrumentación, hay que esperar de dos fotones de excitación de imágenes a desempeñar un papel fundamental en nuestro futuro comprensión de los procesos biológicos in vivo.