Superficie RUTA-4 receptor señuelo expresión se correlaciona con la resistencia RUTA MCF7 en células de cáncer de mama

El cáncer todavía parece ser una enfermedad difícil de tratar. Según las más recientes estimaciones, más de 10 millones de nuevos casos de cáncer se reportaron en el año 2000, matando a alrededor de 6 millones de personas [1]. Además, el 10% de todos los cánceres parecen ser el cáncer de mama. Siendo la más frecuente tipo de cáncer diagnosticados en mujeres, el cáncer de mama reclamaciones acerca de 370000 muertes cada año en todo el mundo [2]. La cirugía, la radioterapia y la quimioterapia se encuentran entre los más ampliamente utilizados métodos de tratamiento para los pacientes con cáncer de mama [3 - 5]. Sin embargo, estas modalidades de tratamiento convencionales no mejoró la tasa de supervivencia de los pacientes con localmente avanzado o cáncer de mama metastásico. Con la terapia estándar, cáncer de mama localmente avanzado tiene una tasa de supervivencia a cinco años del 55% a diez años y la tasa de supervivencia del 35% [6]. Hay una tasa de recurrencia del 40% después de diez años tras el diagnóstico y la eliminación de tumor primario en pacientes con cáncer de mama [7]. Por todas estas razones, novela métodos de tratamiento son necesarios para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama.

Inducción de la muerte celular programada conocida como apoptosis [8], que parece ser una alternativa viable a las modalidades de tratamiento actualmente empleado en la lucha contra el cáncer [9]. A fin de que la quimioterapia y la radioterapia opciones de tratamiento contra el cáncer para trabajar como agentes; gen supresor de tumores, p53, se requiere [10]. Desgraciadamente, las mutaciones de p53 se adquieren durante la progresión del cáncer en más de la mitad de los tumores humanos [11, 12]. Por lo tanto, la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia ambos es casi inevitable en los tumores que carecen de p53 [13]. Por otro lado, la muerte ligandos son capaces de inducir la apoptosis p53 independientemente del estado de las células [14]. Debido a esta razón, la muerte ligandos son actualmente considerados como agentes contra el cáncer [15]. Entre los ligandos de muerte a prueba, Factor de Necrosis Tumoral (TNF) [16 - 18] y [19] FasL eficazmente indujo apoptosis en células cancerosas. Sin embargo, debido a su toxicidad sistémica, la aplicación de estos agentes en el cáncer de la terapia genética es muy limitada. El descubrimiento de un nuevo ligando de muerte, RUTA [20, 21], cambió este punto de vista, ya que a diferencia de otros miembros de la familia del TNF, RUTA asesinados selectivamente las células cancerosas sin causar ningún daño a las células normales [22]. Así, el tratamiento de las células tumorales con RUTA ligando apareció como una valiosa forma de inducir la apoptosis en células tumorales en concreto, como las células normales se protegen contra la muerte de inducir efectos de RUTA [23, 24]. Sin embargo, el mecanismo de resistencia de RUTA en las células normales no se entiende [25], y una proporción importante de las células del cáncer [26] incluidos los de mama [27, 28] parecen ser resistentes RUTA. En consecuencia, RUTA resistencia constituye un obstáculo si se desea utilizar RUTA como un ligando de muerte en todo el cáncer de mama la terapia génica.

La resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL en células normales se consideraba inicialmente al ser causados por la presencia de los receptores señuelo (RUTA y RUTA-R3-R4), que compiten con los receptores de muerte (RUTA-TRAIL-R1 y R2) por la unión de RUTA [ 29, 30]. Hasta la fecha, no RUTA correlación entre la sensibilidad y la expresión de TRAIL patrón de receptores se ha demostrado en las células del cáncer todavía [31]. La presencia intracelular de la apoptosis sustancias inhibitorias (bcl-xL, c-FLIP, cIAP etc) también fue culpado de ser responsable de la resistencia RUTA [31 - 33]. Curiosamente, la participación de ambos receptores y muerte RUTA RUTA-R4 señuelo del receptor también NF-kB activado vía [24, 34, 35]. Debido a la activación NF-kB es conocido por obstaculizar las vías de la apoptosis en las células-hasta en la regulación de la expresión de diferentes moléculas de inhibidor de apoptosis como cFLIP, bcl-xL, c-IAP y el señuelo del receptor TRAIL-R3 [34, 36, 37] , Los altos niveles de activación de NF-kB podría ser un fuerte factor responsable por el bloqueo de los procesos de apoptosis a fin de establecer RUTA resistencia. Por esta razón, analizamos la RUTA inducida, así como endógenas NF-kB actividades utilizando Luciferase reportero de genes en los ensayos de células de cáncer de mama MCF7. Porque RUTA-R1, R2-RUTA y RUTA-R4 NF-kB inducida por la activación ha demostrado ser mediada principalmente por TRAF2-NIK-IkappaB quinasa alfa / beta cascada de señalización [35], las células del cáncer de mama MCF7 estaban coinfectados con adenovirus vectores de codificación Mutante dominante negativo a IKK β (β AdIKK KA) [38] y hTRAIL (Ad5hTRAIL) con el fin de probar si RUTA resistencia en células de cáncer de mama se elimina a través de la inhibición de IKK, un importante modulador de NF-kB. El mecanismo molecular de la resistencia RUTA en células de cáncer de mama (MCF7 y MDA-MB-231) se estudió la novela de Tiempo Real RT-PCR convencionales y ensayos de citometría de flujo, a fin de verificar si existe alguna relación entre la resistencia y la RUTA patrón de expresión RUTA receptores. Por último, un enfoque DcR2 ARNsi se utilizó para eliminar a la expresión de los receptores de señuelo RUTA pertinentes a fin de revelar su relación a la resistencia RUTA.

La amplificación de los vectores Ad5hTRAIL [39], AdIKK β KA [17], AdEGFP [18], AdCMVLacZ [40] y AdNFkBLuc [38] se realizó como ha sido descrito previamente [41]. Amplified vectores fueron almacenadas a -80 ° C en 10 mM Tris con 20% de glicerol. AdIKK β KA expresa un mutante dominante negativo de IKK β, que interactúa con otras subunidades IKK para formar complejos inactivos IKK. Los títulos de partículas de adenoviral poblaciones se encuentran en el rango de 10 ¹³ partículas de ADN / ml, mientras que el típico de partículas / unidad de la formación de la placa coeficiente es igual a 50.

Líneas celulares de cáncer de mama se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, 2,2 g / l de bicarbonato de sodio, 1 mM L-glutamina, y el 1% de penicilina-estreptomicina mezcla, a 37 ° C en un 5% humidificado atmósfera de CO _2. Experimental pasos de la transducción de células de cáncer de mama con adenoviral vectores puede resumirse de la siguiente manera: El cáncer de mama células fueron infectadas con una creciente multiplicidad de infección (MOI) de AdEGFP (vector que expresa una mayor proteína verde fluorescente (EGFP) reportero de genes) de vectores a 37 ° C en RPMI 1640 sin FBS. Dos horas después de la infección, la igualdad de volumen de RPMI 1640 complementado con 20% de SFB se añadió a aumentar la concentración sérica en los medios de comunicación a 10%. 48 horas después de la infección, el nivel de transducción fue detectado mediante el examen del porcentaje de las buenas prácticas agrarias (+) células bajo un microscopio de fluorescencia y posteriormente por citometría de flujo. Yoduro de propidio exclusión técnica se utilizó para determinar la viabilidad celular. Sobreexpresión de hTRAIL fue proporcionada por Ad5hTRAIL infección. Las celdas estaban coinfectados con adenovirus vectores codificación IKK β mutante dominante negativo (β AdIKK KA) y Ad5hTRAIL con el fin de bloquear la actividad IKK lo activación de NF-kB. NF-kB promotor basado Luciferase sistema de ensayo se utilizó para realizar la transcripción NF-kB activación ensayos utilizando AdNFkBLuc construir. AdCMVLacZ vector se utilizó como control.

AdNFkBLuc construcción se utilizó con el fin de determinar la activación de NF-kB estado de las células MCF7. AdNFkBLuc vector [38] posee cuatro tándem copias de la NF-kB consenso fundido a una secuencia TATA-como promotor del virus del herpes simple timidina kinasa-gen conduce a la expresión de un reportero Luciferase. Transcripcional mediada por la inducción de NF-kB en la presencia o ausencia de RUTA se midió según el protocolo del fabricante utilizando el sistema de ensayo con Luciferase Reporter tampón de lisis (Promega, Inc). Todas las mediciones de la actividad Luciferase expresado como unidades relativas de luz se normalizaron en contra de la concentración de proteínas.

Discriminación de células vivas de células muertas se realizó a través Live / Dead Viabilidad Celular / citotoxidad Kit de Molecular Probes (Eugene, OR). Este ensayo se basa en el uso de Calsein AM y Ethidium homodimer-1 (EthD-1). Calsein AM es un sustrato para la fluorogenic intracelular calsein esterasa. Es modificados a un compuesto fluorescente verde (calsein) de la esterasa activa en células vivas con membranas intactas, por lo tanto, sirve como un marcador para las células viables. Ilesos membranas celulares no permiten EthD-1, una roja mancha fluorescente de ácidos nucleicos, para entrar dentro de la célula. Sin embargo, las células dañadas con la absorción de la membrana y las manchas de tinte positivo.

Annexin V conjugado con fluorocromos como el FITC ha sido utilizado con éxito como sondas para la detección de células sometidas a la apoptosis. Annexin V vinculante ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Alexis Biochemicals). Con este fin, un ratón conjugado FITC anticuerpo monoclonal humano a Annexin V (ALX-804-100F-T100) fue empleado para la detección de apoptosis mediante citometría de flujo.

Anti-RUTA receptor de citometría de flujo establecido (Cat. ALX-850-273-KI01) se ha utilizado para detectar la expresión de la proteína del receptor de RUTA en la superficie celular. Este kit contiene 100 μ gs de MAb a RUTA-R1 (clon HS101, núm. 804-297A),-R2 (clon HS201, Cat.804-298A),-R3 (clon HS301, núm. 804-344A) y-R4 ( HS402 clon, núm. 804-299A). Primaria anticuerpos fueron utilizados en el 5 μ g / ml de concentración. Biotina cabra anti-ratón IgG1 (Cat. ALX-211-202) se utilizó como anticuerpo secundario seguido de streptavidina-PE (Cat. ANC-253-050) antes de citometría de flujo. Flujo análisis se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante utilizando protocolos FACSCALIBUR BD en la Universidad de Akdeniz Hospitales. Purificada ratón IgG1 (MOPC 31C, Cat. ANC-278-010) ha servido como un isotipo control.

Reactivo TRIzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) se utilizó para extraer el ARN total de células de cáncer de mama, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción reversa, de 2 μ g de RNA total se realizó a través TaqMan Transcripción Reversa Reactivos (Applied Biosystems Cat. N8080234). A pesar de que las secuencias de RUTA y RUTA-R1-R2 primers y sondas fueron recientemente descrita por nuestro grupo [42], hemos tenido que diseñar nuevos sonda fija para el señuelo de receptores. Lo que sigue es la secuencia de la información para RUTA receptor señuelo establece: TRAILR3-5 'CCC-TAA-AGT-TCG-TCG-TCG-TCA-T, TRAILR3-3' GGG-CAG-TGG-TGG-GAC-AGT-A, TRAILR3 Sonda: 5 '6FAM-TCGCGGTCCTGCTGCCAGTCCTAGC TAMRA-3'; TRAILR4-5 'ACA-GCG-GAG-CAG-CAA-AAC, TRAILR4-3' ACG-GGT-TAC-AGG-CTC-CAG-TAT-ATT, TRAILR4 Probe : 5 '6FAM-AGGAGGAGTGTCCAGCAGGATCTCATAGATC TAMRA-3'. RRNA se amplificó como un control interno de la misma reacción. Tanto el rRNA primers y sondas se obtuvieron del PE Applied Biosystems (Cat. 4308329). ΔΔ Ct se ha utilizado el método descrito por Applied Biosystems para calcular las cantidades relativas de los receptores de TRAIL. TaqMan La reacción de PCR se realizó tal como se describe por el fabricante (Applied Biosystems Cat. N8080228).

Posttranscriptional silenciamiento de la expresión génica se convirtió en un método muy útil en el último par de años en la investigación. DcR2 ARNsi experimentos se realizaron con DcR2 ARNsi (sc-35185), ARNsi transfección medio (sc-36868) y ARNsi transfección reactivo (sc-29528) en células de cáncer de mama MCF7 como se describe por el fabricante (Santa Cruz de Biotecnología). Citometría de flujo análisis se realizó para evaluar los cambios en RUTA-R4 expresión génica. MCF7 células fueron infectadas con el Ad5hTRAIL o AdCMVLacZ vectores en el aumento de las dosis 35 horas después de la transfección. Molecular Probe's Live / Dead Viabilidad Celular / citotoxidad Kit se utilizó para evaluar la cantidad de células vivas 48 horas después de la infección.

Con el fin de averiguar la eficacia de la transducción de células de cáncer de mama por adenoviral vectores de primera generación, MCF7 células fueron infectadas con el aumento de la multiplicidad de infección (MOI) de adenovirus codificación reforzada Green Fluorescent Protein (AdEGFP). La transducción de perfiles fueron seguidos bajo microscopía fluorescente y cuantitativamente los resultados fueron analizadas por citometría de flujo 48 horas después de la infección (Figura 1]. Mientras que un MDI de 5000 partículas de ADN / celda era suficiente para la transducción de más del 90% de las células, casi el 100% de las células se transduced con AdEGFP en una MOI de 10000 partículas de DNA / célula. Estos ensayos son también de importancia fundamental en la obtención de la dosis óptima de adenovirus necesario para la transducción eficiente de MCF7 línea celular de carcinoma de mama sin observar deletéreos efectos citotóxicos. Estos resultados demuestran que las células del cáncer de mama se transduced adenoviral recombinante con éxito con los vectores.

Aunque RUTA apareció como un ligando terapéutica prometedora para tratar el cáncer, una variedad de tipos de tumores se informó de que se RUTA resistentes a la muerte celular inducida. Por esta razón, hemos querido investigar si exógenos RUTA expresión pronunciada por adenovirus vectores induciría muerte de las células del cáncer de mama. Para probar esto, MCF7 células fueron infectadas con el aumento de los títulos de Ad5hTRAIL o AdCMVLacZ. Monto de células viables se detectaron utilizando Molecular Probe's Live / Dead Viabilidad Celular / citotoxidad Kit de 48 horas después de la infección (Figura 2]. MCF7 células muestran resistencia completa a RUTA, ya que no reducir el nivel de células viables se observó incluso en una MOI de 10000 partículas de DNA / célula, en la que casi todas las células infectadas. Por lo tanto, se concluyó que las células del cáncer de mama MCF7 son totalmente resistentes a la entrega de adenovirus RUTA. Del mismo modo, AdCMVLacZ la infección por sí sola no reveló grado significativo de la muerte de las células o bien (datos no presentados).

Dado que el aumento de la actividad NF-kB se afirmó ser responsable de la resistencia a la citotoxicidad inducida por ligando de muerte en algunos tumores [36, 37], hemos querido poner a prueba si la inhibición de la actividad IKK lo que NF-kB se reduciría la viabilidad de las células del cáncer de mama . Con el fin de bloquear los anti-apoptóticos intracelular NF-kB vía, MCF7 células fueron infectadas con el aumento de los vectores adenoviral MOIs de codificación mutante dominante negativo de IKK β (β AdIKK KA), una molécula clave involucrados en la activación de NF-kB. Se examinó la viabilidad de células de 48 horas posteriores a la infección bajo microscopio de fluorescencia (Figura 2]. Curiosamente, AdIKK β KA vector solos resultaron ineficaces en la reducción de la viabilidad de las células MCF7, incluso en una MOI de 10000 partículas de DNA / célula.

Mediada por adenovirus entrega de IKK β (β Ad.IKK KA) [17, 18] o IkB α (α Ad.IkB AR) [40, 43] mutantes dominantes negativos han sido previamente demostrada para sensibilizar a las células del cáncer de pulmón a la muerte ligando TNF. Debido a que la mayoría de las líneas celulares de cáncer de mama parece estar probado RUTA resistentes [27, 28], NF-kB estrategias dirigidas a la inhibición de IKK se emplean para comprobar si las células de carcinoma de mama MCF7 se sensibilizó a RUTA en estas circunstancias. Para lograr esto, las células MCF7 estaban coinfectados con una constante de MOI Ad5hTRAIL construir y el aumento de las dosis de AdIKK β KA vector. Con el fin de evaluar mejor el fenómeno de sensibilización, se Ad5hTRAIL infectadas en dos diferentes MOIs en MCF7 líneas celulares de cáncer de mama. Si bien una constante MOI de 1000 partículas de ADN o de células de Ad5hTRAIL fue utilizado en experimentos de infección representada en la figura 3, la infección por los experimentos realizados en una MOI de 5000 partículas de ADN o de células se muestran en la figura 4. La cantidad de células viables fue detectado 48 horas después de las infecciones Molecular Probe usando el Live / Dead Viabilidad Celular / citotoxidad Kit. Curiosamente, las células MCF7 se sensibilizó a RUTA sólo cuando se Ad5hTRAIL coinfectados con AdIKK β KA vector. Por ejemplo, casi el 55% se observó la muerte de las células cuando las células estaban coinfectados con 1000 MOI de Ad5hTRAIL y 5000 MOI de AdIKK β KA construcciones (Figura 3]. Cuando Ad5hTRAIL de MOI se aumentó a 5000 como se muestra en la Figura 4, la tasa de mortalidad se elevó al 90%. Por otro lado, en lugar de la infección AdCMVLacZ β AdIKK KA en células de cáncer de mama no reveló RUTA sensibilización (datos no presentados). Estos resultados sugirieron que IKK β KA expresión a través de vectores adenoviral derrotado RUTA resistencia observada en las células del cáncer de mama MCF7.

Es bien sabido que las diferentes células tumorales mostrar diversos niveles endógenos de NF-kB. Además, intracelular NF-kB en la actividad de las células tumorales es upregulated por tanto receptores de muerte RUTA (RUTA-TRAIL-R1 y R2) [34, 44], así como del receptor señuelo RUTA RUTA-R4 [45] a ligando vinculante. Conocer la endógeno NF-kB estado de las células del cáncer antes de la terapia es obviamente crucial para la terapia génica mediada por TRAIL dirigidas a inducir la apoptosis en células de cáncer. Una coinfección experimento se realizó con un vector adenovirus recombinante desempeño NF-kB impulsada Luciferase reportero gen (AdNFkBLuc) y Ad5hTRAIL vector con el fin de estudiar el grado de activación de NF-kB como consecuencia de la sobreexpresión RUTA MCF7 en línea celular de cáncer de mama. NF-kB Luciferase ensayos se realizaron 24 horas después de la infección con el fin de determinar la celda de activación de NF-kB. Como se observa en la Figura 5, Ad5hTRAIL en una MOI de 5000 partículas de ADN / celular (Grupo B), pero no en una MOI de 1000 partículas de ADN / celular (Grupo A) estimulado activación de NF-kB. Con el fin de determinar la magnitud de la inhibición de NF-kB, una triple coinfección experimento que AdNFkBLuc, Ad5hTRAIL y AdIKK β KA o AdCMVLacZ se realizó. Aunque IKK β KA sobreexpresión en células MCF7 reducido gradualmente tanto la RUTA inducida basal y actividades de NF-kB en células MCF7, no la inhibición de NF-kB efecto se observa en las células a los super-infección con el virus de AdCMVLacZ como control (Figura 5].

Para mostrar que la apoptosis es el mecanismo de muerte celular mediada por TRAIL sobreexpresión en el marco del establecimiento de la inhibición de IKK en células MCF7, Annexin V se realizó mediante tinción de citometría de flujo. Con este fin, MCF7 células fueron infectadas con el Ad5hTRAIL o AdIKK β KA vectores solo o en combinación. Treinta y cinco horas después de la infección, la muerte celular apoptótica fue analizado por Annexin-V-FITC tinción. Como se muestra en la Figura 6 Grupo A, no hay sustanciales Annexin V vinculante generado por la expresión de TRAIL o IKK β KA en células MCF7. Sin embargo, niveles considerables de Annexin V vinculante se observaron en las células coinfectados con Ad5hTRAIL y AdIKK β KA indicando la muerte de las células apoptóticas (Figura 6, Grupo B). Como se predijo, Ad5hTRAIL y AdCMVLacZ (control negativo) coinfección no dio ninguna niveles significativos de Annexin V vinculante como MCF7 células son resistentes a RUTA en la ausencia de inhibición de IKK. Estos resultados sugieren que el mecanismo de muerte celular que experimentan las células MCF7 es la apoptosis siguientes RUTA estimulación en el marco del establecimiento de la inhibición de IKK.

Hasta el momento no hay pruebas de la conexión entre el patrón de expresión de los receptores y RUTA RUTA sensibilidad se encuentra en las células del cáncer [31]. Parte de la razón podría haber sido la incapacidad de procesar toda la RUTA receptores a la vez en células de cáncer de mama después [28]. Con el fin de compensar esta deficiencia, cuantitativos novela Tiempo Real RT-PCR se llevaron a cabo ensayos de utilización de la sonda-primer fija específicamente diseñado para detectar cada uno de los receptores de TRAIL en células de cáncer de mama MCF7 (Figura 7, Grupo A). De acuerdo con nuestros resultados, mientras que todos los receptores de RUTA se expresa en las células MCF7, RUTA-R4 expresión fue la más alta entre los cuatro. Además, el nivel de R2-RUTA expresión era mucho más alto que el de TRAIL-R1. Por último, RUTA-R3 señuelo la expresión del receptor fue el más bajo. Estos resultados sugieren que los niveles elevados de RUTA-R4 expresión del receptor señuelo bien correlacionada con la resistencia RUTA. Sin embargo, como la expresión de genes detectados en el interior de la celda puede no necesariamente con la expresión de receptores de la superficie celular, decidimos llevar a cabo el análisis de citometría de flujo usando anticuerpos específicos a cuatro receptores diferentes RUTA. Como se muestra en la Figura 7 Grupo B, células MCF7 expresó con exclusión de todos los receptores RUTA RUTA-R3 en la superficie celular. Si bien niveles similares de los receptores de muerte RUTA RUTA-TRAIL-R1 y R2 se expresaron, todavía hay niveles considerables de RUTA-R4 señuelo la expresión del receptor en la superficie de las células MCF7.

Con el fin de solidificar la importancia de RUTA-R4 expresión y su relación con RUTA resistencia, otra línea celular de cáncer de mama, MDA-MB-231, también se analizó en términos de la expresión del receptor RUTA perfil. Tiempo Real ensayos de RT-PCR reveló que mientras RUTA-R2 expresión fue el más alto en los niveles de transcripción, RUTA-R4 señuelo la expresión del receptor fue el más bajo RUTA receptor expresado en MDA-MB-231 células de cáncer de mama (Figura 8, Grupo A). Además, el análisis de citometría de flujo indicó que los niveles insignificantes de RUTA-R4 expresión se detectaron en la superficie de MDA-MB-231 células de cáncer de mama (Figura 8, Grupo B). RUTA-R3 señuelo de la expresión del receptor, sin embargo, no era detectable mediante citometría de flujo. Curiosamente, en contraste con lo observado con MCF7, adenovirus RUTA sola entrega de muertos de proporciones importantes MDA-MB-231 células de cáncer de mama (Figura 9].

Con el fin de solidificar la relación entre RUTA-R4 señuelo del receptor de la expresión de genes de resistencia y RUTA, un DcR2 ARNsi enfoque fue ejecutado en RUTA MCF7 resistentes células del cáncer de mama. Citometría de flujo análisis realizado 35 horas después de la transfección revelado que el nivel de RUTA-R4 expresión de la proteína en la superficie se redujo drásticamente (Figura 10, Grupo A). En esta fase, las células MCF7 fueron más infectados con cualquiera de las dos Ad5hTRAIL o AdCMVLacZ vector en dosis crecientes. Ensayos de viabilidad celular se realizaron 48 horas después de la infección. Sólo Ad5hTRAIL células infectadas muestra de un considerable monto de la muerte celular después de transfección (Figura 10, Grupo B). No existe el efecto se observó cuando las células están infectadas por el virus de AdCMVLacZ (datos no presentados).

Aunque, modalidades de tratamiento convencional no puede satisfactoriamente mejorar la supervivencia en pacientes con localmente avanzado y metástasis, adenovirus entrega de los ligandos de muerte representa una opción viable para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama. Sin embargo, las recientes observaciones que demuestra que una parte considerable de los cánceres humanos incluyendo los de la mama [27, 28] fueron resistentes RUTA socavado la posible aplicación de la RUTA contra el cáncer. En consecuencia, la comprensión del mecanismo de resistencia RUTA es la clave para resolver los principales obstáculos en la terapia génica mediada por TRAIL. Sobre la base de los últimos resultados de nuestro laboratorio y otros, creemos que la señalización NF-kB es una de las más importantes vías que participan en la constitución de RUTA resistencia [26]. A pesar de que RUTA-R1, R2-RUTA y RUTA-R4 NF-kB inducida por la activación ha demostrado ser mediada principalmente por TRAF2-NIK-IkappaB quinasa alfa / beta cascada de señalización [35], existen dudas sobre si No activación de NF-kB puede bloquear la apoptosis mediada por TRAIL. Por ejemplo, en un estudio en particular se informó de que la inhibición de NF-kB en forma mutante de expresión IkappaBalpha sensibilizar a las células MCF7 TNF, pero no RUTA inducida por apoptosis [35]. Teniendo en cuenta el hecho de que existen diferentes maneras de activar NF-kB pathway (IkB dependientes e independientes medios) [46] nos decidimos a inhibir la actividad IKK en lugar de basarse en IkappaBalpha sí mismo para buscar la posibilidad de sensibilizar a las células del cáncer de mama MCF7 a RUTA.

En primer lugar, con el fin de averiguar la eficacia de la transducción de adenovirus en células de cáncer de mama, las células MCF7 estaban infectadas con el aumento de MOIs de AdEGFP virus. La transducción de los perfiles analizados por citometría de flujo mostró que casi el 100% de las células se transduced con AdEGFP en una MOI de 10000 partículas de ADN / celular (Figura 1]. La eficacia de RUTA en la mediación apoptosis de las células del cáncer de mama MCF7 se evaluó a través de la construcción de Ad5hTRAIL. Curiosamente, las células MCF7 muestran resistencia completa a RUTA como no reducción en el nivel de células viables se observó incluso en una MOI de 10000 partículas de ADN / celular (Figura 2]. IKK inhibición de la estrategia por sí sola resultaron ineficaces en la reducción de la viabilidad de las células MCF7 sugiriendo que un estímulo apoptótico que se requería para inducir muerte celular (Figura 2]. Curiosamente, con el fin de romper la resistencia RUTA y para inducir la muerte celular, una coinfección de las células MCF7 con Ad5hTRAIL y AdIKK β KA fue necesario (Figuras 3 y 4]. Luciferase ensayos confirmaron que tanto la RUTA inducida y endógenos NF-kB actividades se redujeron drásticamente por la infección de las células MCF7 con AdIKK β KA virus (Figura 5]. Además, IKK β KA sensibilización de las células de carcinoma de mama MCF7 dado lugar a la apoptosis inducida por TRAIL como revelado por Annexin V pruebas aglutinantes (Figura 6]. Estos resultados sugieren que la activación de NF-kB vía tiene un efecto sobre obstaculizando RUTA inducida por la muerte de las células en células MCF7, y el bloqueo de esta vía es esencial para sensibilizar a las células del cáncer de mama a la apoptosis mediada por TRAIL.

Hasta el momento, ninguna correlación entre la resistencia y RUTA RUTA señuelo del receptor de la expresión de genes ha sido reportado. Por ejemplo, el análisis de las líneas celulares de cáncer de mama con sólo examinar los niveles de expresión de los receptores de muerte RUTA (RUTA-TRAIL-R1 y R2) y RUTA-R3 receptor señuelo usando RNasa protección de ensayo no reveló ninguna relación entre el patrón de expresión de los receptores RUTA RUTA y de la resistencia [28]. Pero sea o no RUTA-R4 señuelo del receptor de la expresión génica en modo alguno contribuye a la resistencia RUTA en células de cáncer de mama aún no se ha determinado todavía. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayos se desarrollaron con el fin de evaluar el nivel de la expresión de los genes del receptor de RUTA en células de carcinoma de mama. Aunque todos los receptores RUTA fueron detectables en MCF7 línea celular de carcinoma de mama, el nivel de RUTA-R4 señuelo del receptor de la expresión génica es la más alta entre las cuatro (Figura 7, Grupo A). Este intrigante observación es consistente con un informe anterior que sugiere que transitorios RUTA-R4 sobreexpresión protegidas células objetivo de la citotoxicidad inducida por TRAIL [45]. RUTA R4 es conocida por proteger las células de la apoptosis, actuando ambos como un receptor señuelo y un antiapoptótico proveedor de la señal. Si bien el ensayo de PCR en tiempo real es útil en la evaluación del nivel de la expresión génica en los niveles de mRNA, evidentemente, este ensayo no refleja necesariamente RUTA composición de los receptores de la superficie celular. Por esta razón, el análisis de citometría de flujo convencionales se llevó a cabo con el fin de determinar el nivel de RUTA en la expresión de la proteína del receptor de la superficie celular. A pesar de la presencia de receptores de muerte RUTA, sustancial de los niveles de la RUTA-R4 señuelo eran detectables la expresión del receptor en la superficie de células de carcinoma de mama MCF7 (Figura 7, Grupo B). Por encima de todo, sensibles RUTA MDA-MB-231 línea celular (Figura 9] muestran niveles muy bajos de RUTA-R4 señuelo expresión de los receptores de la superficie celular (Figura 8, Grupo B). Ninguna de las líneas celulares expresaron niveles detectables de RUTA-R3 señuelo del receptor en la superficie. Curiosamente, la administración de un enfoque reducido DcR2 ARNsi superficie RUTA-R4 expresión y sensibilizado MCF7 células de cáncer de mama a RUTA (Figura 10].

Nuestros resultados demuestran que la expresión de TRAIL-R4 receptor señuelo, pero no RUTA-R3 parecía correlacionan bien con la resistencia RUTA MCF7 fenotipo observado en células de cáncer de mama. Más de cribado de cáncer de mama otra línea celular, MDA-MB-231, que reveló bajos niveles de RUTA-R4 expresión en la superficie se correlaciona con la sensibilidad RUTA. Estos resultados fortalecer nuestro argumento de que TRAIL-R4, pero no RUTA-R3 es el señuelo del receptor que parece influir en RUTA sensibilidad en células de cáncer de mama. Esto se ve confirmado por un DcR2 ARNsi ensayo que sugiere que la regulación de abajo RUTA-R4 expresión sensibilizado MCF7 células de cáncer de mama a RUTA. Además, la inhibición de la vía IKK lo que NF-kB células MCF7 sensibilizado a la apoptosis inducida por TRAIL a pesar de la expresión de TRAIL-R4 señuelo del receptor en la superficie celular. Por consiguiente, este enfoque complementario de la terapia génica de IKK inhibición podría ser necesario desglose RUTA resistencia que se encuentra en pacientes con cáncer de mama.

RUTA = Factor de Necrosis Tumoral (TNF)-Relacionado Apoptosis-Inducing ligando, EGFP = Mayor Green Fluorescent Protein, = MOI Multiplicidad de infección, DcR2 = señuelos de los receptores 2.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

ADS realiza viabilidad celular, Luciferase, Citometría de Flujo, Real Time RT-PCR y ensayos de ARNsi, ED asistida ADS con adenovirus preparación, CA AdEGFP realizado ensayos de transducción, NE cultivadas de células de cáncer de mama, SK optimizado ensayos de citometría de flujo, SS participó en la coordinación y La ejecución del estudio. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

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