BMC Cell Biology, 2005; 6: 26-26 (más artículos en esta revista)

Localización de la membrana plasmática t-SNAREs syntaxin 2 y 3 en compartimentos intracelulares

BioMed Central
Arja M Band (arja.band @ helsinki.fi) [1], Esa Kuismanen (esa.kuismanen @ helsinki.fi) [2]
[1] Haartman Institute and Molecular and Cancer Biology Program, Biomedicum Helsinki, Haartmaninkatu 8, 00014 University of Helsinki, Finland
[2] Department of Biosciences, Division of Biochemistry, Viikki Biocenter, Viikinkaari 5, 00014 Helsinki, Finland

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Resumen
Antecedentes

Fusión de membranas requiere de la formación de un complejo entre una proteína de vesículas (v-SNARE) y la meta proteínas de membrana (t-SNAREs). Syntaxin 2 y 3 t-SNAREs que, de acuerdo con anteriores estudios sobre expresión, son en su mayoría localizados en la membrana plasmática. En el presente estudio se investigó la localización de la endógena syntaxin 2 y 3.

Resultados

Endógena syntaxin 2 y 3 se encontraron en NRK vesicular intracelular de las células de las estructuras, además de las regiones de la membrana plasmática. El tratamiento de estas células con N-ethylmaleimide (NEM), que es del conocimiento de inactivar fusión de membranas, causado syntaxin 3 a acumularse en la red transeuropea de Golgi y syntaxin 2 en vesículas de membrana perinuclear. Cinética en el análisis de la presencia de NEM indicó que esta redistribución de la syntaxin 2 y 3 se lleva a cabo a través de las estructuras que contienen actina.

Conclusión

Nuestros datos sugieren que syntaxin 2 ciclos entre la membrana plasmática y el compartimento perinuclear que syntaxin 3 ciclos entre la membrana plasmática y de la red transeuropea de Golgi. Es posible que esta bicicleta tiene un papel importante en la regulación de la función t-SNARE.

Antecedentes

Membrana de tráfico que se necesita para la síntesis y procesamiento de las proteínas y lípidos, así como el mantenimiento de la compartimentación de la célula. El tráfico intracelular de membranas implica la gemación de vesículas de membrana del donante y de la fusión de vesículas con sus respectivos destinatarios membranas. Varias son las proteínas de membrana que participan en la fusión, incluida la N-ethylmaleimide (NEM) sensibles al factor (NSF), NSF embargo proteínas solubles (SNAPs) y los receptores de SNAP (SNAREs). SNAREs son una super familia de proteínas de membrana integral caracterizada por α-helicoidal motivo. El SNAREs que están funcionando en la exocitosis neuronal se caracteriza mejor. Estos incluyen la vesícula SNARE synaptobrevin (conocida también como VAMP, vesícula asociada a la membrana de proteínas) y las proteínas de membrana SNAP-25 y syntaxin 1 [1]. El emparejamiento de la meta SNARE (t-SNARE) con la vesícula SNARE (v-SNARE) (trans complejo) tira las membranas juntos y este es, posiblemente, la fuerza motriz en la mezcla de los lípidos bilayers. SNAREs forma legajos que contienen cuatro α-hélices en un acuerdo paralelo [2]. En medio de la hidratación paquete, hay una sección hidrófilo que contiene tres bien conservadas glutamines (Q) o una conserva de arginina (R). Esto condujo a la clasificación de SNAREs en SNAREs y Q-R-SNAREs [3]. Por ejemplo, SNAP-25 y syntaxins son Q-SNAREs y VAMP es un R-SNARE. Tres de las hélices helicoidales paquete vienen de Q-SNAREs y uno de un R-SNARE. Syntaxins y VAMP contener uno helicoidal SNARE motivo pero SNAP-25 contiene dos motivos [2]. El desmontaje de la SNARE complejos que se forman es mediada por proteínas NSF embargo, SNAPs, y la actividad ATPasa de la NSF [1, 4].

Un conjunto único de SNAREs se encuentra en distintos compartimentos intracelulares. Liposomas fusión ensayo ha demostrado que SNAREs muestran una alta especificidad en la formación de complejos con los demás [5]. La formación de complejos funcionales transeuropeas fue restringida a fisiológicamente relevantes SNARE combinaciones. La especificidad de la formación de los complejos reside en el SNARE motivos [6]. Sin embargo, v-SNAREs están presentes en ambos anterógrado y retrógrado, por lo tanto, vesículas y otras proteínas son necesarias para contribuir a la especificidad de la orientación vesícula [7]. Estas incluyen, entre otras, las proteínas Rab GTPasas pequeñas, Sec1 proteínas, y complexins [8, 9]. Recientemente se ha informado de que la formación de los no afines SNARE complejos que no son fusogenic podría tener un papel regulador. Estas SNAREs inhibitorio se han sugerido para aumentar la especificidad de las membranas de orientación mediante la inhibición de la fusión de membranas fuera de sus compartimentos específicos [10].

Syntaxins pertenecen a un t-SNARE familia de los que más de una decena ya han sido clonados [11]. La sobreexpresión de estudios han sugerido que syntaxin 1, 2, 3, y 4 se encuentran principalmente en la membrana plasmática. Syntaxin 1 se expresó principalmente en el tejido cerebral y está pensado para funcionar específicamente en la liberación de neurotransmisores, mientras que syntaxin 2, 3, y 4 tienen una distribución más amplia del tejido [12]. Hemos demostrado anteriormente que syntaxin 4 está localizada, además de la membrana plasmática, en las estructuras intracelulares vesicular y [13]. Estas estructuras de co-localizados con manchas rab11. El tratamiento con NEM causado acumulación de syntaxin 4/rab11 etiquetado positivo para los filamentos de actina [13].

En este estudio, se determinó la localización subcelular de endógeno syntaxin 2 y 3 en células NRK. Similar a syntaxin 4, syntaxin 2 y 3 se encontraron para localizar en las estructuras intracelulares vesicular, además de las regiones de la membrana plasmática. En el caso de syntaxins 2 y 3, NEM tratamiento dado lugar a la acumulación de estas proteínas en la membrana perinuclear vesículas y la red transeuropea de Golgi (TGN), respectivamente. Cinética en el análisis de la presencia de NEM sugirió que ambos syntaxin 2 y 3 se redistribuían a la perinuclear actina a través de los sitios que contienen estructuras.

Resultados
Caracterización de syntaxin 2 y 3 sueros anti -

Previo de expresión de los estudios han sugerido que syntaxins 1, 2, 3, y 4 están principalmente localizados en la membrana plasmática [12, 14]. Sin embargo, hemos encontrado que anteriormente endógeno syntaxin 4 está localizada en 11 positivos Árabe membranas intracelulares, así como en la membrana plasmática [13]. Por lo tanto, en este estudio se investigó la localización de la endógena syntaxin 2 y 3. Anti-syntaxin sueros contra 2 y 3 fueron planteadas por la inmunización de conejos con el amino terminal citosólico dominios de rata syntaxin 2 y 3. Desde syntaxins 2, 3 y 4 son muy homólogas a unos de otros [12], primero determina la especificidad de la anti-sueros. Ambos syntaxin 2 y 3 anti-sueros específicamente reconocido sólo a sus respectivos antígenos, y no una reacción cruzada con el dominio citosólico de otros syntaxins sobre blotts Occidental (Figura 1A]. Enriquecido membrana fracción de células NRK se resolvió con SDS-PAGE y borró con syntaxin 2 o 3 anti-suero. Syntaxin 2 anti-suero borró una banda estrecha que migran a la calculada syntaxin peso molecular de 34 kDa 2 monómero (Fig. 1B, carril 1). Esta banda fue abolida con la pre-incubación de la syntaxin 2 con suero anti-GST syntaxin 2-proteína (Fig. 1B, carril 2). Cuando la fracción de membrana se borró con syntaxin 3 suero anti-dos bandas apareció con la aparente migración de masas moleculares de aproximadamente 33 kDa y 40 kDa. Ambas bandas fueron abolidas por la pre-incubación de la syntaxin 3 con suero anti-recombinante syntaxin 3. Estas bandas, probablemente, representan dos formas diferentes de monomérico syntaxin 3. Esta conclusión está apoyada por observaciones anteriores, que indican que el cerebro de ratón contiene cuatro diferentes formas de syntaxin 3 y dos formas de syntaxin 1 que migran a diferentes pesos moleculares [15, 16]. Nuestro syntaxin 3 suero anti-También se ha demostrado previamente para secar syntaxin 3 en el aparente peso molecular de aproximadamente 40 kDa en células Caco-2 extracto [17].

Endógena syntaxin 2 y 3 se encontraron localizadas en compartimentos intracelulares

Syntaxin 2 y 3 anti-sueros manchadas intracelular vesicular estructuras y regiones de la membrana plasmática en células NRK (Figura 2A]. Estas coloraciones pueden ser totalmente bloqueado con recombinante syntaxin 2 y 3 de las proteínas (Figura 2B]. Dado que el syntaxins se cree que se encuentra en la membrana plasmática se consideró posible que el syntaxin 2 y 3 fueron positivas vesículas intracelulares constitutiva exocytic vesículas syntaxins llevando como carga. Para estudiar si este es el caso, tratadas con células cycloheximide durante dos horas para agotar nueva síntesis de proteínas de la vía de biosíntesis de las membranas (Fig. 3]. Este tratamiento no abolió el etiquetado vesicular intracelular, lo que demuestra que la syntaxin 2 y 3 positivos membranas no representan la nueva síntesis syntaxins en su camino hacia la membrana plasmática.

En presencia de NEM syntaxin 2 se acumula en vesículas perinuclear y syntaxin 3 en el TGN

Luego de esto, se investigó el modo en la inhibición de la SNARE complejo desmontaje con NEM afecta a la localización de syntaxin 2 y 3. NEM es un reactivo sulfhidrilo alquilantes, que se ha notificado a inactivar la fusión de membranas componente NSF [18]. Anteriormente hemos demostrado que el tratamiento NEM dejado de transporte de membrana de la TGN a la membrana plasmática [19]. También hemos encontrado que el tratamiento NEM causado la mayoría de la syntaxin 4/rab 11 tinción positiva para pasar de las estructuras intracelulares vesicular filamentos de actina [13]. Desde NEM tratamiento produjo una notable redistribución de la syntaxin 4, estudiamos la localización de syntaxin 2 y syntaxin 3 en experimentos similares. Curiosamente, NEM tratamiento afectado a la localización de syntaxin 2 y syntaxin 3 diferente de syntaxin 4. En presencia de NEM endógeno syntaxin 2 y 3 en el acumulado de las estructuras de la membrana perinuclear y muy poco de estas manchas syntaxins puede observarse en vesículas o en la membrana plasmática (Fig. 4]. Hemos utilizado marcadores para estudiar el sitio de acumulación de syntaxins endógeno. En presencia de NEM endógeno syntaxin 2 en parte co-localizado con receptores de transferrina y no co-localización con un marcador tarde endosoma, lyso-bis-ácido fosfatídico (no se muestra) (Fig. 4]. Algunos endosomal asociación para syntaxin 2A y 2B se ha informado anteriormente, como así [20]. Endógena syntaxin 2 resultó ser en parte co-localizada con v-SNARE, cellubrevin en el compartimento perinuclear. En presencia de NEM endógeno syntaxin 3 en el acumulado de perinuclear elementos que co-localizado con el TGN marcador, TGN38 (Fig. 4]. Similar redistribución de la syntaxin 2 y 3, en presencia de NME también se puede observar cuando syntaxin 2 o 3 transitoriamente se expresó desde el cDNA en células NRK (fig. 5]. En el control de las células syntaxins se observaron tanto en la membrana plasmática y en los sitios intracelulares (Fig. 5A]. Después de NEM tratos en el etiquetado de syntaxins expresado en la membrana plasmática se redujo y la syntaxins se observó en el acumulado de perinuclear intracelular similar a los elementos endógenos syntaxin 2 o 3 (Fig. 5B]. La diferente distribución de syntaxin 2, 3 y 4 en presencia de NME sugiere que estos no son sólo syntaxins presentes en la membrana plasmática, sino que también están en bicicleta entre la membrana plasmática y los diferentes compartimentos intracelulares de la célula. De acuerdo con los resultados actuales syntaxin 3 SNARE podría ser el responsable de la fusión de la exocytic los transportistas de la membrana plasmática en células NRK. Esto se sustenta en la observación anterior de que syntaxin 3 está presente en zymogen gránulos de las células acinares pancreáticas [21, 22].

Redistribución de syntaxin 2 y 3 se lleva a cabo a través de las estructuras que contienen actina

Hemos observado anteriormente que, en presencia de NEM syntaxin 4 se acumula en filamentos de actina y está directamente asociada con la actina. En contraste con esto, syntaxin 2 o 3 no cosediment con polymerizing filamentos de actina syntaxins lo que sugiere que estas no están directamente asociados con la actina [13]. Sin embargo, syntaxin 2 y 3 positivos vesículas no se redistribuye cuando microtúbulos se depolymerised tratamiento con frío y repolymerization fue impedida con nocodazole (no se muestra). Por lo tanto estamos investigando la posible participación de los filamentos de actina en el transporte de syntaxin 2 y 3 vesículas de la membrana plasmática a los sitios intracelulares. Poco se sabe acerca de la función del citoesqueleto de actina en la membrana de las células animales en el transporte. Sin embargo, recientemente ha surgido alguna evidencia que sugiere que, además de microtúbulos del citoesqueleto de actina participa en la membrana / orgánulos de transporte. Citoesqueleto de actina promueve la internalización de los ligandos y de la vesícula endosomal el tráfico a lo largo de la vía, así como el movimiento de la membrana elementos como lisosomas [23 - 25]. Hemos utilizado un monómero de la proteína de unión actina cofilin / actina depolymerising factor, ADF, como marcador dinámico de la región citoesqueleto de actina [26]. Ambos syntaxin 2 y 3 conjuntamente con ADF localizados en la membrana plasmática (Fig. 6]. También otro marcador de actina, Oregon Green phalloidin, co-localizado con syntaxin 2 y 3 en zonas ricas en actina a la membrana plasmática (Fig 7A-7D]. Cuando se realizó el curso temporal de la localización de syntyaxin 2 y 3 observamos que ambos syntaxin 2 y 3 se asociaron en filamentos similares a las estructuras después de una hora de tratamiento con NEM (Fig. 7E-7H]. Estas estructuras de co-localizada con actina. Después de dos horas de tratamiento con NEM syntaxin 2 y 3 en el acumulado perinuclear sus destinos sin actina asociación (Fig 7I-7L]. Este resultado con syntaxin 2 y 3 está en contraste con nuestra observación anterior, indicó que syntaxin 4 estancias asociadas a los filamentos de actina, incluso después de dos horas de NEM tratamiento [13].

Anteriormente hemos observado que la alteración del citoesqueleto de actina con citocalasina D acumulado syntaxin 4 en el que contengan los agregados actina [13]. Sin embargo, cuando se investigó el efecto de la citocalasina D syntaxin en 2 y 3 el etiquetado no en la acumulación de actina se observó agregados (Fig. 8]. Ambos syntaxin 2 y 3 se quedaron en las estructuras vesiculares.

Discusión

En el presente estudio, hemos demostrado que la membrana plasmática endógenos t-SNAREs syntaxin 2 y 3 no están exclusivamente localizados en la membrana plasmática. Además de la membrana plasmática de localización, syntaxin 2 y 3 se encontraron para localizar en compartimentos intracelulares y de membrana. El tratamiento con NEM causado syntaxin 2 a acumularse en perinuclear estructuras vesiculares que en parte co-localizado con el receptor de transferrina que syntaxin 3 en el acumulado del TGN. Por lo tanto, es posible que syntaxin 2 podría ciclo entre la membrana plasmática y las vesículas de membrana perinuclear, y syntaxin 3 entre la membrana plasmática y el TGN en células NRK. Kinetic análisis sugiere que citoesqueleto de actina participa en el reciclaje de syntaxin 2 y 3 de la perinuclear sitios.

Nuestro microscopio de inmunofluorescencia estudios indican que endógeno syntaxin 2, 3 y 4 se encuentran sólo en corto secciones de la membrana plasmática y no están dispersos por todo de la membrana plasmática. Syntaxin 2, 3 y 4 co-localizar con ADF, un marcador para las regiones altamente dinámica del citoesqueleto de actina. Esto indica que cada uno de estos syntaxins está presente en la misma sección de la membrana plasmática y estos syntaxins ciclo activo entre este sector de la membrana plasmática y de diferentes sitios intracelulares. En informes anteriores se ha sugerido que syntaxin 2 está presente tanto en la porción apical y basolateral de la membrana plasmática y syntaxin 3 en la parte apical de la membrana plasmática en células polarizadas [21, 27, 28]. Por lo tanto es posible que syntaxins se concentren en las secciones activas de la membrana plasmática en células no polarizado también. El ciclismo de syntaxins haría posible para asegurar que todos los componentes de la maquinaria de fusión están correctamente dirigidos a un sitio de forma activa.

Hemos observado anteriormente que syntaxin 4 está directamente asociada con la actina, tal como lo examinó utilizando un cosedimentation ensayo. Syntaxin 2 y 3, por otra parte, no están directamente asociados con la actina [13]. Estudios cinéticos indicó que syntaxin 2 y 3 transitoriamente co-localización con los filamentos de actina que contiene al ser transportados a los sitios perinuclear, mientras que syntaxin 4 se acumula en estructuras como filamentos de actina en presencia de NME [13]. Estos paquetes de actina son morfológicamente distintas de las fibras y el estrés puede ser el resultado de la cinética alterada asamblea filamentos de actina [29]. Desmontaje de las fibras de actina con citocalasina D causas de la acumulación de actina que contiene agregados. Syntaxin 4 acumula con actina en estos agregados [13]. En cambio, syntaxin 2 y 3 de estancia en estructuras vesiculares en presencia de citocalasina D. Esto sugiere que syntaxin 2 y 3 no están tan adjunta a la actina como syntaxin 4. Curiosamente, la despolarización de Madin-Darby de riñón canino células epiteliales (MDCK) causado relocalization apical de la membrana plasmática basolateral y funcional a apical y basolateral vacuolas, respectivamente. Estas vacuolas se asocian con citoesqueleto de actina [28].

En algunas investigaciones anteriores endógeno intracelular syntaxin 2 o 3 etiquetado también se ha observado. En esos estudios se ha sugerido que syntaxin 2 y 3 tienen otro papel en los procesos de fusión de membranas intracelulares además del proceso de fusión en la membrana plasmática. Se ha informado de que syntaxin 2, 3 y 4 están presentes en las membranas phagosomal y sugirió que estén implicadas en la maduración phagosomal [30]. Del mismo modo, syntaxin 3 se encuentran en las membranas de la granular zymogenic células y una función de gránulo gránulo-fusión se sugirió [22]. También en estudios sobre expresión intracelular syntaxin etiquetado se ha observado y se ha considerado que sean causados por la sobre expresión o mislocalization [12]. Se utilizó la lisina-periodate-paraformaldehído fijación y permeabilización de saponina en nuestros estudios para preservar la vesicular intracelular de las estructuras y, por lo tanto, les hizo más visible que si una norma paraformaldehído fijación se ha utilizado.

Conclusión

El presente estudio indica claramente que syntaxin 2 y 3 no son exclusivamente localizados en la membrana plasmática, pero también están presentes en los compartimentos intracelulares y que pueden ciclo entre estos y los compartimentos de la membrana plasmática a través de las estructuras que contienen actina. Este ciclo de los syntaxins es probable que tenga un papel importante en la regulación de la función t-SNARE.

Métodos
Materiales

Monoclonales de ratón anti-rata TGN38 de anticuerpos fue un regalo del doctor G. Banting (Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.) Ratón y rata monoclonal anti-receptor de transferrina Ox26 hibridoma línea celular se obtuvo de la Península Laboratories, Inc (San Carlos, CA). Actina monómero de la proteína de unión cofilin / actina depolymerizing factor (ADF) conejillo de indias purificado por afinidad anti-suero [31] fue un regalo del doctor P. Lappalainen (Instituto de Biothechnology, Helsinki, Finlandia). Plásmidos codificación de longitud completa syntaxin 2A ratón y rata syntaxin 3A ADNc en pBK-CMV vectores (Stratagen, La Jolla, CA, EE.UU.) fueron regalos de V. Dr Olkkonen (Instituto Nacional de Salud Pública, Helsinki, Finlandia). Lissamine rodamina (LRSC)-conjugado, Rhodamine Roja ™ - X-conjugados y fluoresceína (FITC) conjugados con anticuerpos secundarios fueron comprados a Jackson Immuno Research (West Grove, PA, EE.UU.). Todos los demás reactivos fueron de grado analítico y se obtuvieron de fuentes comerciales.

Producción de proteínas de fusión y anticuerpos

El dominio citosólico de ratón syntaxin 2 (1-265), la rata syntaxin 3 (1-263) y la rata syntaxin 4 (1-272) en pGEX 2T vectores y syntaxin 2 y 3 fueron regalos de antisueros Dr V. Olkkonen (Nacional Instituto de Salud Pública, Helsinki, Finlandia). La producción y purificación de proteínas de fusión GST se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). El anti-suero de syntaxin 4-GST proteínas se produjo en conejos Nueva Zelanda Blanco.

Cultivo de células

Normal riñón de rata (NRK), las células fueron cultivadas a 37 ° C en 5% CO 2 en DME complementado con 2 mM de L-glutamina, 100 U de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina, y un 10% (v / v) fetal de ternera Suero (biológicas Industries, Beit Haemek, Israel). NEM-tratamiento se realizó por incubando células en 1 mM NEM durante 15 minutos y luego seguir incubando en el suero libre DME medio.

Western Blot

Las muestras fueron disueltas en SDS-buffer Laemmli, separadas en SDS-PAGE, y trasladado a la membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). Inespecíficos unión de los anticuerpos fue bloqueada con 5% de la leche sin grasa en TBST de amortiguación (0,15 M NaCl, 0,05% de Tween 20, 10 mM Tris-HCl pH 8.0). Secundaria anticuerpos son conjugados con cualquiera de fosfatasa alcalina (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) o peroxidasa de rábano (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, EE.UU.). Fosfatasa alcalina y ECL reacciones se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI, EE.UU. y Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia, respectivamente).

La preparación de la membrana fracción

NRK células fueron cultivadas como monocapas confluentes en platos de 10 cm. Las células fueron lavadas con buffer hinchazón hipotónica (10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 10 mM Tris-HCl pH 7.2) y raspó en el medio de transporte (115 mM Kacetate, 3,5 mM de MgCl 2, 1 mM EGTA, 1 mM TDT, el 0,1 MM PMSF, 25 mM Hepes KOH-pH 7,4) en presencia de 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro, 10 μ g / ml leupeptina y 2 μ g / ml pepstatin A. Las células fueron entonces distrupted por el paso repetido a través de una aguja de calibre 23. El homogenado se centrifuga a 5000 g durante 20 minutos y, a continuación, el sobrenadante se centrifuga a 100000 g durante una hora a precipitar membranas.

La inmunocitoquímica

NRK células fueron cultivadas como monocapas confluentes en coverslips en DME. Las células fueron fijadas con lisina 0,08 M-0,01 M periodate-2% paraformaldehido [32] y permeabilized con 0,05% saponina para mantener estructuras vesiculares. Imágenes convencionales de fluorescencia fueron vistos usando un microscopio de fluorescencia Olympus AX70 con una cámara CCD SenSys (Photometrics, Ltd, Munich, Alemania). Las imágenes se convirtieron utilizando el Image-Pro Plus versión 3,0 del software (los medios de comunicación cibernética, Silver Spring, MD, EE.UU.). Confocal se tomaron imágenes mediante un escaneo láser confocal Leica SP1 microscopio. Una capa se superponen en la imagen.

Abreviaturas

ADF, actina de monómero de la proteína de unión cofilin / actina depolymerizing factor; NEM, N-ethylmaleimide; NRK, de riñón de rata normal; NSF, N-ethylmaleimide sensibles al factor de fusión; SNAP, NSF embargo proteínas solubles; SNARE, SNAP receptor; stx, syntaxin; TGN, la red transeuropea de Golgi; VAMP, vesícula asociada a la membrana de proteína

Contribuciones de los autores

AMB llevado a cabo todos los experimentos y escribió el manuscrito. EK dio asesoramiento sobre experimentos y editado el manuscrito. Ambos autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Anne Makkonen habilidad para la asistencia. Este estudio fue apoyado por becas de investigación de la Academia de Finlandia (EK, AMB).