Natural de ARN antisentido de la histona H2a cultivadas en líneas celulares de ratón

Una búsqueda exhaustiva de la anotación funcional de Ratón (FANTOM) reveló la base de datos alrededor de 30000 de larga duración cDNA clones sin una importante proteína de la codificación de región [1]. De hecho, en antisentido transcripciones parecen estar presentes en el 10% y el 20% de los genes en el genoma humano y del ratón [2 - 6]. Estos hallazgos sugieren que muchas reacciones biológicas relacionadas con antisentido transcripciones y / o proteína-no son transcripciones todavía unrevealed [7]. Por otra parte, la base de datos de cDNA a veces incluye invertir complementa real de las transcripciones. Estos artefactos están excluidos de la base de datos sobre la base de las secuencias del intrón de los sitios de empalme. Por lo tanto, las transcripciones sin intrones necesita más evaluación experimental de anotación computacional para determinar su validez.

Histonas mRNAs regulados por el aumento del ciclo celular en el inicio de la fase S-descenso y al final de la fase S-[8]. Entre 20 histona H2a codificación de los genes-, 18 son dependientes de la replicación, las otras 2 son independientes de la replicación [9]. La replicación de los genes que dependen de la falta intrones y un poli (A) y contienen una señal muy conservadas tallo-bucle estructura en el extremo 3 'del mRNA. Este tallo-bucle estructura juega un papel importante en el procesamiento del mRNA y la estabilidad [10 - 12]. Los promotores de la replicación de los genes que dependen de las histonas contienen CCAAT y cajas TATA [13].

Hasta donde sabemos, Drosophila histonas H3 antisentido [14] y Leishmania histona H1 antisentido [15] se ha informado de las transcripciones, pero no histona H2a RNA antisentido o de mamíferos histonas RNA antisentido ha sido reportado. FANTOM 2 [1] contiene una transcripción antisentido (FANTOM clon ID 2210403F13; número de AK028129) de la histona H2a. Llamamos a esta transcripción ASH2a antisentido. Comparación de la secuencia de nucleótidos de ASH2a y de la secuencia del genoma del ratón mostró que el gen codificante ASH2a (ASH2a) se encuentra en el cromosoma 6 sin intrones. La secuencia de ASH2a es exactamente complementaria a la de la región de codificación de Hist2h2aa2 (un dependiente de la replicación de genes histona H2a) y la del promotor. En el presente estudio se evaluaron ASH2a transcripción mediante el uso de RT-PCR y comparación de los patrones de expresión Hist2h2aa2 y ASH2a mediante qRT-PCR.

En primer lugar, se ADNc sintetizado utilizando el azar hexamer oligonucleótido de ARN a partir de la Hepa 1-6, 3T3, y líneas de células LLC. RT-PCR se realizó durante dos objetivos, el sentido-antisentido superposición región (entre F1 y R1 en la Fig. 1], y la superposición de la región más antisentido-única región (entre F1 y R2 en la Fig. 1]. Todos los productos PCR de las dos metas que esperaba tamaños (Fig. 2a]. Para comprobar los productos PCR, digerido con PstI PstI (Fig. 2b]. Todos los resúmenes de los productos PCR de la región habían previsto los tamaños (251 y 267 pb para el sentido-antisentido superposición regiones; 251 y 858 pb de la región además de la superposición-única en antisentido regiones).

En segundo lugar, para dilucidar la expresión de ASH2a, transcribe el primer capítulo-con cDNA primer R3, que hybridizes específicamente a ASH2a. Un producto de la espera tamaño (685 pb) fue obtenido (Fig. 2c]. Además, EcoRI EcoRI digerido el producto de PCR a 269 - y 416-bp fragmentos (Fig. 2c]. Estos resultados son consistentes con la secuencia de nucleótidos de ASH2a.

Debido a que la secuencia de la Hist2h2aa2 transcripción no es único, que se superponen completamente por el ASH2a secuencia, el nivel de expresión detectados por qRT-PCR usando primers aleatoria es la suma de los Hist2h2aa2 y ASH2a niveles (Fig. 1]. Porque ASH2a tiene una única secuencia, el nivel de expresión de esta transcripción antisentido pueden ser detectados por separado. Observación mediante qRT-PCR indicaron que la suma de los Hist2h2aa2 y ASH2a niveles de expresión siempre fue mucho más alto que el nivel de ASH2a (Fig. 3]. La diferencia entre ambos valores _T C es de más de 4. Por lo tanto, estima que la expresión de Hist2h2aa2 y ASH2a como la de Hist2h2aa2 en el siguiente estudio. Junto con la progresión del ciclo celular de la fase S, la expresión de Hist2h2aa2 aumentó y alcanzó un máximo de 2 a 4 h, y luego disminuyó (Fig. 4]. Después de eso, se incrementó de nuevo, pero la expresión nivel fue inferior a la fase S-pico. Así, la expresión es la más alta en medio de la fase S-. Por otro lado, el de ASH2a llegaron a un máximo de 1 h, y se redujo posteriormente a nivel basal (Fig. 4]. La tasa de aumento de la ASH2a RNA fue inferior a la de Hist2h2aa2 ARN.

Un antisentido transcripción de la histona H2a (ASH2a) fue claramente expresada en tres líneas celulares de ratón, Hepa 1-6, 3T3, y LLC. Este resultado sugiere que ASH2a no se regula con especificidad tisular. Se verificaron las regiones de aguas arriba y la ASH2a regiones promotoras de los genes del ratón histona H2a. Todos los promotores de la replicación dependiente de genes histona H2a incluir CCAAT y cajas TATA [13]. Por otra parte, la región aguas arriba de ASH2a carece de dicha estructura (Fig. 1]. Esta región tiene un G + C-secuencia rica, pero carece de ambas cajas TATA y CCAAT (Fig. 1]. Por lo tanto, la regulación de ASH2a se sugiere con énfasis a la diferencia de los de replicación de los genes que dependen de la histona H2a.

Para comprobar la sincronización de las células, se compararon los patrones de expresión de la replicación de genes que dependen de la histona Hist2h2aa2 y la replicación independiente del gen histona H2afz [16]. Hepa 1-6 células utilizadas en el presente estudio fueron bien sincronizados. De hecho, el patrón de expresión de ASH2a era diferente de la de Hist2h2aa2. La cantidad de ARN sentido fue siempre muy superior a la de ASH2a ARN en cada punto del tiempo. Tres funciones generales de antisentido transcripciones han sido identificados: transcripcional interferencia, ARN de enmascaramiento, y dependiente de dsRNA mecanismos, incluida la interferencia del RNA [17]. Estas funciones están relacionadas con la inhibición y / o degradación de los ARN's sentido. Si ASH2a está relacionada con la degradación del sentido de ARN a través de la formación de dsRNA, ASH2a se expresó cuando el sentido de ARN disminuye. Sin embargo, ASH2a se expresa durante las primeras aumento de la sensación de ARN.

Por otra parte, podría ASH2a hibridación no sólo a la transcripción Hist2h2aa2, sino también a las transcripciones de los otros histona H2a codificación de los genes-, a causa de la elevada similitud de las secuencias de codificación de la proteína. Un artículo reciente mostró que una pequeña modulador dsRNA puede funcionar como un activador de genes relacionados [18], y el mecanismo de acción parece estar mediada a través de un dsRNA / interacción de proteínas, en lugar de a través de ARNsi o miARN. Curiosamente, ASH2a incluye no sólo una secuencia complementaria a la del Hist2h2aa2 transcripción, sino también una secuencia complementaria a la región promotora de Hist2h2aa2. Se requiere un trabajo adicional para dilucidar la función de la ASH2a relacionados con dsRNA.

Los experimentos usando la alta densidad de oligonucleótidos arrays muestran que una gran población de RNAs no se expresan y regulada por mecanismos moleculares similares a los que participan en el control de la codificación de la proteína-ARN [19] y que muchas transcripciones parecen estar en muy baja abundancia [ 20]. Es tan importante para la investigación sobre el genoma, para aclarar las funciones y la regulación de los no ARN y ARN antisentido en muy baja abundancia como ASH2a.

Murino hepatoma línea celular Hepa 1-6, línea celular de fibroblastos Flp-en-3T3 (Invitrogen), y la línea del cáncer de pulmón de células LLC se cultivaron en MEDM complementado con un 10% de suero de ternera fetal.

Hepa 1-6 células se sincronizaron al final de la fase G1 mediante la adición de timidina-hidroxiurea. La detención del ciclo celular fue puesto en libertad por lavado de la timidina-hidroxiurea, y luego las células fueron cosechadas a intervalos de 1 h de 0 h a 12 h.

Total de las fracciones de ARN extraído de células de ratón fueron pre-tratados con DNasa Iy utilizado para RT-PCR. Mezcla de reacción que contiene el RNA (aproximadamente 0,5 μ g) y el primer capítulo específico (3,3 pmol) o cebadores aleatorios hexamer fue desnaturalizado a 70 ° C, y, a continuación, la transcripción inversa-reacción se hizo con Superíndice III (Invitrogen), según el manual. Entonces el cDNA fue amplificado por PCR en la modalidad de 35 o 40 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 54 ° C, y 1 o 2 min a 72 ° C. Las secuencias de los primers se muestra en la Fig. 1. Por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR), aproximadamente el 12,5 ng de RNA total se utilizó para la transcripción reversa seguida de la amplificación de PCR con cebadores qF1 y R1, o qF2 y R2 (Fig. 1] en la mezcla de reacción que contiene SYBR premezcla Ex Taq ( Takara) en un ABI PRISM 7700 sistema de detección de secuencias (Applied Biosystems). Las condiciones de PCR fueron un paso inicial de 30 s a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de 5 s a 95 ° C y 30 s a 60 ° C. Se evaluó la expresión de la evaluación de ciclo umbral (C _T) valores. La cantidad relativa de RNA expresado se calculó utilizando Livak y Schmittgen del método [21]. La cuantificación de la GAPDH (glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa) mRNA (primers 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 'y 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3'; producto tamaño 76 pb) se utilizó como control para la normalización de datos. La qRT-PCR se realizaron análisis de cuatro veces.

HN diseñado este estudio, llevado a cabo los estudios de biología molecular. YT llevó a cabo la sincronización de las células y PCR cuantitativa. YO YH y participó en el diseño de este estudio.