Cancer Cell International, 2005; 5: 14-14 (más artículos en esta revista)

Etapa tardía hematógena inhibición de la metástasis de melanoma por cystatin C sobre expresión

BioMed Central
Heather Ervin (hervin@truman.edu) [1], James L Cox (jcox@atsu.edu) [1]
[1] Department of Biochemistry, Kirksville College of Osteopathic Medicine, 800 West Jefferson, Kirksville, Missouri 63501-1497 USA

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Resumen
Antecedentes

Metástasis tumoral es una causa frecuente de fracaso del tratamiento para los pacientes con cáncer. Una de las principales características de las células del cáncer metastásico es su capacidad invasora. Cisteína proteasas contribuyen a las propiedades invasivas de muchos tipos de células de cáncer. Analizar la contribución de las proteasas cisteína a la metástasis que hemos sobre-expresadas en las células del melanoma B16 natural inhibidor de la proteasa cisteína, cystatin C. Se midió in vitro invasión de cystatin de expresión de los clones con Boyden cámara de ensayos de tipo. Cola-vena inyecciones de células se utilizaron para comparar la colonización tumor de pulmón. Subcutánea crecimiento tumoral y la metástasis de las células tumorales del tumor primario fue también analizado. La apoptosis de las células tumorales se midió en los tejidos del pulmón después de la inyección de células de melanoma.

Resultados

Los resultados muestran la invasión in vitro de cystatin C exceso de las células que expresan dramáticamente se inhibió. Tumor de pulmón de la colonización también se redujo. El aumento de la apoptosis de las células tumorales se encontró que era un factor importante y puede estar relacionada con la reducción de la carga tumoral se observa en este sistema de metástasis de melanoma.

Conclusión

Cisteína proteasas, por lo tanto, puede ser un objetivo para futuras terapias contra la metástasis.

Antecedentes

Metástasis tumoral es una de las principales razones para el fracaso del tratamiento en pacientes con cáncer. Invasión de los tejidos de acogida es una característica más distintiva de metástasis y requiere alteraciones en la adhesión celular tumoral, la migración celular, la degradación proteolítica y de las matrices de tejidos [1, 2]. Un primer paso fundamental es que la metástasis de las células tumorales entrar en los vasos sanguíneos o el sistema linfático, por invasión de la membrana basal de acogida. Después de ser dispersados a través de espacios vasculares, tumor de células de presentar metástasis distante en los capilares. Finales de las fases de metástasis implicar la adopción de nuevas medidas incluida la invasión de espacios vasculares extranjera en el crecimiento de los tejidos y las metástasis secundaria en ambientes permisivos (semilla y el suelo hipótesis) [2]. El crecimiento de las metástasis en tejidos requiere también de acogida invasión de las células endoteliales del tumor en masas para apoyar aún más las necesidades metabólicas de crecimiento tumoral [3].

Miembros de la papaína cisteína proteasa familia de enzimas (principalmente cathepsins B, H, L) se encuentra elevado en las células del cáncer y contribuir a la invasión de muchos tipos de tumores [4, 5]. Esta alta actividad de la proteasa cisteína influye en la actividad de otras enzimas proteolíticas durante la adquisición de un fenotipo invasivo [6]. Cisteína proteasas contribuyen a crear un fenotipo invasivo en uno o más pasos en la progresión tumoral de metástasis [7]. Se carece de detalles en el papel exacto de cisteína proteasas en la progresión tumoral, pero es evidente que muy metastásico variantes de los diversos tipos de tumores expresan un exceso de actividad de la proteasa cisteína proteasa papaína tipo [8]. Porque elevados de actividad de la proteasa cisteína se correlaciona muy bien con los cánceres invasivos, la inhibición de esta actividad puede ser un objetivo para las terapias contra la metástasis.

Cystatins son potentes inhibidores de las proteasas de cisteína que se encuentran en todos los tejidos y fluidos biológicos más. En general, una disminución de los niveles de inhibidor de la proteasa cisteína se encuentra también en tumores metastásicos, lo que contribuye al aumento de los niveles de la proteasa cisteína [9]. Cystatin C es un tipo II cisteína inhibidor de la proteasa que es normalmente secretada de las células [10]. Anteriormente hemos investigado el papel de los inhibidores de la proteasa cisteína naturales, cystatin C, y se encontró inhibición de la metástasis de pulmón [11]. Para ayudar a establecer el mecanismo de acción cystatin C en la metástasis hemos fusionado cystatin C de la N-terminal de la proteína verde fluorescente. En este estudio se muestra la sobre expresión de cystatin C en las células del melanoma se asocia con la reducción de metástasis y el aumento de la apoptosis en los tejidos del pulmón.

Resultados
Expresión de cystatin C-GFP fusión

La expresión de cystatin C-GFP fusión se observó en las células del melanoma B16F10 siguientes transfección transitoria de la construcción de ADN plásmido. La microscopía confocal se utilizó en un intento de localizar cystatin C-GFP expresión de la proteína en las células. Una expresión citoplásmica se señaló para GFP solo y cystatin C-GFP fusión transitoriamente cuando se expresa en las células del melanoma B16 (Figura 1]. Este patrón de expresión no se habían previsto desde cystatin C es principalmente una proteína secretada que deberían haber producido una vesicular localización de fluorescencia dentro de la célula. La Figura 2 muestra la expresión de cystatin C-proteína de fusión GFP. Cystatin C fusionados a las buenas prácticas agrarias debe ser de alrededor de 44 kD (30 kD GFP más 14 kD cystatin) y también ha formado multimers en virtud de las condiciones de desnaturalización. Recientemente Paraoan et al. Han descrito citoplásmica distribución de los humanos cystatin C mutado en el péptido señal [16]. Del mismo modo, el análisis de secuencias de RT-PCR reveló un producto aminoácido péptido señal de diferencia (-4 → Gly Ala) entre Balb c (inserta cDNA) y B16 melanoma cystatin C ARN mensajero (endógeno) (datos no presentados). Estamos recloned la cystatin C-GFP fusión y re-construir transfectadas el ADN y obtuvo idénticos resultados. Creemos cystatin C de expresión de los efectos se deben principalmente a intracelular de expresión en nuestro modelo de células de melanoma B16.

Actividad de la proteasa cisteína

El total de la proteasa cisteína actividad celular se midió con un ensayo sensible fluorométricos. Este ensayo indirectamente medidas de los niveles de inhibidor de la proteasa en la célula como cystatins menudo se encuentran en niveles bajos. El cuadro 1 muestra disminución de la actividad de la proteasa cisteína cystatin C sobre expresión clon c23. La mayoría de los celulares de proteasa cisteína actividad se localiza a lisosomas que no será modificada por cystatin alterado los niveles.

In vitro invasión de melanoma B16 es inhibida por cystatin C sobre expresión

Una característica importante de metástasis es la capacidad invasiva de las células tumorales. Nosotros usamos una cámara de Boyden in vitro de ensayo para cuantificar el potencial invasor de nuestras líneas clonal. [17]. La sobreexpresión de la cystatin C-GFP (c23, c28) disminuyó la invasión de las células del melanoma B16F10 Matrigel revestido a través de los filtros por cerca del 90% en relación con el control de las células G1 (GFP transfectadas) (Fig 3]. Cystatin-GFP fusión clones se comportan de manera similar a cystatin sobre-expresión de los clones sin la fusión GFP. Tasa de crecimiento es el mismo que el control de la adherencia es la misma que la de control, y la migración de células es reducido en comparación con el control ([12] y observaciones personales)

Cystatin C de expresión de la colonización pulmonar reduce y aumenta la supervivencia en ratones

Se examinó el efecto de cystatin C sobre-expresión en el crecimiento del tumor de pulmón y la supervivencia global de la cola de ratones inyectados a través de la vena. Cola vena inyecciones son medidas de finales de etapa experimental o metástasis sólo por la inicial de la invasión y intravasation están rodeados. La hipótesis de que la gran disminución medido in vitro para la invasión podría dar lugar a reducciones similares en la colonización de pulmón en ratones. A pesar de que mide una disminución de la carga tumoral pulmonar después de la inyección en vena de cola cystatin C, la sobre-expresión de clon, clon todavía este resultado en la colonización del tumor (Tabla 2]. Seguidamente, examinó el efecto de cystatin C sobre-expresión en la supervivencia de los ratones inyectados con células de melanoma B16F10 y encontró alrededor de un 10% de aumento de la mediana del tiempo de supervivencia (Figura 4]. Nuestra conclusión de estos datos es que la sobre expresión de cystatin C, mientras que la disminución de la carga tumoral, las causas sólo modesto aumento en la supervivencia de los animales después de la inyección de cola vena de las células del melanoma. Nos muestran que una gran disminución de la capacidad invasora con melanoma cystatin sobre expresión por sí sola no impedir posterior crecimiento de las metástasis.

Subcutánea crecimiento de melanoma B16 con cystatin C sobre expresión es similar a la de control

Se compara el crecimiento de la subcutánea B16 melanoma cystatin C, el control y la sobre-expresión de los clones en syngeneic C57 BL6 ratones. Tras subcutánea, escapular inyección de B16 tumor de las células de melanoma, los tumores se mensurables por calibradores después de unos diez días. Figura 5 muestra la evolución relativa de los tumores en ratones subcutánea. Una ligera disminución en el crecimiento de tumores subcutáneos se observó un cystatin C sobre expresión clon. En otro experimento se comparó la relación de pulmón metástasis de las células del melanoma procedentes de tumores subcutáneos. Estas metástasis pulmonares secundarias se cuantificaron en 14 días después de la inyección subcutánea de G1, ya sea clon o clones c23. Después del sacrificio de los ratones, el tumor de carga fue estimada por S100 tinción de los tejidos de los pulmones congelados secciones transversales. Se encontró una significativa reducción de la metástasis pulmonar primaria de los tumores subcutáneos a cystatin C sobre expresión (Tabla 3].

La apoptosis de micrometástasis se incrementa con cystatin C sobre expresión

Se examinó la distribución de las dos células de la etiqueta y las buenas prácticas agrarias cystatin C-GFP etiquetados células en el tejido pulmonar a las 24 horas siguientes a la inyección de cola vena. El cystatin C-GFP fusión de productos que hemos introducido en el melanoma B16 F10 nos permitió seguir la distribución de las células metastásicas en los animales. El melanoma densidad celular en el pulmón y el melanoma distribuciones fueron similares en los dos etiquetados y GFP cystatin C-GFP clones (datos no presentados). Esta observación sugiere la entrega de las células tumorales de cada clon a los capilares pulmonares es equivalente y no pueden dar cuenta de las diferencias en los siguientes, la carga de tumor pulmonar. Nosotros en cambio se centró en el crecimiento del tumor en fase avanzada metástasis. Un examen de la apoptosis de las células de melanoma en los primeros tiempos después de la siembra de tejido pulmonar de células de melanoma tumor da una idea de producto en etapas posteriores. Una semana después de las células de melanoma cola-vena de inyección, extirparon el tejido pulmonar y se examinaron los niveles de apoptosis. Se utilizó el Dead-End TUNEL de ensayo para cuantificar apoptosis en secciones de tejido congelado. Figura 6 muestra las secciones de tejido teñido de las células apoptóticas en una semana después de la inyección. Cuantificación de la apoptosis muestran una media de dos veces más de apoptosis en las células del melanoma dentro de los tejidos de los pulmones de los animales inyectados con cystatin C sobre-expresión de las células (Tabla 4]. Así, el aumento de la apoptosis de pulmón de células de melanoma B16 metástasis, se correlaciona con una disminución de la carga tumoral a cystatin C sobre expresión.

Discusión

Bloqueo de la propagación del cáncer metastásico podría proporcionar mejoras dramáticas clínica para el tratamiento de pacientes con cáncer. El bloqueo terapéutico de las metástasis es un reto formidable debido a muchos factores, entre ellos los mecanismos redundantes invasión de las células metastásicas, la adquisición de la resistencia a quimioterápicos, de acogida y de la evasión de la respuesta inmune. A pesar de estos problemas, la inhibición de la invasión y metástasis de células podría ser un posible tratamiento para la enfermedad metastásica. Hemos encontrado previamente cystatin C sobre expresión inhibe tanto la migración de células de melanoma y metástasis [12]. En este trabajo, expresión de cystatin C fusionado a GFP también mostró un notable inhibición de la invasión in vitro de las células del melanoma B16. El número de metástasis pulmonares después de la inyección de cola de la vena se redujeron, no obstante el crecimiento de tumores subcutáneos melanoma sobre-expresión de cystatin C fue sólo ligeramente inhibido. La expresión de cystatin C fusionado a GFP obtuvimos exhibido principalmente localización citosólica. Otro grupo ha informado de la localización citosólica de GFP-etiquetados cystatin C debido a un péptido señal de mutación [16]. Hemos observado un cambio de aminoácidos cerca de la señal de péptido sitio división celular anormal y sugerir la distribución puede resultar. El punto es, nuestros resultados en la metástasis de melanoma sólo se refieren a la sobre expresión intracelular de cystatin C.

Hemos demostrado cystatin sobre-expresión en las células del melanoma parece resultar en un aumento de la apoptosis en el pulmón micrometástasis in vivo. El crecimiento de las metástasis secundaria se considera de la limitación de velocidad en la cascada metastásica del tumor de propagación [18, 19]. Sobre expresión de la metalloprotease inhibidor TIMP-1 no bloquea B16 melanoma extravasación de células en tejido pulmonar, pero sí modificar posteriormente el crecimiento del tumor dentro de los tejidos de los pulmones [20]. Nuestro trabajo apoya la idea de que la inhibición de la invasión celular por sí solo no es suficiente para evitar la colonización por tejido pulmonar metastásico de células [21]. En este trabajo demuestran que la apoptosis es el aumento de micrometástasis en el pulmón, cuando la invasión de células de melanoma es inhibida por cystatin C sobre expresión. El aumento de la apoptosis de las células tumorales puede ser el resultado de alteraciones en el microambiente tumoral de células in vivo, por ejemplo, alteraciones en la adhesión celular tumoral local o liberación de factores de crecimiento necesarios para la supervivencia de las células tumorales. La inhibición de la angiogénesis es probablemente no, porque después de participar en una semana de análisis, prácticamente todos los micrometástasis fueron sólo unas pocas células de diámetro. En general, la angiogénesis comienza sólo como tamaño tumoral enfoques 1 mm [22].

Cystatin efectos adicionales sobre la metástasis de las células del melanoma cabría esperar si nuestros melanoma cystatin sobre-expresión de los clones habían secretado cystatin C. múltiples funciones extracelular catepsina B se han sugerido, incluyendo degradación de la matriz [23]. Un inhibidor de la síntesis de cisteína proteasas se ha encontrado para reducir la metástasis en un modelo de cáncer de colon, sin embargo el punto de bloquear metastásico no se define [24]. Recientemente, Konduri et al. [25] han puesto de manifiesto la sobre expresión de cystatin C en células de glioblastoma bloques de invasión de células tumorales y el crecimiento del tumor in vivo, sin embargo en su sistema cystatin C es secretada.

Conclusión

Melanoma metastásico es una rápida expansión y creciente tipo de cáncer que impide prácticamente todos los intentos de detener el crecimiento. Bloqueo de metástasis permitiría mejorar los tratamientos actuales de melanoma que están principalmente dirigidos a la proliferación de las células tumorales. Hemos encontrado que cystatin C sobre expresión reduce drásticamente la invasión de células de melanoma. Etapa tardía metástasis está influida por cystatin C sobre-expresión de las células por un aparente aumento de la apoptosis en el tejido diana (en este caso, de pulmón). Nuestros resultados indican que la inhibición de la invasión celular por sí solo no es suficiente para mejorar de manera espectacular la supervivencia de ratones con melanoma en etapa avanzada metastásica. Más resultados favorables pueden ocurrir en etapas anteriores de metástasis intervención con agentes anti-invasivos o combinados con terapias dirigidas al crecimiento del tumor y / o angiogénesis.

Métodos
Cultivo de células

El B16-F10 melanoma línea celular fue proporcionado amablemente por el Dr I. Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Las células fueron cultivadas en platos de plástico sobre la cultura como monocapas en RPMI-1640 los medios de comunicación con 10% de suero fetal bovino (v / v) y se complementa con antibióticos (100 unidades de penicilina, estreptomicina 0,1 mg, 0,25 μ g anfotericina B por mililitro) (Sigma). Las células se cultivaron en el 5% de CO 2 humidificado ambiente a 37 ° C hasta cerca de la confluencia.

ADN de células y construye transfections

Murino cystatin C cDNA fue descrito en un trabajo previo [12]. Fusión de cystatin C cDNA a la N-terminal de la proteína verde fluorescente (GFP) (Invitrogen) se llevó a cabo con un fragmento de la fusión de dos recocidos oligos (5'-CTGCAAAAATGCCA-3 ', 5'-CGTGGCATTTTTGCAG3') (Integrado de ADN Tecnologías, Corallville, Iowa). Ligated ADN se transformó en DH5a E. Coli células por electroporación con un Biorad Gene Emisores siguiente las instrucciones del fabricante. Fusión clones fueron confirmados por análisis de restricción y lisis de ADN se utiliza para la transfección de células de melanoma B16. Transfección de ADN plásmido en las células del melanoma B16 F10 se llevó a cabo por el método de fosfato de calcio [13]. Células fueron transfectadas transitoriamente imágenes de microscopía confocal por uno o dos días después de transfección. Estable transformantes fueron seleccionados en los medios de comunicación que contiene G418 (geneticin) (Sigma) a dosis de 1 mg / ml. Tres líneas clonal fueron elegidos para el estudio después de tres semanas de selección: un clon de control de las buenas prácticas agrarias (designadas G1) y dos cystatin sobre-expresión de los clones (designado c23 y c28).

Western blot

B16 melanoma F10 clon c23 fue aumentado a cerca de la confluencia y lisadas con amortiguación (0,1% Tritón X-100 en PBS con 1% de los inhibidores de la proteasa (Sigma)) a través de tres ciclos de congelación y deshielo se centrifuga a las 10 krpm durante 5 minutos a la bolita de células desechos. Extractos de células (40 ug) se ejecute el 10% SDS PAGE geles y electro-borró a membranas PVDF para la detección de anticuerpos. Humanos cystatin C (1 ug) (Calbiochem) se ejecuta como un control. Conejo anti-humano cystatin C (Upstate Biotecnología) se utilizó en la dilución 1:1000. Secundaria de anticuerpos, de cabra anti-conejo HRP (Upstate Biotecnología) se utilizó en la detección y 1:1000 fue por luminiscencia sistema ECL. (Amersham). Proteína se determinó por el ensayo de Bradford.

Determinación de la actividad de la proteasa cisteína

Se utilizó un ensayo para medir fluorométricos total de la actividad celular cisteína proteasa [14]. Este ensayo indirectamente medidas de los niveles de inhibidor de la proteasa cisteína que son difíciles de medir directamente debido a los bajos niveles. Cualquiera de G1 (GFP) o c23 (cystatin C-fusión GFP) células fueron sembradas en el 5 × 10 4 células por 24 y así en una placa de cultivo celular. Después de 16 horas el crecimiento de las células se incubaron con buffer PAB (Hank salina tamponada más del 0,6 mM CaCl 2, 0,6 mM de MgCl 2, 2 mM de cisteína, y 25 mM pH7.0 TUBERIAS) durante 30 minutos a 37 ° C. El buffer fue sustituido con 0,2 ml de la misma solución tampón que contiene 0,1% Tritón X-100 y 100 uM Z-Phe-Arg AMC (Enzyme Systems Products, Livermore, CA). Después de 20 minutos más de incubación a 37 ° C, fluorescencia fue leído en un BioTek flx800 fluorescentes lector de placas a 360 excitation/460 de emisión y los resultados se expresaron en unidades de fluorescencia relativa. El ensayo resultó ser lineal durante 30 minutos en las condiciones utilizadas.

Invasión celular

Sub-B16 F10 confluente o permanentemente transfectadas las células de melanoma B16 clones fueron separadas con tripsina / EDTA solución (0,25%, a 5 minutos) (Sigma). Después de la inactivación de la tripsina por adición de un volumen igual de suero que contienen los medios de comunicación, las células se contó con un hemocitómetro. Células (2 × 10 4) se colocaron arriba en los pozos de las cámaras de Boyden (BD Biosciences), los filtros (8 um tamaño de poro, Osmonics, Inc) pre-recubiertos con Matrigel (65 ug / filtro) [12]. Cell invasión se permitió que se producen durante 24 horas, tiempo después del cual las células fueron fijadas y teñidas [metanol, 10 minutos; 0,1% Tritón X-100, a 2 minutos; hematoxilina Harris (Sigma), a 10 minutos]. Después de 24 horas, las células en la parte inferior del mismo se contó con un invertido Olympus IMT-2 microscopio a 400 × magnificación. El número de células para 18 campos se resume para cada filtro.

La curva de supervivencia

Se realizó un experimento donde los ratones (siete ratones por grupo) se inyecta cola vena (1 × 10 5 células por ratón), ya sea con control de las buenas prácticas agrarias (G1) o cystatin C-GFP fusión clon (c23). Los ratones fueron seguidos hasta el momento de la muerte o fueron moribundo en cuyo caso los ratones fueron sacrificados.

- Ensayos metástasis de pulmón

Clones G1 y se c23 crecido a cerca de la confluencia con la tripsina y separados solución. Tripsina fue neutralizada con un volumen igual de medios de cultivo de células y lavados dos veces con buffer fosfato salino (PBS). Las células se re-suspendió en PBS y 1 × 10 5 fueron inyectadas en las venas de la cola de ratones C57BL6 mujeres (siete por cada grupo). Después de 30 días los ratones fueron sacrificados y se extirparon los tejidos del pulmón. Superficie de los tumores de pulmón fueron contados en virtud de un poder de bajo microscopio de disección.

Subcutánea crecimiento tumoral

Las células de los clones someterse a la prueba (G1 y c23) fueron aumentado a cerca de confluencia, separadas con el tratamiento breve de tripsina, y lavados dos veces con PBS. Después de volver a la suspensión en PBS, las células (3 × 10 5) se inyecta por vía subcutánea en las regiones escapular de ratones C57BL6 (seis ratones por grupo). Cuando comenzaron a aparecer los tumores (después de unos diez días), tumor de diámetro se midió en días sucesivos en dos direcciones ortogonales con calibradores. Tumor volúmenes se calcularon con la fórmula V = (a 2 × b) / 2, a = b = anchura y la longitud, en milímetros [15].

Metástasis de pulmón ensayo de tumores subcutáneos

C57BL6 ratones (6 ratones por grupo) fueron inoculados por vía subcutánea con tanto clon G1 o clon c23 células en el 2 × 10 5 células por ratón. Luego de 3 semanas los ratones fueron sacrificados y se eliminaron los pulmones y congelado en la sección de medios de comunicación OCT. Secciones de tejido congelado (10 uM) de cada muestra de tejido pulmonar se tiñeron con anticuerpos S100 (DAKO, dilución 1:1000) y detectado inmunológicamente con un segundo anticuerpo peroxidasa de rábano (Sigma, 1:1000). Imágenes microscópicas (100 ×), de secciones de tejido teñidas fueron recogidos a partir del 4 de los ratones en cada grupo. Cuantificación de la zona manchada por sección se llevó a cabo con la imagen J (NIH software).

La apoptosis de las células tumorales de pulmón

Ratones (C57BL6, 3-4 animales por grupo) fueron inyectados con B16 F10 clones G1 (GFP), o c23 (cystatin C-GFP) en el 1 × 10 5 células de la cola a través de la vena. Después de una semana los ratones fueron sacrificados y se eliminó el tejido pulmonar. Pulmón se almacena en los tejidos que incluyen compuestos OCT (Miles Inc) la noche a 4 ° C, y luego congeladas a -80 ° C. Secciones de tejido congelado (10 um) y se prepararon para TUNEL manchadas con la reactividad Dead-End TUNEL kit (Promega) coverslips directamente sobre el vidrio. Los fabricantes se han seguido con instrucciones de lado a lado, la tinción de G1 y c23. Células teñidas se resumió durante al menos cinco × 200 campos microscópicos por la sección de tejidos y seis secciones independientes por animal. El número medio de células apoptóticas por campo de alta potencia se registraron ± sd

Lista de abreviaturas

GFP, proteína verde fluorescente; AMC, 7-amino-4-methylcoumarin; PBS, Solución salina tamponada con fosfato; ECL, de luminiscencia química reforzada.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Excmo llevado a cabo ensayos de la apoptosis, occidental blot, y el mantenimiento de células. JC realizó el resto de los procedimientos y redactó el manuscrito.

Agradecimientos

Los autores Moninger las gracias a Tom, de la Universidad de Iowa para la asistencia con la imagen confocal.