Cancer Cell International, 2005; 5: 16-16 (más artículos en esta revista)

Proton-inducida de emisión de rayos X (PIXE) y de Análisis de la cadena de ADN-Break estudio en ratas hepatocarcinogenesis: Un posible papel quimioprotector combinado de vanadio y de la administración de suplementos de beta-caroteno

BioMed Central
Mitali Basu Chattopadhyay (mitali_bchatterjee@yahoo.co.in) [1], Sutapa Mukherjee (mcbiochem@yahoo.com) [1], Indira Kulkarni (mcbiochem@yahoo.com) [1], V Vijayan (mcbiochem@yahoo.com ) [2], Manika Doloi (mcbiochem@yahoo.com) [3], NB Kanjilal (mcbiochem@yahoo.com) [1], malayo Chatterjee (mcbiochem@yahoo.com) [1]
[1] Division of Biochemistry, Department of Pharmaceutical Technology Jadavpur University, Kolkata 700 032, India
[2] Instituto de Física, Sachivalaya Marg, Bhubaneswar - 751005, Orissa, India
[3] All Indian Institute of Hygiene and Public Health, Kolkata 700 072, India

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen

Efecto combinado de vanadio y beta-caroteno en el hígado de la rata romper la cadena de ADN inducidas por protones y rayos X de emisión (PIXE), el análisis se estudió durante un necrogenic dosis (200 mg / kg de peso corporal), de dietílico Nitrosamine (DENA) inducida por el hígado de la rata Carcinogénesis. Morfológico e histopatológico se observaron cambios como un punto final biomarcador. La administración de suplementos de vanadio (0,5 ppm ad libitum) en el agua potable y el beta-caroteno en la dieta basal (120 mg / Kg de peso corporal) se realizaron cuatro semanas antes de DENA tratamiento y continuó hasta el final del experimento (16 semanas). PIXE análisis reveló la restauración de cerca el valor normal de zinc, el cobre, y hierro, que se altere sustancialmente en comparación con los grupos tratados carcinógeno. Tanto de la administración de suplementos de vanadio y beta-caroteno DENA cuatro semanas antes de la inyección se encontró a ofrecer importantes (64,73%, P <0,001), la protección contra la generación de un solo capítulo rompe en comparación con el control carcinógeno contrarrestar partes. Una parte importante de estabilización de la arquitectura hepática de las células se observó, en comparación con el control de carcinógeno en vanadio más beta-caroteno grupo tratado. Por lo tanto, este estudio sugiere que el vanadio, pero prooxidante rendimiento potencial agente terapéutico seguro y eficaz formulación farmacológico con beta-caroteno, un antioxidante, en la inhibición de la rata experimental hepatocarcinogenesis.

Antecedentes

Oligoelemento estudios sobre el cáncer y tejidos normales han interesado grupos de investigadores durante muchos años [1]. La acumulación de pruebas demostró que muchos esencial / oligoelementos desempeñan un papel importante en una serie de procesos biológicos mediante la activación o inhibición de reacciones enzimáticas, que compiten por la permeabilidad de las membranas celulares, el mantenimiento de la estabilidad genómica y / o por otros mecanismos. Es por lo tanto, razonable pensar que este elemento podría ejercer la acción, directa o indirectamente en el proceso carcinogénico [1, 2]. La técnica de PIXE (Proton inducida de emisión de rayos X), ya que su introducción ha sido utilizado con éxito por diversos grupos en todo el mundo para localizar análisis elemental de muestras biomédicas debido a la alta sensibilidad, y su capacidad multicomponente no destructivas de la naturaleza [3].

Vanadio (V), que es un endógeno constitutivos de la totalidad o la mayoría de tejidos de mamíferos, se cree que tienen un papel regulador en el sistema biológico [4]. Estudios anteriores de nuestro laboratorio [5] y de otros laboratorios [6, 7] han establecido V como un importante regulador biológica en la evaluación de la situación fisiológica y bioquímica de los animales en una dosis relacionadas manera [6]. Se ha demostrado que V en el 0,5 ppm en el agua potable es eficaz en la inhibición de la inducción química de dos etapas rat hepatocarcinogenesis sin ninguna manifestación tóxicos [8]. Los datos de varios experimentos con animales se estableció el papel de beta-caroteno (BC) como antioxidante e incluso como agente contra el cáncer. [9]. BC ha resultado ser profiláctico UV y cancerígeno para los cánceres de la piel, glándula mamaria, la bolsa epitelios bucal y de colon en modelos animales [10, 11]. Este trabajo actual se orienta a dilucidar la eficacia de los oligoelementos y los antioxidantes V aC cuando se administran juntos pueden prevenir de manera eficaz la transformación de las células neoplásicas de hígado tratados con una sola dosis necrogenic de diethylnitrosamine (DENA).

El uso de la inyección única de DENA permite la observación de la quimioprotector potencial de la V aC y en combinación en la fase de iniciación de hepatocarcinogenesis por romper la cadena de análisis de ADN. Filamento de la DNA se puede detectar con gran sensibilidad por los métodos que utilizan la observación de la función de la anulación de los dos filamento de la DNA [12]. En este estudio, hemos utilizado una técnica de análisis de ADN fluorimétrica anulación (FADU) con un tinte fluorescente para el seguimiento de ADN anulación, de acuerdo con nuestro método de Sarkar et al., De 1997 [13]. Además, un estudio de 16 semanas se realizó en primer lugar, para demostrar la respuesta protectora de la administración de suplementos combinados de V aC y en la modulación morfológicas, cambios histopatológicos y la segunda para examinar la función de las concentraciones de micronutrientes en el proceso carcinogénico.

La información sobre el efecto combinado de vanadio y beta-caroteno y antineoplásicos su potencial es todavía escaso. En esta comunicación, nos informe de la primera vez que el oligoelemento, vanadio, en combinación con antioxidantes, beta-caroteno puede modular la actividad o la condición o la concentración de otros elementos en particular, la dosis y tienden a estabiliza el genoma, en cierta medida, En la carcinogénesis química.

Materiales y métodos
Animales y dieta

Ratas Sprague Dawley, machos 80-100 g de peso al inicio se obtuvieron del Instituto Indio de la Química Biología (CSIR), Calcuta 32, la India y mantiene en la norma dieta basal. Hemos seguido las recomendaciones de la guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio para el mantenimiento, el tratamiento y el sacrificio de los animales utilizados en este estudio.

Diseño experimental

Dos series distintas de las ratas fueron utilizados para el estudio PIXE una para el análisis y estudio histopatológico (Set-I), otro para el ensayo de ADN Strand (Set-II). En Set-I, las ratas fueron divididas en ocho (8) grupos (Fig. 1] con diez ratas en cada uno. En el grupo B, C, D y E, hepatocarcinogenesis fue iniciado por una única intraperitoneal (ip) DENA en la inyección de una dosis de 200 mg / Kg de peso corporal en cloruro sódico al 0,9% [8, 15] en la semana cuatro. Normal vehículo de control de las ratas (Grupo A) sólo recibió solución de cloruro de sodio hasta el final del experimento (16 semanas). V (como amonio monovanadate) se complementó con una dosis de 0,5 ppm en el agua potable ad libitum [8] y se le dio BC En la dieta base en un régimen de 120 mg / Kg de peso corporal [13], seis días a la semana durante todo el período de estudio. Grupo B fueron los DENA ratas controles, el grupo C se complementaron con sólo V, grupo D ratas fueron tratados con BC y sólo grupo E fueron tratados con ambos y V antes de Cristo. Grupo c, d y e se desempeñó como los respectivos V, V BC y AC, más los grupos de control. Filamento de ADN para el análisis de las pausas (Set-II) de las ratas se complementaron en el mismo régimen de dosis de análisis PIXE cuatro semanas antes de la inyección DENA. Todas las ratas fueron asesinados DENA 18-20 h después de la inyección, el hígado son extirpados con prontitud y se aisló el ADN.

Experimental set-up para análisis PIXE

Alrededor de 5 ml de sangre total muestras de diferentes grupos experimental y control fueron recogidos y liofilizados en el Centro Regional de Investigación Médica (RMRC), Bhubaneswar. Luego, las muestras se convierte en polvo fino, homogeneizada y, por último, se pulsa en "pellets". La conversión de la muestra en polvo fino antes de peletización es necesaria para evitar los efectos del tamaño de las partículas en el análisis. Estos efectos son particularmente importantes para los elementos más ligeros. Para obtener coherente "pellets", que se mantienen estables durante los bombardeos, la misma cantidad de aglutinante, como el grafito se añaden a la muestra en polvo antes de pelletisation a fin de que los bombardeos en el vacío no conduce a la tarificación del espécimen [14]. Los objetivos son normalmente finas capas de la muestra depositado uniformemente sobre Mylar películas por lo general de 3 a 6 m μ μ m de espesor. Itrio se añade como patrón interno. Durante cada ejecutar un conjunto de la OIEA (agencia internacional de energía atómica) de animales de sangre A13 norma de referencia, se preparan y analizan junto con otras muestras biomédicas bajo similares condiciones experimentales.

Morfología del hígado

Para el estudio histológico, representante cortar longitudinalmente se tomaron bloques de la izquierda, de derecha y de derecha, la mediana de lóbulos anterior y las muestras fueron fijadas inmediatamente en formalina tamponada al 10% para prevenir la deformación. Cinco secciones contiguas se hicieron desde cada rodaja de hígado histopatológico de rutina para la evaluación de hematoxilina y eosina (H & E) tinción. Hepatocelular específicas de las lesiones observadas en la tinción de H & E fueron reconocidos por microscopía de luz (Adcon, Modelo N º 5591), con arreglo a criterios publicados [15].

DNA Strand romper ensayo

ADN fue aislado del hígado de la rata por una modificación de los criterios publicados [16]. Después de aislamiento de ADN de cada grupo experimental y control, el ADN fue ensayada por el alcance de ADN anulación de la FADU técnica [13]. Los datos se analizaron estadísticamente o de las diferencias entre los medios utilizando la prueba t de Student.

Análisis estadístico

Importancia de la diferencia entre los valores medios de los distintos grupos de ratas se evaluó mediante la prueba t de Student valores de P <0,05 fueron llevados a implicar significación estadística.

Resultados
Efecto de Vanadio y beta-caroteno sobre esencial / Oligoelementos

De espesor objetivo PIXE análisis se realizó con el software GUPIX-95, que establece la no-lineal de los mínimos cuadrados montaje de la gama, junto con la posterior conversión de los rayos X pico de intensidad (no se muestra) en las concentraciones de elemental a través de una normalización técnica que se definen parámetros fundamentales Definida por el usuario y el instrumento constante. Completo de la matriz se han tenido en cuenta los efectos secundarios de fluorescencia y contribuciones tanto en la porción del espectro adecuado y el cálculo de las concentraciones.

La media de las concentraciones de elementos 8-essential/trace se mide por PIXE análisis de las muestras de sangre de los diferentes grupos se muestran en la Tabla 1. Los resultados de este estudio muestran que el contenido de elementos calcio (Ca), cobre (Cu) y zinc (Zn), fueron inferiores en el Grupo B DENA control de los certificados de valores (cuadro I]. Por otro lado, el elemento potasio (K), hierro (Fe), manganeso (Mn), selenio (Se) mostró un aumento en la concentración en el Grupo B (DENA). En cambio, el análisis elemental de muestras de sangre en el grupo C, D y E o el tratamiento con V aC o ambos en combinación exhiben marcada proximidad a valor normal (Tabla 1]. Los datos de los grupos de control de los animales (grupo c, d y e) no mostraron marcadas diferencias con respecto a la normal de control del vehículo (Grupo A) y, por ende, sus homólogos no se incluyeron en el estudio.

Efecto del vanadio y beta-caroteno en Histopatología hepática

Examen histopatológico en las secciones de hígado normal de grupo no tratado, es decir, el Grupo "A" (Figura 2], así como otros grupos de control, es decir, grupos de "c", "d" (Las cifras no se muestra) y «e» (Figura 5], que recibió V aC o solos o en combinación, respectivamente, reveló normal de las células del parénquima hepático con citoplasma granular y núcleos pequeños uniforme radialmente dispuestas alrededor de la vena central. Por el contrario, las alteraciones estructurales graves se observaron en las ratas del grupo B (control DENA) predominantemente con basófilos, eosinófilos y células claras focos (Figura 3]. Amplia vacuolización se observó en el citoplasma que rodea el núcleo con masas de materiales acidófilas. Algunos núcleos de las células son grandes y prominentes con hipercromáticos y situado en una zona céntrica nucleolos (Figura 3]. Fenotípicamente alterado las poblaciones de hepatocitos en forma alterada de las células del hígado y nódulos focos en distinta medida se observa en todo el parénquima hepático de todos los grupos tratados con DENA. La arquitectura celular de lóbulos hepáticos en ratas Grupo E (Figura 4], tanto las recibidas V aC y en la combinación durante 16 semanas parece ser casi comparable a la normalidad. Esto suscitó la máxima protección de ambos y V aC (Grupo E) para todo el período de estudio contra DENA hepatocarcinogenesis inducida, que se refleja en la arquitectura casi normal hepatocelular. Hígado células de este grupo se encontró que contienen material compacto citoplásmica sólo con focos de células claras (Figura 4]. El nucleocytoplasmic ratio se redujo considerablemente en comparación con el Grupo B (DENA). Sin embargo, una moderada mejora en la arquitectura celular hepática se observó en los grupos C (figura no se muestra) y D (Figura no se muestra) y las ratas que recibieron V aC solos respectivamente. Un considerable vacuolización todavía se observan en el citoplasma y la compacidad de los hepatocitos no era normal, como grupo de control sin tratamiento (Grupo A). El hígado secciones de estos grupos presentaron un predominio de células claras focos en lugar de eosinófilos y / o basófilos focos.

Efectos de Vanadio y beta-caroteno en DEN hepático inducido por romper la cadena de ADN

Un aumento significativo en el porcentaje total de ADN hepática solo capítulo romper se observó en el grupo B ratas DENA 20 h tras la inyección (Fig. 6] en comparación con el control normal, es decir, el Grupo A. El porcentaje de nativos de doble ADN de los desamparados El grupo B (control DENA) ratas resultó ser tres veces menor (P <0,001), mientras que el total de aberrante un solo capítulo regiones se encontraron más de diez veces (P <0,001) más elevada que la normal de control del vehículo (Grupo A) [Fig. 6]. Esto es, en realidad, muestra la eficacia directa de ADN perjudiciales de la hepatocarcinogen DENA. El tratamiento con V aC o en combinación, o ambas en el grupo C, DyE, respectivamente ratas estrictamente disminuido la generación de un solo varados ADN DEN 20 h después de la inyección. Resultado muestra que el máximo efecto protector contra la generación de una sola región se encuentran varados en el Grupo E ratas que recibieron ambos y V antes de Cristo. Además, el nativo de doble varados ADN en el grupo E ratas fue casi dos veces mayor que en las ratas control DENA (Grupo B) [Fig. 6]. El cuadro 2 muestra el número de un solo capítulo rompe / ADN DENA 20 h tras la inyección en la presencia de V aC y ya sea solos o en combinación. En el grupo B, una disminución significativa (P <0,01) incremento en el número de un solo capítulo rompe / ADN se puede observar. El tratamiento con V aC o solos mostró decremento en el nivel de 47,23% y 52,87%, respectivamente (P <0,01) en la generación de un solo filamento de ADN más allá de DENA control, pero el máximo efecto protector (64,73%, P <0,005 ) Se encontró en el grupo E que recibieron ambos V aC y en combinación.

Debates

El V aC, más complementado animales grupo E registró un 64,73% de inhibición en el número de capítulo único-se rompe por el ADN (Fig. 6]. Esos saltos de línea se supone en general que letal para las células. Es bien sabido que el filamento de la DNA se rompe responsable de las alteraciones cromosómicas se generan a partir de ADN base de la mayoría de las lesiones inducidas por mutágenos químicos. El decremento sustancial de la única rama se rompe puede explicar uno de los mecanismos posibles de la anticlastogenic y potencial de la V aC. Una hipótesis es que el efecto protector in vivo y de la V aC cuando se dan juntos, como observó aquí, puede ser debido a la reparación por escisión de la actividad. ADN de doble filamento se rompe (DDBs) se generan a partir de las lesiones del ADN inducidas mutágeno en la fase S del ciclo celular y reparado por correo replicación reparación en el G2 fase y que no DDBs resultado en la rotura tipo de aberraciones cromosómicas [17]. En este contexto, la supresión del tipo de aberraciones romper por la acción combinada de V aC y puede ser debido a una modificación de la capacidad de la reproducción posterior a la reparación de DDBs.

Varios informes sugieren que los antioxidantes clastogénico reprimir la acción de los carcinógenos y promotores tumorales [18]. El efecto inhibidor de diferentes antioxidantes como la vitamina E, beta-caroteno y el selenio en la producción de CPE en células de mamíferos cultivadas humano estimulado por los fagocitos, que se produce por un mecanismo de participación de los metabolitos de oxígeno, se ha demostrado con éxito por Weitberg et al., 1985 [ 19]. Esto está en línea con las conclusiones de Sarkar et al [13] que confirman la anticlastogenic efecto de beta-caroteno. Sobre la base de este estudio y los que se informó anteriormente de nuestro laboratorio [20], así como de otros laboratorios [21] se ha confirmado que a baja concentración de V no es clastogénico en animales de experimentación. La información sobre el efecto combinado de un oligoelemento (V) y un antioxidante (BC) en el alivio de la carcinogénesis química en el modelo animal es escaso, especialmente en el nivel molecular. Sin embargo, un estudio reciente de nuestro laboratorio [22] demuestran un papel inhibitorio de tratamiento concomitante con micronutrientes vanadio y VD 3 sobre hepática aberraciones cromosómicas, así como filamento de la DNA romper el hígado de la rata durante la carcinogénesis inducida por DENA. En este estudio hemos demostrado que la aparición de DDBs se reducen considerablemente por explorar el efecto inhibidor de dos agentes antineoplásicos. V aC y por lo tanto, pueden ser eficaces en la protección por el posible mecanismo de prevención de las rupturas en el ADN actuando sobre la diferenciación y antiproliferativa La inducción de genes.

Histología se tomó como punto final biomarcadores. Histológico observaciones muestran claramente que DENA carcinógeno en animales del grupo control claramente daña la arquitectura normal del tejido hepático. Un típico se observó vacuolización en el citoplasma que rodea el núcleo con masas de materiales acidófilas. Algunos núcleos de las células son grandes y prominentes con hipercromáticos y situado en una zona céntrica nucleolos (Figura 3]. Esta condición es conocida como condición preneoplásicas. V aC además de la administración de suplementos parecían disminuir estos cambios (Figura 4] y trajo de vuelta a la normalidad del tejido arquitectura. Leve preneoplásicas condición se observó que demuestre el V aC, más sinérgica ofrece quimioprevención y protege contra los daños carcinógeno.

La distribución de los niveles de elementos trazas en diversos órganos de manifiesto una importante diferenciación entre los tejidos normales y malignos, que se encuentra en buen acuerdo con varios resultados anteriores [23]. Es así que las células malignas difieren bioquímicamente en muchas formas con las células normales. Oberley et al., 1984 [24] informó de que las células cancerosas tienen un modelo diferente de súper óxido dismutasa (SOD), la actividad de la observada en las células normales. Añadieron que las células cancerosas por lo general han disminuido los niveles de Cu y Zn-SOD en comparación con un control apropiado. Dentro de las células SOD (Mn, Cu, Zn), glutatión peroxidasa (Se) y catalasa (Fe) eliminar 0 2 - y de H 2 O 2 antes de que se dispone de enfoque Fenton promotores de la química [25]. H 2 O 2 es el glutatión reducido (GSH) [50]. A pesar de estas enzimas protectoras, algunos 0 2 - y de H 2 O 2 pueden escapar y en la presencia de decompartmentalized Fe, son más de reacción catalizada a especies reactivas de oxígeno (ROS) [25]. Esta condición se ve agravada durante la carcinogénesis como SOD y GSH reducción de la concentración de cancerígenos durante el proceso [26]. En el presente estudio, planteado a nivel de Cu o Zn en muestras de sangre del grupo C, D, y especialmente en el grupo E (que recibió V, y el V aC, más BC, respectivamente) se explica por la capacidad de las células hepáticas para formar SOD-modelo Compuestos in vivo. Estos complejos scavenge súper óxido de los radicales y de la cuenta de la actividad antitumoral de vanadio y beta-caroteno en el hígado de rata neoplasia presumiblemente por la estabilización del genoma.

Diversos estudios han demostrado el aumento de crecimiento tumoral en modelos de roedores con la administración de suplementos de Fe [27, 28]. In vitro e in vivo, los datos sugieren que la Fe puede ser capaz de efectos mutagénicos mediada a través de la generación de radicales libres o tumor promoción nutricional a través de los mecanismos de [29]. Como un metal de transición Fe es vagamente vinculados, dotados de los electrones que son capaces de participar en la peroxidación lipídica (LPO) reacciones. Estas reacciones se cree que conducen a los daños del ADN y, en definitiva, neoplasia [30]. Esto es de conformidad con las observaciones formuladas en el presente estudio. En este sentido, marcada disminución en la concentración de Fe por la administración de suplementos combinados de V aC y DEN-inducida a los animales en el Grupo E (Tabla 1] podría explicarse por el mecanismo sugerido (s). El tratamiento con V aC o solo o en combinación mostró una disminución en el nivel de K, Mn, Se concentraciones cuando se compara con la carcinogénesis grupo de control (grupo B). En la actualidad, es dudoso que pequeños cambios en los niveles de minerales y la inducida por la V aC combinación desempeñado un papel importante en la tumorigénesis en este experimento, pero la posibilidad no puede descartarse.

Conclusión

Estos estudios sugieren que la concentración de elementos trazas in vivo podría ser utilizado como biomarcador para una pronta proceso cancerígeno. Los resultados indican que el vanadio documentado más beta-caroteno en una determinada dosis puede modular otros oligoelementos concentración en el suero de algunos desconocidos mecanismo que aún no se ha dilucidado y con ello preservar la estabilidad genética. El estudio sigue siendo notable en el aspecto de que los registros V aC y ambos mediada por la supresión del ADN-break en el capítulo de la fase de iniciación, además de esencial / traza elemental concentraciones alteración (s) en el hígado y en el mantenimiento de la arquitectura hepática normal Preneoplásicas durante la etapa de la carcinogénesis de hígado.

Contribuciones de los autores

Autor MBC 1 llevó a cabo la rata hepatocarcinogenesis, morfología, la morfometría y estudios histopatológicos. Autor MBC 1 y 3 CI autor hizo romper la cadena de ADN de los estudios. Proton inducida de emisión de rayos X el análisis y la evaluación se hizo por parte de los 2 SM y autor VV 4 y 5 MD autor. Autor 6 NBK, un antiguo especialista médico ha hecho el experto consultor de la patológica aspectos de la labor. La planificación, el diseño y la coordinación del trabajo experimental se realizó por parte de los 7 MC, el investigador principal.

Agradecimientos

M. B Chattopadhyay está en deuda con el Consejo Indio de Investigación Médica, Gob. De la India (Grant N º 45/2/2001/BMS/TRM) por el apoyo financiero para llevar a cabo este trabajo .. También damos las gracias al Dr PK Sen, Senior Reader, Departamento de Matemáticas, Universidad Jadavpur, Calcuta, la India, por su excelente orientación en la interpretación estadística de los datos. Los autores agradecen al Dr Amitabha Chatterjee, Calcuta Universidad de la Facultad de Medicina de Calcuta por su ayuda en la interpretación de estudio histopatológico. Los autores gracias doctor y el doctor Ranjan Basak Barun Kanti Saha de la Universidad Jadavpur de asesoramiento técnico y de apoyo.