Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 4-4 (más artículos en esta revista)

CXCR2 es fundamental para dsRNA lesión pulmonar inducida: la pertinencia a la infección viral de pulmón

BioMed Central
Vedang A Londhe (vlondhe@mednet.ucla.edu) [1], John Un Belperio (jbelperio@mednet.ucla.edu) [2], Michael P Keane (mkeane@mednet.ucla.edu) [2], Marie D Burdick (mburdick@mednet.ucla.edu) [2], Ying Ying Xue (yyxue@mednet.ucla.edu) [2], Robert M Strieter (rstrieter@mednet.ucla.edu) [1]
[1] Departamento de Pediatría, Escuela David Geffen de Medicina en UCLA, Los Angeles, CA, EE.UU.
[2] de la División de Medicina Pulmonar y Cuidados Críticos, la Escuela David Geffen de Medicina en UCLA, Los Angeles, CA, EE.UU.
[3] Departamento de Patología y Laboratorio de Medicina de la Escuela David Geffen de Medicina en UCLA, Los Angeles, CA, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Infecciones respiratorias virales se caracterizan por la infiltración de leucocitos, incluyendo los neutrófilos activados en el pulmón que puede conducir a sostener la lesión pulmonar y potencialmente contribuir a la enfermedad pulmonar crónica. Mecanismos específicos para la contratación de los neutrófilos en el pulmón inducida por el virus de la inflamación pulmonar y lesiones no han sido completamente aclarada. Desde CXCL1 y CXCL2 / 3, a través de CXCR2, son potentes chemoattractants neutrófilos, que investigó dsRNA su papel en la lesión pulmonar inducida, en donde dsRNA (Poly IC) es un bien descrito agente sintético imitación de la infección viral aguda.

Métodos

Utilizamos 6-8 semanas de edad las mujeres ratones BALB / c intratracheally a inyectar ya sea solo varados (ssRNA) o doble-stranded RNA (dsRNA) en las vías respiratorias. Los pulmones fueron cosechadas en timepoints designado para caracterizar la respuesta suscitó quimioquinas y la consiguiente lesión pulmonar después de la exposición dsRNA qualititatively como se ha demostrado por análisis histopatológico, y cuantitativamente por FACS, de proteínas, ARNm y análisis de líquido de BAL y muestras de tejidos. Entonces repitió los experimentos por primera pretreating ratones con un anti-PMN o control correspondiente anticuerpo, y luego posteriormente pretreating una cohorte de ratones con un anti-CXCR2 o control correspondiente anticuerpo dsRNA antes de la exposición.

Resultados

Intratraqueal dsRNA conducido a un aumento significativo de infiltración de neutrófilos y de la lesión pulmonar en ratones BALB / c a las 72 h siguientes dsRNA, pero no en respuesta a ssRNA (Poly C, el control) de tratamiento. Expresión de ligandos CXCR2 y CXCR2 paralelo reclutamiento de neutrófilos al pulmón. Neutrófilos agotamiento estudios redujo significativamente la infiltración de neutrófilos y de la lesión pulmonar en respuesta a dsRNA cuando los ratones fueron tratados previamente con un anti-PMN monoclonal Ab. Además, la inhibición de la interacción CXCR2 ligands/CXCR2 por pretreating dsRNA-ratones expuestos con un anti-CXCR2 neutralizar Ab también significativamente atenuada secuestro de los neutrófilos y la lesión pulmonar.

Conclusión

Estos hallazgos demuestran que el CEC eje de quimioquinas ligand/CXCR2 biológica es fundamental en la patogénesis de dsRNA inducida por la lesión pulmonar aguda pertinentes a las infecciones virales.

Antecedentes

Infecciones virales de las vías respiratorias son una de las causas del resfriado común y la gripe en niños y adultos. Estas infecciones pueden predisponer a los pacientes a desarrollar ciertas afecciones respiratorias crónicas como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, y la displasia broncopulmonar (DBP) [1]. Entre los síntomas clínicos y una alteración de la secreción de moco y la reactividad de la vía aérea son hallmarked por el reclutamiento de células inflamatorias con los consiguientes cambios en el revestimiento de las vías aéreas de células epiteliales. La inflamación puede extenderse más en el parénquima pulmonar a causa de enfermedades que es característico de la neumonía viral, como se ha observado recientemente en el síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) [2]. El reclutamiento de células inflamatorias, en gran parte, se suscitó en la generación de las quimioquinas (citoquinas quimiotaxis), que también son importantes en la creación de un entorno pro-inflamatorias crónicas que subyacen trastornos respiratorios como el asma, EPOC, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, y DBP [1, 3 -- 10].

Cambios inflamatorios debido a la infección viral resultado de la respuesta inmune del huésped en lugar de secundaria a la replicación viral o de las partículas virales propios [11 - 15]. Las infecciones víricas de las células epiteliales se caracterizan por la generación de la molécula pro-inflamatoria doble-stranded RNA (dsRNA) durante intracelular de la replicación de los virus. Cuando estudió en líneas de células epiteliales humanas in vitro, dsRNA se desencadene una respuesta inmune innata en la célula huésped a través de la generación de citocinas y quimiocinas implicadas en el reclutamiento de células inflamatorias. En concreto, dsRNA se ha demostrado que induce la activación de los neutrófilos chemoattractant, interleuquina-8 (IL-8/CXCL8), y reguladas en la activación, células T normales expresadas y secretadas (RANTES) [16]. En sujetos humanos in vivo, los niveles elevados de IL-8/CXCL8 traqueal y acumulación de neutrófilos se encuentran en las vías respiratorias de los pacientes con asma, EPOC, y la infección viral. Aunque los modelos animales in vivo se han estudiado los efectos sistémicos de la intraperitoneal dsRNA tratamiento [17], existe una escasez de información sobre la caracterización y el papel de las quimiocinas en la inflamación y lesión pulmonar después de la instilación intratraqueal dsRNA.

Murino KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3 son el ácido glutámico-Leucine-Arginina-positivos (ELR-positivas) CEC quimiocinas; son estructurales homólogos humanos de GRO-α / CXCL1 y GRO-β / γ / CXCL2 / 3, Respectivamente, y son funcionales homólogos de la CEC quimiocinas, como IL-8/CXCL8, ENA-78/CXCL5, y GRO-α y β / γ / CXCL1/2/3 [18 - 21]. Ambos murino quimiocinas compartir la capacidad de la señal a través de una proteína G-receptor acoplado, CXCR2 [18 - 20]. Su humanos homólogos estructurales y funcionales se han asociado con el asma, EPOC, infecciones virales y de pulmón [22, 23].

En el estudio actual, la hipótesis de que los principios de la inflamación y lesión pulmonar resultante de intratraqueal dsRNA tratamiento se debe, en parte, a la expresión de ELR-positivas CEC quimiocinas a través de su interacción con su principal receptor, CXCR2. Para probar esta hipótesis, se inyecta dsRNA intratracheally en 6-8 semanas de edad las mujeres ratones BALB / c para medir el recuento de neutrófilos y de las respuestas de quimioquinas y la consiguiente lesión de las vías respiratorias y el tejido pulmonar compartimentos. Luego bloquearon esta respuesta por pretreating animales con anticuerpos específicamente a neutralizar el reclutamiento de neutrófilos en una forma dependiente de quimioquinas-y, por ende, disminuido la inflamación y lesión pulmonar. Nuestro modelo animal demuestra el papel decisivo de CXCR2 ligands/CXCR2 aguda en la inflamación y lesión pulmonar debido a intratraqueal dsRNA.

Métodos
Reactivos

ARN instilación: Double-stranded RNA (dsRNA, Poly IC) y solo varados ARN (ssRNA, Poly C) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich Corp (St. Louis, Mo) y reconstituida en solución salina normal estéril (20 μ g / Μ l) y almacenados a 4 ° C antes de su uso.

DsRNA modelo murino de la lesión pulmonar inducida

Utilizamos 6-8 semanas de edad las mujeres ratones BALB / c intratracheally a inyectar ya sea solo varados (ssRNA) o doble-stranded RNA (dsRNA) a través de una modificación de un método descrito previamente [30, 33 - 36]. Los ratones fueron anestesiados con ketamina (60 mg / kg) intraperitoneal; entonces, en condiciones estériles, la parte anterior del cuello de tejidos blandos fue disecada para exponer la tráquea y 50 μ l de ARN (20 μ g / μ l, 40 μ g / g ratón peso) fue inyectado a través de Del calibre 26 tuberculina aguja y la jeringa con un paso a paso microinjector ® (Indicon, Inc, Brookfield, CT) en la tráquea bajo visualización directa. Inmediatamente después de la instilación, la piel se apposed y cerrado utilizando adhesivo tisular y los ratones se les permitió recuperarse de la anestesia antes de la sustitución en sus jaulas.

En distintos experimentos, los animales recibieron 1 ml de cabra policlonal anti-murino CXCR2, 1 ml de suero normal de cabra (NGS), el control de anticuerpos, o 0,5 ml de rata anti-ratón Ly-6G mAb correspondiente control por vía intraperitoneal o 24 horas antes de la inyección y intratraqueal Todos los días hasta el sacrificio de tiempo que se describió anteriormente [37].

Pulmón lavado broncoalveolar y preparación de tejidos

En el momento de sacrificio, 72 h siguientes intratraqueal dsRNA o ssRNA tratamiento, los ratones fueron sacrificados mediante Pentobarbital intraperitoneal (100 mg / kg) y un heparinized muestra de sangre fue extraída. La cavidad torácica se exponen a continuación y los pulmones fueron perfundidos libre de la sangre con 1 ml de solución salina normal 0,9% a través del ventrículo derecho espontáneamente golpes bajo constante presión de 25 cm H 2 0. Una mariposa aguja del calibre 26 fue utilizado para cannulate la tráquea y el lavado broncoalveolar (BAL) es la realizada por inculcar 1 ml de PBS + 5 mM EDTA solución a lo descrito previamente [38]. Lavaged pulmones estaban bajo constante presión de 25 cm H 2 0 y recuperado soluciones fueron centrifugadas a 900 × g durante 15 min. La celda libre de sobrenadantes se analizaron en virtud de las pruebas ELISA y se analizaron las células recogidas en el total de células y de los diferenciales de cytospin. Tejido pulmonar fue procesado por las siguientes: cálculo de edema pulmonar; permeabilidad microvascular; mRNA; ELISA análisis, y el análisis histológico e inmunohistoquímico de fijación en paraformaldehido 4% en 25 a 30 cm de H2O de presión e incluidas en parafina.

Immunolocalization de TLR3

Parafina-embebido de dsRNA tejidos tratados y tratados con ssRNA pulmones se procesaron para inmunohistoquímica localización de los receptores Toll-like 3 (TLR3) expresión que utiliza un método descrito previamente [33, 39]. En resumen, las secciones de tejidos fueron dewaxed con xileno y rehidratada clasificado a través de las concentraciones de etanol. Sitios de unión inespecífica de tejido fueron bloqueados utilizando ® Power Block (BioGenex, San Ramon, CA). Muestras de tejido fueron superpuestos a las 1:50 de la dilución, ya sea de control (de cabra) o de cabra policlonal de anticuerpos anti-TLR3 (Biotecnología Inc Santa Cruz, Santa Cruz, CA). Las secciones de tejidos fueron lavados con solución salina amortiguadora TRIS-y luego se incubaron durante 60 minutos con el anticuerpo secundario con biotina. Las secciones de tejidos fueron lavados en buffer TRIS-salina y se incubaron con fosfatasa alcalina conjugado con streptavidina (BioGenex). Muestras de tejido fueron incubadas con reactivo Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA), seguido por el sustrato de peroxidasa, DAB reactivo (Vector Laboratories). Después de color óptimo desarrollo, secciones de tejidos fueron sumergidos en agua estéril, counterstained con Lerners hematoxyin, y cubrir escapado utilizando una solución acuosa de montaje.

ARN total aislamiento y la PCR cuantitativa en tiempo real

Total RNA celular de los tejidos de los pulmones se aisló como se describe anteriores [30, 31]. Total de ARN se determinó y 1 ug de RNA total se invirtió transcritas en cDNA y amplificado utilizando TaqMan Cuantificación ensayos de la Expresión Génica (Applied Biosystems (Foster City, CA) Kit 4.304.134). CDNA se amplificó y cuantificarán mediante la TaqMan 7700 Secuencia sistema de detección y primers específicos para murino CXCL1, CXCL2 murino / 3, murino CXCR2 y una limpieza gene18S. Los cebos utilizados fueron 5'-TGA-GCT-GCG-CTG-ACT-GTG-AAC-3 '(sentido) y 5'-AGA-AGC-CAG-CGT-TCA-CCA-GA-3' (antisentido) para CXCL1 (259 pb) y 5'-GCT-GGC-CAC-CAA-CCA-CCA-GG-3 '(sentido) y 5'-AGC-GAG-ACG-CAT-CAG-GTA-CG-3' (antisentido ) Para murino CXCL2 / 3 (359 pb). Predeveloped ensayo reactivos (Applied Biosystems Kit 4.304.134) fueron utilizados para murino CXCR2 y la limpieza de genes, 18S. Análisis cuantitativo de la expresión genética se realizó utilizando el comparativo T CΔ C C T) métodos, en el que C T es el umbral ciclo de número (el número mínimo de ciclos necesarios antes de que el producto se puede detectar) [40, 41]. La fórmula para el cálculo Δ Δ C C T método es la diferencia en el umbral de los ciclos de un objetivo, (es decir, CXCR2) y una endógena de referencia (es decir, limpieza gen 18S). El importe de la meta normalizaron a una endógeno de referencia (es decir, CXCR2 dsRNA-en los animales tratados) y relativos a una calibración normalizado a una endógeno de referencia (es decir, CXCR2 en ssRNA tratados con los controles) está dado por 2 - ΔΔ CT [40, 41] . El siguiente es un ejemplo para comparar CXCR2 expresión de dsRNA-ssRNA los animales tratados y tratados con los controles. Ambos CXCR2 de dsRNA-ssRNA tratados y tratados con los controles se normalizó a 18S: ΔΔ ΔΔ C C T = C Δ Δ T C (CXCR2 dsRNA-expresión de los animales tratados a normalizarse endógeno 18S) - Δ Δ C C T (CXCR2 expresión de ssRNA tratados normalizado para los controles Endógena 18S). El cálculo de 2 - ΔΔ CT luego da un valor relativo al comparar el blanco con el calibrador, que designará, en este contexto, como ha multiplicado de dsRNA tratos a los animales ssRNA tratados con controles de la meta relativa mRNA cuantificación.

Evans azul de la permeabilidad microvascular y húmedo: seco análisis de edema pulmonar

La permeabilidad microvascular en relación con la lesión pulmonar se midió usando una modificación del colorante azul de Evans extravasación técnica, como ha sido descrito previamente [30, 42]. Extravasación de azul de Evans (Sigma-Aldrich) en el compartimiento extravascular se utilizó como una medida cuantitativa de la lesión pulmonar y los cambios en la permeabilidad de la microvasculatura. En pocas palabras, cada animal recibió 20 mg / kg de azul de Evans (pH 7,34) por la inyección de cola vena 3 h antes del sacrificio. En el momento del sacrificio, una heparinized muestra de sangre fue recolectada, y el plasma fue removido por centrifugación. Seis de cada grupo pulmones fueron perfundidos libre de la sangre con 1 ml de solución salina normal 0,9% a través de la paliza espontáneamente ventrículo derecho y retirado de la cavidad torácica. La tráquea, bronquios principal, y en torno a las estructuras mediastínicas se eliminaron. Evans azul se extrae de los tejidos pulmonares después de la homogeneización en 1 ml de solución salina normal 0,9%. Este volumen ha sido añadido a 2 vol de formamida desionizada y se incuba a 60C durante 12 h. El sobrenadante fue separado por centrifugación a 2000 × G por 30 min. Evans azul en el plasma y tejido pulmonar se cuantificación de doble análisis espectrofotométrico de longitud de onda en 620 y 740 nm [43]. Este método corrige la muestra de la absorbancia a 620 nm de la absorbancia de la contaminación de heme pigmentos, utilizando la siguiente fórmula: corregida a 620 nm = real de absorbancia a 620 nm - (1,426 (absorbancia a 740) + 0.03). Se calculó un índice de permeabilidad dividiendo el correcto pulmonar plasma Evans azul absorbancia a 620 nm; este índice refleja el grado de extravasación de azul de Evans en el tejido pulmonar extravascular compartimento.

Para cuantificar el edema pulmonar después de dsRNA tratamiento, el peso seco a húmedo ratios fueron obtenidos por ligar los pulmones lejos del hilo como ha sido descrito previamente [40]. Los pulmones se borró seco y pesado. Posteriormente fueron desecados por incubación a 130 ° C durante la noche en una estufa de vacío y volver a pesarse para determinar su peso seco. El ratio de seco a húmedo continuación se calculó.

KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3 pruebas ELISA

KC/CXCL1 o MIP-2/CXCL2/3 proteína se cuantificaron utilizando una modificación de un ligando doble método que se describió anteriormente [30, 31, 40, 41]. Brevemente De fondo plano y 96 placas microtiter (Nunc Immuno Plate I-96-M) fueron recubiertas con 50 μ l / y de la captura de anticuerpos murinos a KC/CXCL1 o MIP-2/CXCL2/3 (2 ug / ml en fosfato estéril Salina tamponada (PBS), de 12 horas a temperatura ambiente y luego se lava con buffer fosfato salino (PBS), pH 7,5, 0,05% de Tween-20 (buffer de lavado). Microtiter placa de sitios de unión inespecíficos fueron bloqueadas con 2% de BSA en PBS y Incubaron durante 60 minutos a 37 ° C. Las placas fueron lavadas tres veces con buffer de lavado y muestras o estándar se añadieron, seguido de una incubación de 1 hora a 37 ° C. Las placas fueron lavadas tres veces y 50 μ l / y de la detección de anticuerpos murinos KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3 anticuerpos añadido, y las placas se incubaron durante 45 minutos a 37 ° C. Las placas fueron lavadas tres veces, streptavidina-peroxidasa conjugada (Jackson Laboratories, West Grove, PA) añadido, y las placas Incubaron durante 30 minutos a 37 ° C. Las placas fueron lavadas tres veces y TMB (3,3, 5, 5'-tetramethylbenzidine) cromógeno sustrato (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) añadió. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente A la deseada extinción, y la reacción terminado con 3 MH 2 SO 4 solución. Placas se leyeron a 450 nm en un lector de microplacas automatizado (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT). Normas se 1/2-log diluciones KC/CXCL1 o de cualquiera de MIP-2/CXCL2/3 de 100 ng a 1 pg / ml (50 ul / así). Este método de ELISA específico de quimioquinas constantemente detectado concentraciones en forma lineal superior a 50 pg / ml. KC/CXCL1 MIP-2/CXCL2/3 y se concreta en nuestra sandwich ELISA sin reactividad cruzada a un grupo de citoquinas incluyendo murino C10, JE, MIP-1 α, β MIP-1, GRO humanos α, GRO β, γ GRO, RANTES, y los miembros de la CEC y CC de quimioquinas familias.

FACS análisis de pulmón de los neutrófilos

Todo el único pulmón de células en suspensión se hicieron desde cosechado pulmones de cuatro ratones por grupo usando un método, como ha sido descrito previamente [40]. Única de células en suspensión (5 × 10 6 células / ml) fueron teñidas con Abs: Tricolor no conjugada (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) anti-CD45 murino (Caltag Laboratories, South San Francisco, CA), conjugados con FITC anti-murino MOMA-2 (macrófagos superficie marcador; Seratec, Raleigh, NC), R-Phycoerythrin (R-PE) Rat conjugadas anti-murino Ly-6G (neutrófilos marcador de superficie) y la R-PE-ratón conjugadas anti-murino CD3e (linfocitos superficie Marcador) (BD Biosciences). Dual-color-suspensiones de células teñidas se analizaron en un cytometer flujo FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), utilizando el software CellQuest 3.2.1f1 (BD Immunocytometry Systems).

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante Microsoft ® Excel 2000 paquete estadístico (Microsoft Corporation, EE.UU.). Dos comparaciones de grupos fueron evaluados mediante la prueba t unpaired Estudiantes. Tres comparaciones de grupos se evaluaron mediante la prueba de ANOVA con el análisis post hoc (es decir, de Bonferroni / Dunn). Los datos se expresaron como media ± SEM.

Resultados
DsRNA induce la expresión de TLR3 sobre las células epiteliales de la vía aérea

Dado que los estudios in vitro en células epiteliales humanas han demostrado que dsRNA induce a la generación de quimiocinas implicadas en el reclutamiento de leucocitos, se realizó los estudios in vivo, usando un modelo murino sistema de intratraqueal dsRNA inducida por la inflamación y daño a imitar a una aguda infección viral y, por tanto, la diseccionar Mecanismos relacionados con este proceso. El receptor putativo de dsRNA se ha identificado como los receptores Toll-like 3 (TLR3), con lo que determinó primero si dsRNA tratamiento se asoció con una expresión de TLR3. Immunolocalization uso de cabra anti-murino TLR3 Ab mostró notablemente incremento en la expresión de TLR3, localizadas en la superficie del epitelio de la vía aérea dsRNA tratados pulmones en comparación con los controles ssRNA tratada a las 72 h. Especificidad a TLR3 quedó demostrado por la falta de control sobre la tinción de IgG de cabra teñidas de ambas secciones y dsRNA ssRNA-grupos tratados (Fig. 1].

DsRNA induce infiltración pulmonar de neutrófilos

Los ratones tratados con intratraqueal dsRNA se observó a tener importantes intraparenchymal las vías respiratorias y la infiltración de leucocitos a las 72 h después del tratamiento en comparación con el ingenuo y ssRNA tratados con los controles, como lo demuestra histopatología (Figura 2A]. No se observaron diferencias significativas en los infiltrados celulares se observaron entre los grupos histopatológico en anteriores timepoints 4, 12, 24, y 48 h después de dsRNA tratamiento (datos no presentados). BAL FACS y análisis a las 72 h siguientes dsRNA específicamente mostró que el tratamiento se asociaron con una dsRNA reclutamiento de neutrófilos en comparación con los controles (Figura 2B y 2C].

DsRNA induce el aumento de la lesión pulmonar

Para determinar si la afluencia de neutrófilos en las vías aéreas y el parénquima pulmonar resulta en la lesión pulmonar, que mide dos marcadores de lesión pulmonar para cuantificar los cambios en el edema pulmonar y la permeabilidad vascular pulmonar. Los resultados mostraron un aumento significativo en el húmedo: seco en relación dsRNA tratados pulmones en comparación con los controles a las 72 h siguientes dsRNA tratamiento (Fig. 3A]. Del mismo modo, la medición de pulmón: extravasación de plasma ratio de Evans colorante azul también mostró un aumento significativo de la permeabilidad microvascular en dsRNA tratados pulmones en comparación con los controles (Fig. 3B].

Agotamiento de neutrófilos disminuye dsRNA inducida por la inflamación y lesión pulmonar

Con la conclusión de que un aumento de los neutrófilos pulmón coincidió con un aumento de las lesiones pulmonares en dsRNA tratados pulmones, el próximo tratado de determinar si se trataba de una relación causal por la inducción de la neutropenia y la medición de cambios en el pulmón de los neutrófilos y la afluencia lesión pulmonar. Los ratones fueron inmunizados pasivamente con anticuerpos específicos anti-ratón Ly-6G mAb o de control correspondientes a -24 h, así como 0, 24, y 48 h después de dsRNA tratamiento. Pulmones se cosecharon a las 72 h, y los resultados mostraron que los animales tratados previamente con el agotamiento de los neutrófilos mAb había una disminución significativa en el total de neutrófilos en las vías respiratorias y el tejido pulmonar, en comparación con los controles como se refleja en el análisis y la FACS BAL (Fig. 4A y 4B]. Es importante señalar que BAL muestras de los animales tratados previamente con anti-ratón Ly-6G mAb de anticuerpos mostraron una reducción en el número de neutrófilos, pero no en la reducción de los números de los monocitos (datos no presentados). Además, los neutrófilos agotamiento generado una disminución en la permeabilidad microvascular pulmonar volver a los valores basales (Fig. 4C].

DsRNA induce elevados KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3 mRNA y los niveles de proteína

Desde afluencia de neutrófilos fue mostrado a resultar en lesión pulmonar en dsRNA tratados pulmones, que el próximo identificado factores específicos, como las quimiocinas, fueron los responsables de reclutamiento de neutrófilos. Nos centramos en el ELR + quimiocinas KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3, que se sabe que tienen propiedades de neutrófilos chemoattractant. DsRNA tratamiento dado lugar a aumentos significativos en los niveles de mRNA KC/CXCL1 de pulmón, así como en los niveles de proteína de todo el pulmón y homogeneizado BAL en comparación con los controles (Fig. 5A, C, y 5E] a las 72 h siguientes dsRNA tratamiento. Del mismo modo, los niveles de ARNm y la expresión de la proteína de pulmón MIP-2/CXCL2/3 también fueron significativamente elevados, con una tendencia creciente se observa en BAL proteína de la dsRNA tratados pulmones en comparación con los controles (Fig. 5B, D, y 5F]. Los niveles de quimioquinas CXCR2 ligandos en anteriores timepoints sólo mostraron un pequeño aumento (dos veces) en la inducción de KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3 lo antes dsRNA 4 h siguientes a la exposición (datos no presentados), pero el Máximo de aumento (> diez veces para KC/CXCL1 y> cuatro veces para MIP-2/CXCL2/3) se produjo a las 72 h siguientes a la exposición dsRNA.

DsRNA aumentos CXCR2 expresión en los pulmones

CXCR2 compartida es el receptor celular para la CEC murino de quimioquinas ligandos KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3 [18 - 20]. El hallazgo de un aumento de los niveles de KC/CXCL1 y MIP-2/CXCL2/3 asociados con dsRNA inducida por el secuestro de los neutrófilos y la lesión pulmonar nos llevó a evaluar la expresión de mRNA CXCR2 en los pulmones de estos animales. Homogeneizado de pulmón de los animales tratados dsRNA-ha aumentado significativamente CXCR2 expresión mRNA, en comparación con los controles (Fig. 6]. La expresión de mRNA CXCR2 paralelo ligando su expresión, el secuestro de los neutrófilos, y la lesión pulmonar a las 72 h siguientes dsRNA tratamiento (Figs. 2, 3 y 5].

La inhibición de la CXCR2 inhibe la infiltración de neutrófilos y atenúa dsRNA lesión pulmonar inducida

Para comprender mejor el mecanismo responsable, en parte, para dsRNA pulmonar inducida por neutrofilia y lesiones, a fin de determinar si la inhibición de la interacción ligando CXCR2 con CXCR2 reclutamiento de neutrófilos disminuyó significativamente durante el dsRNA patogénesis de la lesión pulmonar inducida. Los ratones fueron inmunizados con pasivamente específicos neutralizantes anti-murinos o CXCR2 con el control de anticuerpos en -24 h, así como 0, 24, y 48 h después de dsRNA tratamiento. Pulmones se cosecharon a las 72 h, y los resultados mostraron que BAL neutrófilos de los animales que recibieron anti-Ab CXCR2 se redujo significativamente en comparación con el control de los animales que recibieron suero normal de cabra (Fig. 7A]. Además, la medición de pulmón, edema pulmonar y la permeabilidad microvascular también mostraron descensos significativos en mojado: seco y azul de Evans extravasación en ratones tratados con anti-CXCR2 NGS-en comparación con los controles tratados (Fig. 7B y 7C]. Por último, la comparación de pulmón histopatológico de los campos de lucha contra la CXCR2 pretratados ratones mostraron marcada reducción en leukocytic infiltrarse en comparación con los controles NGS-pretratadas (Fig. 7D].

Discusión

Infecciones respiratorias virales se caracterizan por un período de dos componente de la respuesta inmune innata compuesta de un componente que está en pleno funcionamiento antes de la entrada viral en el epitelio y un componente de adaptación que se desarrolla en respuesta a la continuación de la presencia del virus [1]. La innata o componente inflamatorio agudo se asocia con un predominio de la infiltración de neutrófilos. Si bien muchas de las infecciones virales de pulmón son autolimitados, la lesión pulmonar asociada debido a este primer caso puede resultar fundamental en la creación de un entorno pro-inflamatorias crónicas subyacentes ciertos trastornos respiratorios como el asma, EPOC, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, neumonía viral , Y displasia broncopulmonar [1, 3 - 10]. La respuesta inflamatoria del huésped a la replicación viral conduce a la patología pulmonar hallmarked leucocitos por infiltrarse y microvasculares resultante de fugas, que progresa a edema pulmonar y de los signos clínicos de neumonía. Como la lesión pulmonar persiste o se repite con múltiples posteriores infecciones virales, vascular pulmonar y la remodelación de las vías respiratorias puede ocurrir y conducir al desarrollo de la hiper-reactividad de la vía aérea y / o fibrosis intersticial [44]. Infecciones virales son mediados por dsRNA, una molécula proinflamatoria generados durante la replicación viral. DsRNA se une a su receptor de superficie celular, TLR3, y activa la producción de los productos genéticos, como la CEC quimiocinas. En este estudio, la hipótesis de que la interacción entre CXCR2 y ELR-positivas CEC quimiocinas dsRNA expresadas durante la inflamación pulmonar inducida es fundamental en la mediación de reclutamiento de neutrófilos, un proceso fundamental para la lesión pulmonar inducida por dsRNA en infecciones virales.

Estudios anteriores han demostrado que los ratones expuestos a un virus vivo a través de la inoculación intranasal generar un sistema de respuesta de fase aguda con máxima de quimioquinas respuesta pulmonar a la semana que incluye tanto a CC y CEC quimiocinas y es dependiente de la cepa de ratón (en respuesta BALB / c mayor que En C57BL / 6 ratones) [45, 46]. Un estudio similar utilizando intratraqueal entrega de virus vivo también demostró marcada patología pulmonar incluyendo la mucosa y metaplasia de células epiteliales remodelación de la vía aérea [47]. Otro estudio se centra específicamente en los efectos de intratraqueal dsRNA en una dosis baja encontrado efectos similares inflamatoria sistémica pulmonar efectos específicos, pero sólo cuando dsRNA se entregó junto con IFN γ [48]. Por último, un reciente estudio examinó los efectos de la inhibición de los receptores de quimioquinas CC, CCR1, durante la exposición en vivo-virus en ratones y demostró que la mortalidad durante la infección por pneumovirus se redujo [49]. En el presente estudio se extiende estos resultados por determinar, en primer término los efectos de altas dosis de intratraqueal dsRNA solos en el reclutamiento de neutrófilos y de la lesión pulmonar en ratones BALB / c y luego posteriormente el bloqueo de estos efectos a través de la inhibición de la CEC de receptores de quimioquinas, CXCR2.

Determinar los efectos de dsRNA in vivo, primero caracterizado nuestro modelo murino por la realización de un curso de duración de dsRNA para observar cambios histopatológicos en el 0, 4, 12, 24, 48 y 72 h siguientes intratraqueal dsRNA entrega. Se utilizó una dosis máxima de dsRNA a 40 μ g / g de peso del ratón después de los estudios iniciales en dosis más bajas (4 μ g / g y 20 μ g / g) presentaron mínimo leukocytic infiltrarse. Por otra parte, somos conscientes de un solo otra publicación que describe intratraqueal dsRNA entrega que no mostró efectos cuando se utiliza solo en baja concentración (10 ug / g) [48]. El análisis histopatológico demostró un aumento significativo leukocytic infiltrar a las 72 h siguientes intratraqueal dsRNA en comparación con los puntos de tiempo anteriores. Por lo tanto, eligió esta observación como base para centrarse en las 72 h timepoint. Otros estudios utilizando administración de dsRNA en ratones BALB / c in vivo también han mostrado una máxima respuesta inmune innata a partir de las 72 h siguientes dsRNA exposición [50] Más caracterización a las 72 h siguientes intratraqueal dsRNA mostró que los neutrófilos son un tipo celular predominante y que Es una lesión asociada a la membrana alvéolo-capilar integridad como lo demuestra el aumento de edema pulmonar y microvasculares de fugas.

Después de haber caracterizado la histopatológico daños causados por intratraqueal dsRNA, y por la tarde se centró en los mecanismos subyacentes responsables de la promoción de la inflamación y la posterior lesión pulmonar. Nuestros hallazgos de un aumento significativo de infiltración de neutrófilos siguientes dsRNA tratamiento son consistentes con los hallazgos de estudios anteriores utilizando un virus vivo que también dio lugar a comienzos de la infiltración de neutrófilos [47]. Con el fin de determinar si la afluencia de neutrófilos fue causalmente ligados a la lesión pulmonar observado en nuestro sistema, hemos realizado estudios utilizando un anticuerpo monoclonal para el Ly6G antígeno en la superficie de ratón específicamente a los granulocitos neutrófilos agotan. Estos resultados mostraron disminución de los números de pulmón de los neutrófilos por FACS BAL análisis y como se esperaba, sin reducción de los monocitos número, y también mostró una disminución de las fugas microvascular pulmonar y, por tanto, disminuyó la lesión pulmonar asociada con la disminución en el reclutamiento de neutrófilos. Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares implicados en la contratación de estos neutrófilos que queda por aclarada completamente.

Elegante los estudios in vitro han demostrado que pueden inducir dsRNA IL-8 expresión de las células epiteliales bronquiales humanos [16]. Además, los estudios in vivo, utilizando virus vivos también han demostrado que las quimiocinas CEC se generan durante la inflamación pulmonar [45 - 47]. Después de haber demostrado que la lesión pulmonar debido a intratraqueal dsRNA depende de la infiltración de neutrófilos, hemos determinado que CXCL1 y CXCL2 / 3 de expresión fue significativamente mayor en los pulmones de los ratones tratados con dsRNA que en los pulmones de ssRNA tratados con los controles. Además, la expresión de mRNA CXCR2 fue similar en paralelo con el aumento de la producción de ambos CXCL1 y CXCL2 / 3 ligandos y el secuestro de los neutrófilos durante dsRNA pulmonar inducida por inflamación. Otros estudios de las enfermedades inflamatorias, como la ventilación inducida por la lesión pulmonar, neumonía, y hyperoxia lesión pulmonar inducida han demostrado la importancia de CXCR2 expresión y su papel en el reclutamiento de neutrófilos en la patogenia de estas enfermedades [24, 40, 41, 51] . Colectivamente, estos estudios demuestran que los niveles aumentados de CXCR2 ligandos son importantes en el reclutamiento de neutrófilos en la patogenia de las enfermedades inflamatorias y sugieren que la interacción entre ligandos CXCR2 y CXCR2 puede ser fundamental en el reclutamiento de neutrófilos al pulmón durante dsRNA pulmonar inducida Lesión.

Sobre la base de estos hallazgos, se realizó una prueba de principio de los estudios in vivo utilizando un anticuerpo mediada neutralización estrategia para evaluar la función directa para CXCL1 y CXCL2 / 3 ligandos y su interacción con CXCR2 durante dsRNA la patogénesis de la lesión pulmonar inducida. La lucha contra la CXCR2 Ab-ratones tratados demostrado importantes reducciones específicas toneutrophil infiltración que fueron acompañados de una disminución de la lesión pulmonar. Esto sugiere que si otros leucocitos son reclutados hay redundante los involucrados en el reclutamiento que se CXCR2-independiente. Nuestros resultados son similares a estudios previos de neutralización en ratones infectados por el virus que demostró funcional antagonismo a los receptores de las quimioquinas CCR1 reducción de la mortalidad [49]. Nuestro estudio es el primero que demuestra que la neutralización de CXCR2 resultados en el reclutamiento de neutrófilos y disminución de la lesión pulmonar inducida por la intratraqueal dsRNA.

TLR3 es un patrón de reconocimiento de los receptores de la superficie celular que se encarga de reconocer específicamente dsRNA extracelular [52]. Es miembro de una familia de peaje-como los receptores (TLRs), que la ayuda en la lucha contra las infecciones de acogida cuando los agentes patógenos microbianos se unen a sus receptores peaje-como para activar NF κ B, y aguas abajo de la generación de citoquinas y moléculas estimuladoras durante el ataque inmune innato. TLR3 por lo tanto, desempeña un papel importante en la acogida de defensa contra infecciones de virus. Nuestro estudio mostró que el tratamiento dsRNA indujo la expresión de TLR3 sobre la superficie celular de las vías aéreas, en comparación con ssRNA controles de los animales tratados. El upregulation de TLR3 dsRNA-expuestos en las vías respiratorias de ratón sugiere una respuesta positiva del sistema en el que las células epiteliales expuestas a dsRNA aumento TLR3 expresión en su superficie celular. Un similar upregulation de TLR3 ha sido previamente descrito en células epiteliales in vitro tratados con el virus sincitial respiratorio (VSR) [53]. Estos resultados son también compatibles con los estudios in vivo, usando el anticuerpo monoclonal para TLR3 y genética de los ratones knockout TLR3 [52, 54] que establecen el papel de TLR3 dsRNA en elevar el reconocimiento y la interesante posibilidad de que TLR3 pueda participar en la ruta de señalización de mediación dsRNA Inducción de la CEC quimiocinas.

Conclusión

En conclusión, hemos demostrado que el eje biológico de CXCR2 ligand/CXCR2 señalización desempeña un papel fundamental en la mediación y el reclutamiento de neutrófilos dsRNA lesión pulmonar inducida. Este mecanismo puede ser fundamental para la promoción de nuevas y la remodelación de la lesión pulmonar en pacientes que eventualmente desarrollar enfermedades pulmonares crónicas como el asma, EPOC, fibrosis quística, fibrosis pulmonar o la displasia broncopulmonar. Las conclusiones del estudio en curso de apoyo a la alegación de que CXCR2 ligandos y CXCR2 dsRNA mediar lesión pulmonar inducida, y podría ser una diana terapéutica para atenuar esta patología.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

De los autores Contribuciones

VL diseñado y llevado a cabo todos los experimentos y redactó el manuscrito; JB y MK contribuido al análisis y la interpretación de los datos; MB y YX contribuido a la realización de experimentos con animales, y siempre RS final el análisis y la interpretación de los datos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (NIH), subvenciones HL66027 y P50HL67665 (RS), el Premio Nacional de Servicio de Investigación (NRSA) Formación Institucional Grant, T32 HD07549 (VL) y patrocinado por el NIH UCLA Salud Infantil Investigación desarrollo de la carrera profesional K12 Premio (CHRCDA a) (VL).