Proteome Science, 2005; 3: 3-3 (más artículos en esta revista)

Objetivo selección de los complejos de proteína soluble para estudios de la proteómica estructural

BioMed Central
Weiping Shen (weipings@sfu.ca) [1], Steven Yun (syun@sfu.ca) [1], Bonny Tam (btama@sfu.ca) [1], Dalal Kush (kdalal@sfu.ca) [1 ], Frederic F Pio (fpio@sfu.ca) [1]
[1] Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 8888 University Drive, Burnaby, British Columbia, Canada, V5A 1S6

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Resumen
Antecedentes

La expresión de la proteína en E. Coli es el sistema más utilizado para producir proteínas para estudios estructurales, porque es rápido y barato y puede producir gran cantidad de proteínas. Sin embargo, cuando las proteínas de otras especies de mamíferos, como se producen en este sistema, los problemas de la expresión de la proteína y la solubilidad surgir [1]. Genómica estructural proyecto están investigando la proteómica oleoductos que se producen cantidades suficientes de proteínas recombinantes para estudios estructurales de la proteína. Para investigar la forma en que el E. Coli la expresión de la proteína sistema podría ser utilizado para este fin, la proteína purificada apoptosis binario complejos formados entre los miembros de la caspasa Asociado de Contratación (CARD) de dominio de la familia.

Resultados

Una combinatoria enfoque a la generación de complejos de proteínas se realizó entre los miembros de la familia de proteínas de dominio CARD que tengan la capacidad para formar hetero-dímeros entre sí. En la aplicación de este método, cada gen que codifica para una proteína específica socio es clonado en pET-28 ter (Novagen) y PGEX2T (Amersham) vectores de expresión. Todas las combinaciones de los complejos de proteínas se obtendrán por la reconstitución de los complejos de componentes purificados en condiciones nativas, después de la desnaturalización de renaturation o co-expresión. Nuestro estudio aplicado a 14 CARD dominio de las proteínas solubles reveló que co-realizar estudios de expresión mejor que la nativa y desnaturalización de renaturation métodos. En este estudio, confirmamos las interacciones existentes vivoin vivoin obtenidos en células de mamíferos y también predecir nuevas interacciones.

Conclusión

La sencillez de este método podría ampliarse fácilmente para identificar los complejos de proteína soluble de los proyectos de genómica estructural. Este estudio informativo informes estadísticos sobre la solubilidad de la proteína expresada en E. coli pertenecientes a la familia de proteínas humanas CARD.

Antecedentes

El objetivo de la proteómica estructural es experimentalmente a derivar las 3 dimensiones la estructura de todas las proteínas en genomas mediante la determinación de la estructura 3D suficiente de los miembros de una familia de proteínas que el resto de esas estructuras se puede predecir con exactitud a través de métodos computacionales [2]. Las tasas de éxito en los estudios hasta la fecha, principalmente aplicada a procariotas, son todavía bajos. Efectivamente, el 1 º y el 5% de las estructuras se resuelven experimental de unos pocos miles de Open Reading Frame (ORF) a prueba por estudio. Las razones de esta limitación se debe principalmente al hecho de que muchas proteínas son insolubles cuando se expresa en un sistema heterólogo o cuando purificada y concentrada en los niveles necesarios para estudios de cristalización. La tasa de éxito es aún menor cuando se aplica a eucariotas, en donde por ejemplo, se demostró recientemente que en C. Elegans sólo el 20% de la ORF clonados producidos soluble recombinante de proteínas adecuado para estudios estructurales. Esta tasa es significativamente más bajo que el de estudiar la genómica estructural prokaryotics ORF [3]. En estos estudios, una enorme cantidad de esfuerzo se ha gastado para mejorar la solubilidad de proteínas por el cambio de la expresión sistema, la modificación de las etiquetas de fusión, en sustitución de la expresión de acogida, la generación de una nueva variante de la modificación estructural de la proteína a través de la ingeniería genética incluyendo mutagénesis [4] y Métodos de cálculo y, finalmente, por la realización de estudios sobre la cristalización de una proteína orthologs a la proteína inicial candidato [2, 5]. Sin embargo, la plena automatización de estos enfoques hay que mejorar y de las nuevas tecnologías se está llevando a cabo constantemente en los ductos para aumentar las tasas de éxito en nuestra determinación de la estructura. Una aún más difícil e importante tarea para la proteómica estructural estudios es determinar la estructura en 3D de todos los complejos de proteínas de un organismo. La mayoría de las proteínas no funcionan como un monómero, pero interactúan con otras proteínas para llevar a cabo sus funciones en forma de complejos estables o transitorios. Además, el conocimiento de estas interacciones es de fundamental importancia, ya que la complejidad del genoma de un organismo no es sólo en relación con su número de los genes sino que es más directamente relacionados con la complejidad de sus interacciones proteína-proteína redes. Completo de automatización de los procesos, sigue siendo difícil debido a que el oleoducto proteómica para obtener una cantidad suficiente de proteína soluble complejos ha de permitir la posibilidad de purificaciones diferentes escenarios para cada una proteína compleja. Por otra parte, son por lo general complejos de proteínas difíciles de reconstituir de los distintos componentes de las proteínas y por lo general es casi imposible para purificar una cantidad suficiente de proteína in vivo complejos para estudios estructurales. Por último, las interacciones entre las proteínas en las células son efectivamente dinámico con una amplia gama de afinidades. La vida media de los complejos de proteínas es bastante diversificada de complejos estables a transitorios y de las interacciones pueden ser dependientes de las modificaciones posteriores a la traducción. La modificación después de la traducción no puede ser reproducido en experimentos in vitro o son intrínsecamente no apto para estudios de cristalización muy estable ya que los sistemas son necesarios para el éxito de los estudios cristalográficos [6 - 8].

Tres pasos son necesarios para obtener suficiente proteína in vitro para llevar a cabo estudios estructurales de los complejos de proteínas de cada uno de los componentes. (I) Producir proteína soluble, (ii) hacer un complejo soluble, y (iii) generar alta concentración de proteína altamente purificada y complejos para hacer frente a la cristalización del proyecto. En este estudio, nos concentramos en el primer paso, el de la obtención de proteína soluble complejos. Algunas iniciativas de la genómica estructural están actualmente intentando desarrollar la proteómica oleoductos que incluye la producción de la proteína recombinante de E.coli complejos [9]. Hemos tratado de identificar un ideal familia de proteínas que podría utilizarse para este fin. Debe ser un pequeño soluble de dominio que puede realizar operaciones simples y complejos de la proteína de la que muchos complejos de proteínas se han identificado in vivo. Como resultado de ello elegimos la familia de proteínas humanas CARD. Esta proteína pertenece a la familia la muerte de dominio super-familia consistente en la muerte de Dominio (DD), de dominio de la Muerte Effecter (DED) y la Pyrin, AIM (Ausente en el melanoma), ASC, apoptosis asociada a speck similares a la proteína que contiene un Caspasa contratación de dominio CARD, y de la Muerte-Domain (DD)-como (PAAD / DAPIN / PYRIN) de dominio subfamilias. El dominio CARD contiene 35 miembros de la familia que están involucrados en la apoptosis y comparten un dominio de 85 aminoácidos, plegado en un paquete de 6 hélice. El dominio es un dominio de contratación que tiene la capacidad de formar hetero-dímeros entre miembros de una misma familia proporcionando un marco estructural para completar la cascada apoptótica conduce a la activación de la caspasa y la muerte celular. Hasta la fecha, dos estructuras diferentes de la muerte de dominio complejos han sido resueltos por cristalografía de rayos X representado por la estructura de los humanos CARD dominios de Apoptotic Factor de Activación de proteína-1 (APAF-1) con caspasa-9 [10], y la muerte Dominio de Pelle con Tubo en Drosophillia [11]. Análisis estructural de estos dos complejos de proteínas reveló los diferentes modos de reconocimiento proteína-proteína similar mientras que los dominios están implicados en la interacción proteína-proteína.

En este trabajo, el primer paso de un proyecto estructural proteómicos para obtener proteína soluble complejos desde el dominio CARD se informó. Del 25 CARD clonados y proteínas expresadas en E. coli, 14 TARJETA diferentes proteínas solubles se obtuvieron. CARD purificación de la proteína recombinante de las proteínas se realizaron binario y complejos proteicos se reconstituye sistemáticamente purificado de cada uno de los componentes bajo nativo, la desnaturalización de renaturation condiciones y por la co-expresión de dos proteínas CARD simultáneamente en E. Coli estable para identificar las interacciones proteína-proteína.

Resultados
Expresión y solubilidad

Para estudiar la interacción entre CARD-que contienen proteínas, 14 TARJETA proteínas recombinantes fueron sometidos a tres diferentes pruebas aglutinantes. En primer lugar, todos los clones recombinantes se caracterizaron por su expresión y de la solubilidad en E. Coli. Una comparación del total de lisado de células y proteínas solubles fracciones reveló que la mayoría de las proteínas CARD se expresaron en los niveles medio y alto (2-5 mg / litro). Sólo pET construcciones (que añadir un poli-histidina a la N-terminal de la proteína expresada de interés) que contiene los dominios de la TARJETA celular homólogo del herpesvirus equino-2 E10 de genes que contiene un amino-terminal caspasa contratación de dominio (BCL10) y La apoptosis proteína que contiene un dominio CARD (CLAN) (pET-28 ter-BCL10 y pET-28 ter-CLAN) fueron produciendo una proteína recombinante expresada en el nivel bajo (menos de 1 mg / ml). Se indujo la expresión de la proteína en dos diferentes temperaturas (37 ° C y 30 ° C) y dos IPTG diferentes concentraciones (1 mM y 0,1 mM) para encontrar las óptimas condiciones de la disolución.

Tres pET-28 ter de las construcciones-, sólo CARD proteína (CP), NucleOLar proteínas 3 (NOL3), y la apoptosis asociada a Speck-como la proteína que contiene un CARD (ASC) (pET-CP-28 ter, 28 ter-pET-NOL3 , Y pET-28 ter-ASC) que se produce en E.coli recombinante de las proteínas son insolubles. A pesar de algunas mejoras de solubilidad fue visto después de la inducción a 30 ° C, clasificadas como "no solubles", a causa de bajo rendimiento (por debajo de 1 mg / L de la cultura). Estas proteínas son insolubles purificada a partir de E. Coli en virtud de las condiciones de desnaturalización renatured y luego de vuelta al estado nativo. La situación de la replegado fue confirmada por dicroísmo circular (CD), experimentos (datos no presentados).

Y purificación de proteínas nativas vinculante directa de ensayo

Los 14 clonado, que contiene proteínas-CARD se purifica en una escala mayor y de sus condiciones óptimas solubilización se determinaron empíricamente. Si pureza insuficiente de proteínas (<90%) se obtuvo después de que su etiqueta de depuración de afinidad, algunas de las proteínas más fueron sometidos a cromatografía de intercambio iónico. Un total de 91 muestras fueron inicialmente creado para dirigir en virtud de las condiciones vinculantes. Una forma rápida para observar cualquier vinculante fue utilizar estas muestras de forma continua no desnaturalización gel de poliacrilamida, junto con las proteínas individuales como control. Cualquier cambio en la movilidad electroforética con respecto al de las vías de control que indique positivo vinculante. Este planteamiento dio lugar a la identificación de uno vinculante directa y 3 indirectos encuadernaciones (Ver ficheros adicionales 1, Figura 1]. Sólo una muestra, en un plazo no denaturating gel de poliacrilamida de una mezcla de Apaf-1 y caspasa-9, la banda mostró un pasado en relación con Apaf-1 y caspasa-9 control de las bandas. En otros 3 muestras de la apoptosis de nucleótidos que contiene una proteína vinculante de dominio y un dominio CARD (NAC) y ASC, CARD-9 y BCL-10, ASC y BCL-10, se observó una disminución en la intensidad de las bandas para el teñido Mezcla de proteínas muestra carril correspondiente a la proteína individual, pero no hemos cambiado detectar cualquier banda de la proteína compleja. Sugerimos que en estos ensayos vinculante produjo porque la misma cantidad de proteína se cargó en el control de las vías como en la mezcla de proteínas muestra carriles, pero la carga total de la proteína es tan complejo que el complejo no puede migrar en el gel durante la electroforesis. En consecuencia, la proteína no es detectado por el procedimiento de tinción. Además, las dos interacciones proteína-proteína entre NAC y la ASC, CARD-9 y BCL-10 fueron confirmados por otros investigadores [12, 13], mientras que la unión entre la ASC y BCL-10 todavía no se ha determinado experimentalmente. También puede haber otras vinculaciones que no se detectaron debido a la limitada sensibilidad de la tinción de azul de Coomassie.

Desnaturalización inducida-renaturation vinculante ensayo

Para identificar cualquier encuadernaciones, decidimos desnaturalizan las proteínas primero, y luego refold ambas proteínas con el fin de obtener las proteínas complejas. Este planteamiento dio como resultado la identificación de un total de 5 encuadernaciones incluida la que se observó a partir de la vinculantes ensayo con Apaf-1 y caspasa-9 (Ver archivo adicional 2]. No denaturating electroforesis en gel de poliacrilamida reveló consolidaciones dentro de las siguientes proteínas: El Factor de Activación Apoptotic Proteína-1 (Apaf-1) y caspasa-9, NAC y Apaf-1, la del tumor Hasta regulado CARD contienen Antagonista de la caspasa-Nueve ( TUCAN) y caspasa-9, el CAN y el CLAN, y CARD-9 y CLAN (Figura 2]. NAC y Apaf-1 se han mostrado previamente de obligar a los unos a los otros por immunoprecipitation [14]. También se informó de fijaciones para TUCAN y caspasa-9 [15], y, NAC y CLAN [16], que es coherente con nuestros hallazgos. Además, un adicional vinculante observadas entre CLAN CARD-9 y fue recientemente identificados.

Co-análisis de la expresión

En este estudio, la interacción, de 14 de CARD que contienen proteínas fue investigado por la co-expresión en E. Coli utilizando un vector de expresión de dos sistemas diferentes con dos resistencias a antibióticos. Los elegidos son vectores de expresión pET-28 ter y pGEX-2T (que añadir una glutatión S-Transferase en el N-terminal de la proteína expresada) con resistencias kanamicina y ampicilina, respectivamente. Dado que sólo la proteína expresada de pET-28 ter conlleva un N-terminal-histidina etiqueta, la retención de las otras proteínas en un Ni-NTA afinidad de la columna depende de su interacción con el pET-28 ter proteína expresada. Con el fin de evitar cualquier posible falso positivo encuadernaciones, pGEX-2T proteínas se expresaron solos y fueron también objeto de Ni-NTA cromatografía de afinidad. Además, cada proteína CARD fue clonado en vectores para realizar el ensayo en ambas direcciones. Un total de 156 co-expresiones fueron realizadas y analizadas por SDS-PAGE. Se obtuvieron 12 positivos encuadernaciones (Ver archivo adicional 3]. Entre ellos, NAC, CARD-9, y el receptor-Interacción de Proteínas (RIP)-Asociado de proteínas con un dominio de muerte (RAIDD) podrían formar homodimeros, independientemente de que el vector se utilizó en el ensayo, baja (Figura 3]. Todas las fijaciones observado en los dos ensayos fueron también detectados. El carácter vinculante de los informes anteriores y CLAN ASC [17] También se confirmó. Sin embargo, se informó de algunas ataduras que no se obtuvieron en este estudio, entre ellas: La unión del CLAN y BCL-10 [16] CARD-9 y BCL-10 [13], TUCAN y el inhibidor de la caspasa-1 () [ICEBERG 18], y la CP TUCAN [18], y la CP y RICK [19]. Además, algunas nuevas fijaciones se observaron entre CARD-9 y RAIDD, CARD-9 y CLAN, RAIDD y NAC, ASC y ICEBERG

Con el fin de determinar si estas in vitro encuadernaciones de co-expresión también se dan en los estudios de mamíferos sistema, la igualdad de las cantidades de E. Coli proteínas recombinantes fueron incubadas en reticulocitos de conejo lisado (Figura 4], seguida de inmuno-precipitación y el Western Blot. Como era de esperar, nos confirma la formación de complejos de proteínas de mamíferos en el sistema entre los complejos de la proteína recientemente identificada por la co-expresión. Una observación interesante es que la co-expresión de la pET-28 ter-ASC y pGEX-2T-ICEBERG construir, conduce a un complejo de proteínas solubles, mientras que el pET-28 ter-ASC cuando se expresa individualmente produjo una proteína recombinante considera insoluble.

Discusión

Con el fin de desarrollar un bajo costo, simple y fiable sistema, que se puede utilizar para generar in vitro cantidad suficiente de proteína para la determinación de estructura de proteínas, que comparó tres vinculante de ensayo in vitro de los sistemas: nativos vinculante ensayo, la desnaturalización de renaturation vinculante de ensayo, Y co-expresión vinculante de ensayo. Si bien estos tres sistemas diferentes se pueden ampliar fácilmente para generar grandes cantidades de proteínas complejas a un costo muy bajo, su exactitud en la reproducción conocido CARD-CARD las interacciones descritas en la literatura anterior eran muy diferentes (Figura 5]. Según estudios anteriores, los siete complejos de proteínas CARD se informó dentro de nuestro dominio CARD 14 miembros ([12 - 17, 20]]. Co-expresión de ensayo reproduce cinco de ellos con la más alta exactitud de 71,4%. Desnaturalización inducida-renaturation vinculante ensayo fue capaz de generar cuatro complejos de siete publicada complejos (57%). Nativo vinculante ensayo detectó tres complejos de los siete complejos identificados con una precisión del 42,9%. Además, estos tres ensayos in vitro también identificaron un total de cuatro nuevos complejos de proteínas CARD. Co-expresión estudios identificados los cuatro nuevos complejos y de los otros dos métodos identificó un complejo de cada uno. Nuestros resultados de reticulocitos de conejo lisado incubación CARD estudio indican que los complejos de proteínas obtenido entre RAIDD y NAC, ASC y ICEBERG podría ser formado en mamíferos sistema de reticulocitos de conejo. Una proteína-proteína interacción detectada entre CARD9 y RAIDD también fue identificado, pero la ha identificado proteínas diferentes tamaños en comparación con la E.coli proteínas recombinantes no incubados en el conejo reticulocitos lisado. Estos datos podrían sugerir que las diferencias observadas en la movilidad electroforética de las proteínas que interactúan podría se explica por la agregación, modificación después de la traducción asistida o plegable. Este tipo de acontecimientos que se producen durante su incubación en el lisado de mamíferos. No es sorprendente que el dominio de TARJETA ASC y ICEBERG puedan interactuar unos con otros en nuestro ensayo CARD ya que ambos dominios se han manifestado por otros a unirse a una proteína común procaspase-1. En efecto, estudios recientes [21] ICEBERG demostrado que se une a procaspase-1 a través de la interacción CARD-CARD, que impidió procaspase-1 y la asociación con la activación de NF-kappaB y de la activación de la inducción de la muerte celular-quinasa RIP2. Como resultado de ello, ICEBERG inhibe la tramitación de procaspase-1 esencial para la activación de la caspasa-1. Además, la ASC también interactúa con el dominio de CARD procaspase-1 [22]. El resultado funcional de esta interacción depende del nivel de expresión en las células ASC, desde ASC aumenta la secreción de caspasa-1 en el cultivo de células en baja concentración, pero se suprime en alta concentración. Nuevos estudios deberán ser realizados para evaluar la importancia funcional de la interacción entre la ASC y ICEBERG. También es bastante sorprendente que la proteína recientemente identificada complejo obtenido entre NAC [14] y RAIDD [23] se encuentran entre dos proteínas objetivos de la tensión inducida por la apoptosis vía, pero, anteriormente señaladas de participar en diferentes punto de la vía mitocondrial intrínseco. RAIDD participa en la activación de la caspasa-2 por la formación de un complejo llamado multiprotein inducida por la proteína P53-con un dominio de la Muerte de proteínas complejas (PIDDosome) [24] que contienen PIDD, RAIDD, y caspasa-2. Por el contrario NAC aumenta el procesamiento de la caspasa-9 por su unión a Apaf-1 en un complejo llamado multiprotein la apoptosome consistente en apaf-1 y procaspase-9. Hasta la fecha, no hay pruebas de las publicaciones o para indicar una interacción entre la proteína CARD dominio de RAIDD y NAC. Más funcional que se necesitan estudios para evaluar la importancia de esta proteína en la apoptosis. Co-incubación entre CARD9 CLAN y mamíferos en un sistema no pudo demostrar la interacción entre el CARD de estos dos dominios de las proteínas. El in vitro de la proteína complejo formado entre el CARD de dominios CARD9 CLAN y en la co-expresión de ensayo podría ser un artificial o un complejo recientemente identificados. Otras investigaciones, como la co-expresión de estas dos proteínas de mamíferos en el sistema, se debe realizar para confirmar estos resultados.

En este estudio, co-expresión vinculante realizado el mejor ensayo en comparación con los otros 2 métodos probados. También fue el más simple sistema de ensayo, ya que no requieren de purificación antes de la unión antes de los socios formación de los complejos. Además, se observó que algunas proteínas no son solubles cuando se expresa por sí sola, sino que podría formar un complejo proteína soluble en co-expresión experimentos. Por ejemplo, el dominio de TARJETA ASC proteína soluble es apenas cuando se expresa solo en E. Coli, pero su complejo con el dominio de ICEBERG CARD en co-expresión de ensayo es totalmente soluble.

Ambos, nativos vinculante ensayo y desnaturalización inducida-renaturation vinculante ensayo fueron más sensibles a la preparación de muestras. A los nativos de ensayo, entre la mayoría de las parejas a prueba la proteína vinculante no se detectó incluso cuando ambas proteínas están bien dobladas y estable. Esto podría indicar que las condiciones vinculantes necesita ser optimizado para cada complejo o que ayudó plegable y después de la traducción modificaciones son necesarias para la óptima vinculante. Para la desnaturalización inducida - renaturation vinculante de ensayo, ya que la co-incubados pares de las proteínas son denaturated entonces renaturated en las mismas condiciones para formar complejos, esas condiciones deben ser tales que algunos posibles proteínas complejas no pueden ser formadas entre algunos de los pares de prueba en Este estudio [25, 26]. Esto puede ser la razón por la cual tres de los siete publicados CARD-CARD complejos no pueden ser reproducidos en este ensayo.

Conclusión

Nuestros resultados experimentales indican que la co-expresión del sistema se recomienda como primera elección para el estudio estructural de la proteína-proteína. Este sistema de ensayo vinculante es simple, barato y puede ser fácilmente automatizado para estudios de la proteómica estructural.

Métodos
Clonación

EST clones de codificación de dominio CARD se hicieron búsquedas en la base de datos NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi. EST 14 que abarcan el dominio CARD se encontraron y se utilizan como plantillas para la amplificación de PCR. El CARD dominios fueron amplificados por PCR y clonado en el vector de expresión pET o pGEX para obtener los siguientes CARD-que contienen proteínas: NAC (residuos 1373-1473), TUCAN (residuos 341-431), Apaf-1 (residuos 1-108) , Caspasa-9 (residuos 1-111), CARD9 (residuos 14-100), BCL10 (residuos 1-104), RAIDD (residuos 9-95), CP (residuos 1-98), NOL3 (residuos 1-97) , CLAN (residuos 1-87), RICK (residuos 417-540), ICEBERG (residuos 1-90), CARD10 (residuos 31-117), y ASC (residuos 92-195). El individuo dominios CARD (excepto RICK) fueron clonados en la Nde1-BamH1 y BamH1-EcoR1 restricción de los sitios pET-28 ter (Novagen) y vectores pGEX-2T, respectivamente. Desde RICK tenía un interior BamH1 sitio en su secuencia de clonado en Nde1-EcoR1 sitios del vector pET28b.

La expresión de la proteína, la solubilidad, y purificación

PET-28 ter clones se transformaron en E.coli BL21 (DE3) (Novagen) y cultivados en platos de Petri que contiene 50 μ g / ml kanamicina. De cultivo se colonias solo en 25 ml de LB suplementado con kanamicina (40 μ g / ml) a 37 ° C. Su etiquetado proteínas-fueron inducidos a un OD 0,6 por 600 de la adición de IPTG a una concentración final de 1mM. Después de más de 4 horas de crecimiento a 30 ° C o 37 ° C, 2x1 mL alícuotas de la cultura fueron centrifugadas para obtener células "pellets" (5 min a 13000 rpm). Uno de los gránulos de las células se re-suspendió en la desnaturalización de amortiguación y mantenerse como la fracción de células enteras. Las otras fracciones fueron re-suspendido en buffer de lisis nativos (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), sonicated y centrifugada (5 min a 13000 rpm) en tubos Eppendorf. El sobrenadante resultante en representación de la proteína soluble fracción se comparó contra de la fracción de células enteras por SDS-PAGE para determinar el tamaño, y con la relación de expresión y de la solubilidad de cada uno de los niveles de proteína.

Encuadernación ensayo - nativos condición

Para este ensayo los 14 pET-28 ter construcciones se transformaron en E. Coli BL21 (DE3). Transformada clonados fueron inoculadas en un 50 ml de LB preculture noche a la mañana. La no-saturado cultivos bacterianos fueron más diluidos en 1 litro de LB medio de la expresión de la proteína. El cultivo se a 37 ° C con agitación hasta que un A 600 de 0,6 se alcanzó. Fue la expresión de la proteína inducida por la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y la inducción se permitió que tendrá lugar por un período adicional de 4 horas. El inducida por bacterias fueron recolectados por centrifugación (20 min a 4000 rpm). Purificación fue llevada a cabo por cualquiera de las condiciones o desnaturalización dependiendo de la solubilidad condición de la persona que las proteínas. Por virtud de las condiciones de depuración, las células se resuspendió en 15 ml 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol, y 0,1 mM PMSF a pH 8,0. Las células fueron lisadas con un francés presión de células y se centrifuga durante 30 min a 4 ° C en 18000 rpm. Ni-NTA superflow (Qiagen) fue utilizada en la etiqueta-Su purificación de la proteína inducida. 1 ml de 50% de Ni-NTA purines se utilizan para envasar la cromatografía de columna. La purificación de proteínas etiquetadas 6xHis-Se realizó en esta columna usando un 10 a 250 mM imidazol gradiente. Para facilitar el proceso de purificación, las columnas fueron centrifugadas para 1 min a 4 ° C, a 800 rpm para el lavado y elución pasos. Las proteínas purificadas fueron dializados contra vinculante buffer que contiene 50 mM Tris, 100 mM y NaCl a pH 8,0. Por depuración de las condiciones en virtud de desnaturalización, las células se re-suspendió en 15 ml de 100 mM NaH 2 PO 4, 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8,0. Después de cargar el lisado en la columna de la renaturation se realizó con un lineal 6 - 1 M urea gradiente en 50 mM Tris, 100 mM NaCl, el 5% de glicerol, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF, 2 mM de MgCl 2, el 14,4 mM β - Mercaptoetanol, pH 8,0. Elución de las proteínas obligado se realizó con un gradiente de pH pH 8,0 a pH 4,5. Después de la elución de las proteínas carácter re-solución de la proteína fueron dializados vinculante contra un buffer que contiene 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0. Una cantidad igual de las proteínas purificadas (91 combinaciones) se incubaron durante la noche a 4 ° C, y se analizó el carácter vinculante por no continua desnaturalización electroforesis en gel de poliacrilamida (10% PAGE), seguido de la tinción de azul de Coomassie.

Encuadernación ensayo - desnaturalización inducida-renaturation

La depuración de las 14 proteínas recombinantes se realizó como se describió anteriormente. Una cantidad igual de las proteínas purificadas (91 combinaciones) fueron dializados en una bolsa de micro diálisis (100 μ l de volumen total utilizado) contra 8 M urea, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 14,4 mM β - Mercaptoetanol, pH 8,0. Las proteínas fueron desnaturalizados renaturated por dialyzing contra un renaturation buffer que contiene 2 M urea, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM de MgCl 2, 5% de glicerol, el 14,4 mM β-mercaptoetanol. Los complejos de proteínas se detectaron por continuos no desnaturalización electroforesis en gel de poliacrilamida (10%), seguido de la tinción de azul de Coomassie.

Encuadernación ensayo - co-expresión en E. Coli

Una mezcla de 10 ng de pET-28 ter y pGEX-2T construcciones (156 combinaciones) se transformaron en E. Coli BL21 (DE3) y cultivados en placas de Petri que contiene 40 μ g / ml kanamicina con 50 μ g / ml ampicilina. Células de 5 ml de la noche a la mañana culturas crecido a 37 ° C se utilizaron para inocular 100 ml de LB soporte de 40 μ g / ml kanamicina y 50 μ g / ml ampicilina. Se indujo la expresión de la proteína en un 600 OD de 0,6 con la adición de 1 mM de IPTG. Después de más de 4 horas de crecimiento a 37 ° C, las células fueron colectadas por centrifugación (10 min a 4000 rpm). Las células fueron inducidas después volver a suspenderse en 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM PMSF y lisis se realizaron con una presión de células francés. Cell lisado se centrifugó 30 min a 4 ° C en 25000 g. Ni-NTA superflow (Qiagen) afinidad gel fue utilizado para la Su-etiqueta de depuración de los complejos. Elución de las proteínas se realizó con un 20 a 250 mM imidazol gradiente. Después de lavar ampliamente, el obligado proteínas se eluyen en 500 μ L alícuotas. El Ni-co-NTA purificado proteínas y complejos proteicos fueron cargadas a SDS-PAGE y teñido con nitrato de plata.

Encuadernación ensayo en reticulocitos de conejo lisado

Con el fin de verificar si la in vitro de las interacciones positivas obtenidas por la co-expresión de la proteína CARD ambos socios en E. Coli son también capaces de formar complejos de proteínas de mamíferos en un sistema, la igualdad de las cantidades de las proteínas que interactúan putativo se incubaron en 50 μ l de Rabbit Reticulocyte Lisado (Promega) a 4 ° C por 1 hora.

El co-expresó proteínas o complejos proteicos y productos en la unión Rabbit Reticulocyte Lisado (Promega) se immunoprecipitated con anti-6xHis o de anticuerpos anti-GST. Interacciones proteína-proteína se detectó por SDS-PAGE, Western Blot y anti-GST o anti-6xHIS.

Lista de abreviaturas

CARD: Contratación de dominio de la caspasa Asociado, ORF: Open Reading Frame, PAAD / DAPIN / PYRIN: Pyrin, AIM (Ausente en el melanoma), ASC, apoptosis asociada a speck similares a la proteína que contiene un dominio caspasa contratación CARD, y de la Muerte-Domain (DD)-como / Dominio, ApoPtosis, INterferon respuesta / Pyrin, ORF: Open Reading Frame, CD: Circular Dichroism, APAF-1: Proteína Apoptotic Activar Factor-1, ICEBERG: inhibidores de la caspasa-1, ASC: apoptosis asociada a Speck - Como la proteína que contiene un CARD, NAC: apoptosis proteína que contiene un dominio vinculante de nucleótidos y un dominio CARD, RAIDD: la interacción del receptor-proteína (RIP)-Associated ICH-1/CED-3-homologous de proteínas con un dominio de la Muerte, DD: Muerte Dominio, DED: Muerte de dominio efector, PIDD: P53-inducida por la proteína con un dominio de la Muerte, TUCAN: Tumor Up-CARD-regulado que contiene Antagonista de la caspasa-Nueve, BCl10: celulares homólogo del herpesvirus equino-2 E10 de genes que contiene un amino - Terminal caspasa contratación de dominio, CP: CARD Sólo Proteínas, NOL3: NucleOLar proteína 3 o apoptosis Repressor con dominio CARD (CRA), CLAN: apoptosis proteína que contiene un dominio CARD, un rico Leucine repetir dominio (LRR) y un dominio NACHT (inicialmente encontrados En los genes NAip, Ciita, y Het-e Tp1), RICK: RIP RIP-que interactúan como interactúan CLARP CLARP quinasa quinasa, IPTG: isopropílico β-D-thiogalactopyranoside, LB: Luria Hermanos medio, PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoruro SDS-PAGE: Sodio Dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida.

Contribuciones de los autores

WS, realizado immunoprecipitation, algunos compañeros de expresión y ensayos de Western Blot estudios y escribió parte del manuscrito, SY realizado todos los nativos, renaturated y co-expresión pruebas aglutinantes, BT participó en la clonación y experimentos immunoprecipitation, chimenea proporcionó orientación durante este proyecto y Escribió el manuscrito

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Nativo de pruebas aglutinantes de los complejos de proteínas CARD (ppt).
Archivo Adicional 2
Desnaturalización-renaturation pruebas aglutinantes de los complejos de proteínas CARD (ppt).
Archivo Adicional 3
Co-expresión vinculante de los ensayos de los complejos de proteínas CARD (ppt).
Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de las Ciencias Naturales y el Consejo de Investigación de Ingeniería de Canadá (NSERC), el British Columbia Institute Sistema Avanzado (BC ASI), la MSFHR / CIHR programa de capacitación en bioinformática y la Fundación Canadiense para la Innovación.