Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 19-19 (más artículos en esta revista)

Reorganización del citoesqueleto de mediador-integrina alpha6beta1 acciones asociadas de laminina en la proliferación y supervivencia, pero no en la esteroidogénesis de las células de la granulosa ovina

BioMed Central
Frédérique Le Bellego (frederique.lebellego @ mail.mcgill.ca) [1], Stéphane Fabre (sfabre@tours.inra.fr) [1], Claudine Pisselet (pisselet@tours.inra.fr) [1], Danielle Monniaux (Monniaux@tours.inra.fr) [1]
[1] Physiologie de la Reproduction et des Comportements, UMR 6175 INRA-CNRS-Université de Tours-Haras Nacionales, INRA 37380 Nouzilly, Francia

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Resumen
Antecedentes

La laminina (LN) es una de las más abundantes componentes de la matriz extracelular de la lámina basal y las células de la granulosa capas de los folículos ováricos. Cultura de las especies ovina células de la granulosa (CG) en LN sustrato induce a la difusión de las células, mejora la supervivencia y la proliferación celular, y promueve la luteinización. Investigaciones anteriores han mostrado que la mayoría de estos efectos son mediados por la integrina alpha6beta1, pero sus vías de señalización no han sido investigados. El objetivo del estudio fue evaluar la importancia del citoesqueleto en la integrina alpha6beta1 mediada por acciones de laminina en la supervivencia, proliferación y la esteroidogénesis de las especies ovina GC.

Métodos

Las relaciones entre la morfología y las funciones de las especies ovina GC cultivadas en los sustratos que contienen LN y / o péptidos RGD fueron investigados. Los efectos de (1) citocalasina D, un citoesqueleto de actina perturbar las drogas, (2) una función de bloqueo de anticuerpos contra planteadas alpha6 integrina subunidad (IgG anti-alpha6), y (3) un inhibidor de la ERK1 / 2, vía de señalización (PD98059) fueron evaluados para el GC forma, y la proliferación pyknosis tasas, el estradiol y la progesterona secreciones.

Resultados

Citoesqueleto trastornos inducidos por citocalasina D redondeo celular, inhibir la proliferación, promovido pyknosis, inhibe la secreción de progesterona y el aumento de la secreción de estradiol por GC cultivadas en LN. Cuando GC fueron cultivadas en diferentes sustratos que contienen LN y / o péptidos RGD en la presencia o ausencia de IgG anti-alpha6, tanto de la existencia de una estrecha correlación entre el porcentaje de células redondas, y la GC tasa de proliferación (r = -0,87) y Pyknotic tasa (r = 0,76) fueron establecidos, pero no se encontró relación entre la forma y la esteroidogénesis de células. La inhibición de la ERK1 / 2, vía de señalización por PD98059 no tuvo ningún efecto sobre GC forma, la proliferación o pyknotic tasas. Sin embargo, se redujo drásticamente la secreción de progesterona, la expresión del citocromo P450 en la cadena lateral del colesterol y división 3beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa enzimas, y el aumento de la secreción de estradiol, con lo que la reproducción de todos los efectos de la IgG anti-alpha6 sobre la esteroidogénesis de GC cultivadas en LN.

Conclusión

LN podrán participar en el control de paracrina folicular desarrollo a través de diferentes mecanismos. Podría mejorar la supervivencia y la proliferación de GC a través de su integrina alpha6beta1 mediada acciones sobre citoesqueleto. Por el contrario, su acción estimulante sobre la luteinización GC podría deberse, en parte, la mediación de la ERK1 / 2 vía, independientemente de la forma celular.

Antecedentes

Desarrollo folicular está bajo el control de ambas gonadotropinas y paracrina numerosos factores que están críticamente involucradas en la determinación del destino de los folículos, la ovulación o la atresia. Desde el punto primordial a la fase folicular preovulatorio, de la capa exterior de las células de la granulosa (CG) se establecen sobre una lámina basal que los separa de la teca y de las capas de tejido ovárico intersticial [1]. Esta lámina basal, que consiste en la matriz extracelular (ECM), como componentes de laminina (LN), fibronectina, collagens y diversas glicoproteínas y proteoglicanos, es sometido a una intensa remodelación durante el desarrollo folicular y atresia, la modificación de su composición desde el punto primordial a la preovulatorio o atretic Etapas [2]. Por ejemplo, la lámina basal se vuelve menos colagenosa y más rico en laminina durante el desarrollo folicular [3, 4]. En folículos antrales, laminina y otros componentes de ECM también están presentes en la pared de varias de GC [5, 6], en particular en lámina basal-al igual que el material depositado como agregados entre las capas GC, recientemente llamado focimatrix (por focal intra-epitelial matriz) [7]. Estas observaciones indican que los componentes de ECM contribuir al microambiente de la GC, pero su función específica en el desarrollo folicular aún no se han establecido.

LN es una de las más abundantes ECM componentes de la lámina basal [2, 4, 5, 8 - 12] y, como ya se dijo, que también está presente dentro de la capa granulosa de folículos antrales. En ovinos, LN aumentar considerablemente los niveles en la granulosa de los folículos antrales durante las fases folicular y preovulatorio del ciclo [6]. Experimentos in vitro han demostrado que mejora la LN GC supervivencia (rata: [13]; ovejas: [14]] y Estimula la proliferación de GC de pequeños folículos antrales [14]. En GC de los grandes folículos antrales, y preovulatorio, LN aumenta la secreción de progesterona (rata: [13, 15]; cerdo: [16]; ovejas: [6]] y disminuye la secreción de estradiol [6], lo que sugiere que podría promover la luteinización. En conjunto, estos resultados sugieren que la LN tiene un importante efecto regulador en GC funciones en todo el desarrollo de la terminal de folículos antrales.

Entre los diferentes integrinas que puede obligar LN y mediar su acción en diferentes tipos de células, α6β1 y α6β4 tienen la particular característica de ser altamente específicos LN receptores [17]. La subunidad α6 integrina ha demostrado ser enormemente expresado en GC de las diferentes especies de animales (humanos: [18]; tití: [19, 20]; cerdo: [21]; ratón: [22]; ovejas: [6]] . En ovejas, de la sana GC folículos antrales expresar altos niveles de α6β1 integrina, y cuando una función de bloqueo de los anticuerpos contra la subunidad α6-integrina se añade a la mediana de la GC cultivadas en LN, su supervivencia, la proliferación y la esteroidogénesis se cambie drásticamente [ 6]. Estos resultados sugieren que la integrina α6β1 media en la mayoría de las acciones LN GC, pero los mecanismos involucrados en la integrina α6β1 mediada por cambios funcionales en la GC son desconocidos.

A partir de observaciones anteriores, además de los anticuerpos contra la subunidad α6-integrina en la GC medio de cultivo de células perjudica-en la difusión de LN sustrato e induce la formación de grupos de células redondeadas [6]. Cabe la hipótesis de que los cambios en la forma de células podría ser responsable de todo o parte de los cambios funcionales observados en la supervivencia, proliferación y la esteroidogénesis de la GC. Se ha comprobado en varios modelos de celular que integrina vinculante para ECM componentes promueve cambios en la tensión mecánica del citoesqueleto y, en consecuencia, induce múltiples vías de señalización [23, 24]. El citoesqueleto consiste microfilamentos de actina, los microtúbulos y los filamentos intermedios que conectan para formar una red tridimensional que se extiende desde la membrana plasmática, y en particular de integrinas, a los cromosomas en el núcleo [25]. La importancia de la mediación en la esteroidogénesis citoesqueleto en respuesta a las gonadotropinas ha sugerido [26 - 33]. Es probable que influye en la morfología celular de células polarización y orgánulos a través de la organización del citoesqueleto, con lo que el control de la producción y secreción de esteroides [28, 30, 34], pero la posible función de la integrina mediada citoesqueleto cambios todavía no se ha establecido en la regulación de la esteroidogénesis GC, La supervivencia y la proliferación.

El objetivo del estudio fue evaluar la importancia del citoesqueleto en la integrina α6β1 mediada por acciones de la LN en la supervivencia, proliferación y la esteroidogénesis de las especies ovina GC. Para este propósito, se realizaron diferentes experimentos para investigar la existencia de acoplamiento entre la forma y la función de células α6β1 integrina cuando la actividad se vio alterada. En primer lugar, la acción de la citocalasina D, un citoesqueleto de actina perturbar drogas, en tanto se estudió la forma y las funciones de GC cultivadas en un sustrato LN. En segundo lugar, la acción de una función de bloqueo de anticuerpos contra planteadas α6 integrina subunidad fue estudiada en la forma y las funciones de GC cultivadas en los sustratos que contienen diferentes proporciones de LN y péptidos RGD que reconocer específicamente la α5 / α8 / α v / α IIb, pero no la Α6 integrina subfamilias [35]. Por último, las consecuencias de la inhibición de ERK1 / 2 (la señal extracelular relacionados con quinasa) vía de señalización, que se ha demostrado que la transducción algunos de los α6β1 integrina mediada por efectos de la LN [36 - 39], se estudiaron en ambos GC forma y funciones .

Métodos
Reactivos y productos químicos

Acetato de fluorogestona esponjas utilizados para sincronizar los ciclos estrales se obtuvieron de Intervet Pharma (Angers, Francia). FSH porcina (pFSH) de extracto de pituitaria (pFSH actividad = 1,15 × actividad NIH pFSH-P1) que se utiliza para los animales inyecciones se obtuvo del Dr Combarnous Y. (Nouzilly, Francia). B2 medio de los cultivos celulares se ha preparado de acuerdo a Menezo [40]. Rat anticuerpo monoclonal humano contra GoH3 planteadas 6 integrina subunidad α (anti-α 6 IgG) para su uso en cultivos de células se adquirió de Serotec (Oxford, Inglaterra). Por immunoblotting occidental, el anticuerpo policlonal de conejo planteadas contra el citocromo P450 en la cadena lateral del colesterol división (anti-P450scc) se adquirió de Chemicon (Euromedex, Mundolsheim, Francia), anticuerpo policlonal de conejo planteadas contra 3 β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (anti-3 β HSD) fue un regalo Del Dr V.-El Luu (Quebec, Canadá) y el anticuerpo policlonal de conejo planteadas contra ERK1 y ERK2 (anti-ERK1 / 2) se adquirió de Santa Cruz (Le Perray-en-Yveline, Francia). Anticuerpos policlonales de conejo contra la fosforilados formas de ERK1 y ERK2 (anti-P-ERK1 / 2) se adquirió de Calbiochem (Meudon, Francia). Anti-anticuerpo IgG de conejo acoplado a peroxidasa de rábano se adquirió de Interchim (Montluçon, Francia). Los siguientes reactivos fueron adquiridos a Sigma (L'Isle d'Abeau Chesnes, Francia): McCoy 5 bis del medio con bicarbonato, la penicilina y la estreptomicina, la albúmina sérica bovina (BSA grado de cultivo de tejidos) que se utiliza para la cultura del medio, transferrina, selenio, la insulina bovina, Androstenediona, LN de EHS tumor (principalmente LN-1: [41]], citocalasina D, FITC-conjugado phalloidin, PD98059, Igepal, phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), leupeptina, aprotinina, fluoruro de sodio, sodio y pirofosfato de sodio orthovanadate. Hepes, L-glutamina, fungizone tripsina y se compraron de GIBCO BRL (Cergy-Pontoise, Francia). RGD péptidos (arginin - glycin - secuencia de ácido aspártico) se obtuvieron a partir de Interchim (Montluçon, Francia). Estéril placas de 96 pozos (Nunclon Delta) se obtuvieron a partir de Nunc (Naperville, IL, EE.UU.) y el plástico de cultivo de tejidos de cámara slidesfrom Poly-Labo (Estrasburgo, Francia). [3 H] timidina (actividad específica 6,7 Ci / nmol) se obtuvo de Dupont De Nemours (Les Ulis, Francia) y NTB2 emulsión para autorradiografía de Integra Bioscience (Cergy-Pontoise, Francia). Para ensayo de la proteína, la proteína BC kit de ensayo se obtuvo de Uptima Interchim (Montluçon, Francia). Immobilon P membranas de Western-Blots se obtuvieron de Millipore Corporation (Bedford, MA, EE.UU.). ECL (mejora de quimioluminiscencia) los reactivos se obtuvieron de Amersham Pharmacia Biotech (Orsay, Francia).

Animales

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Agrícola y de los organismos de Investigaciones Científicas (número de homologación de un 37801) y llevarse a cabo de conformidad con las directrices para el Cuidado y Uso de Animales en Agrícola Agrícola de Investigación y Docencia. Investigación experimental se realizó con la aprobación del comité de ética regional de la Región Centro (Tours, Francia). Durante la época reproductiva, los adultos ovejas Romanov fueron tratados con esponjas intravaginales impregnadas con progestágeno (acetato de fluorogestona, 40 mg) durante 15 días a imitar la fase lútea. GC se obtuvieron de los animales sacrificados en la fase lútea del ciclo estral siguiente (10 días después de retirada la esponja), después del tratamiento con inyecciones intramusculares, de 6 de IU y 5 UI pFSH administrarse 24 h y 12 h antes de la masacre, respectivamente.

Aislamiento de GC

Para cada experimento de la cultura, inmediatamente después de masacre, los ovarios a partir del 3 de ovejas se sumergieron durante 15 minutos en solución isotónica que contiene anfotericina (50 mg / ml) y antibióticos (2 millones de UI / ml de penicilina y 2 g / l de estreptomicina). Los ovarios fueron colocados en medio B2, y folículos de más de 1 mm de diámetro, fueron disecados en el plazo de 1 hora de la masacre. Un total de 50-70 pequeñas (1-3 mm de diámetro) y 10-15 grandes (> 4 mm de diámetro) fueron disecados de estos combinados ovarios. Líquido folicular de folículos grandes (> 4 mm) era aspirada con una aguja de calibre 26. Cada folículo se hendidura abierta en medio B2, y GC fueron retirados por raspado suavemente la superficie interior del folículo con un bucle de platino. GC suspensiones se agruparon por folículo tamaño (pequeñas: 1-3 mm, o grandes:> 4 mm). Las dos suspensiones de células resultantes fueron centrifugadas a 300 × g durante 7 min y re-suspendido en el medio de cultivo (5 bis McCoy's que contienen bicarbonato suplementado con 20 mmol / l Hepes, 100 kUI / l de penicilina, 0,1 g / l de estreptomicina, 3 mmol / l L-glutamina, el 0,1% de BSA (w / v), 100 μ g / l de insulina, 0,1 μ mol / l androstenediona, 5 mg / l de transferrina, 20 μ g / l de selenio). El número total de células por suspensión se estimó contando cada una alícuota de la suspensión mediante un hemocitómetro bajo un microscopio de contraste de fase. El número varía entre 10 × 10 6 y 20 × 10 6 células por suspensión. Viabilidad celular, determinada después de la tinción vital con colorante azul de tripan (0,125%, concentración final) varía entre el 60 y el 80%.

GC cultura

GC cultura se realizó de acuerdo al método de Campbell [42]. GC de las pequeñas y grandes folículos se cultivaron en 96 pozos de cultivo de tejidos o en placas de cultivo de tejidos recubiertos con cámara de diapositivas LN (5 μ g / cm 2 en agua destilada), a menos que se especifique lo contrario. En los experimentos utilizando sustratos que contienen LN cultura y / o péptidos RGD, diferentes mezclas se prepararon utilizando la solución LN descritas anteriormente y un péptido RGD solución (1,67 μ g / cm 2 en PBS) para obtener diferentes coeficientes de LN y péptidos RGD (100% , 43%, 25%, 18%, 14%, 0% w / w% de la LN en la mezcla utilizada para el revestimiento). Las concentraciones de los péptidos se había determinado en experimentos preliminares para sus efectos morfológicos sobre GC cultivadas en la presencia o ausencia de anti-α 6 IgG (0,5 μ g / ml). Los diferentes sustratos se prepararon 72 horas antes de su uso y se deja secar a temperatura ambiente.

GC suspensiones de las pequeñas y grandes folículos Se sembró a 10 5 células viables / así y cultivadas a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO 2, en el suero libre de medio de cultivo (véase el aislamiento de GC). El efecto de la citocalasina D, un inhibidor de la polimerización de actina, se puso a prueba en diferentes concentraciones en el 0,05 - 5 μ g / ml gama. El efecto de PD98059, un inhibidor de la ERK1 / 2, vía de la activación, se puso a prueba en la 1 - 30 μ M gama. Los efectos de la anti-α 6 IgG (0,5 μ g / ml) fueron siempre en comparación con los efectos de los inhibidores de la cultura dentro de un mismo experimento. Cada condición fue probada por triplicado en cada GC cultura de las pequeñas y grandes folículos. Cultura de los medios de comunicación fueron parcialmente sustituido (175 μ l de 250 μ l) cada 48 h, y la media fue gastado almacenado a -20 ° C hasta el ensayo. A las 144 h de cultivo, las células fueron separadas con tripsina y contó como se ha descrito anteriormente (véase el aislamiento de GC), o preparados para immunoblotting occidental. Para estudios de ERK1 / 2 phosporylation, GC fueron cultivadas en LN o de plástico, con y sin inhibidores, de 24 horas de antelación al oeste de immunoblotting. En experimentos preliminares, la cultura de este tiempo se demostró que es necesario para las células de galvanizado sobre sustrato [14] y permite la detección temprana de los efectos de la LN en ERK1 / 2 phosporylation.

Determinación del índice de timidina etiquetado y pyknotic índice

GC proliferación y la supervivencia se evaluaron mediante la medición de la timidina etiquetado índice (porcentaje de células de la etiqueta) y el índice de pyknotic (pyknotic porcentaje de las células) después de 48 h de la cultura. Esto ha sido demostrado para que la cultura sea el momento óptimo para el estudio de los efectos de diversos factores, en particular ECM componentes, tanto en la proliferación y supervivencia de las especies ovina cultivadas GC [6, 14, 43].

Para determinar el índice de timidina etiquetado, las células fueron lavadas con B2 medio sin timina, y luego incubadas con [3 H] timidina (0,25 μ Ci / ml) a 37 ° C durante 2 h. Después de 2 lavados con B2 medio (con timina), las células fueron separadas con 1% de tripsina, pildoradas y fija en el 3% de glutaraldehído 1,5 horas a temperatura ambiente. Las células fueron entonces untado en láminas histológicas por cytocentrifugation. Frotis se tiñeron con Feulgen, sumergido en NTB2 emulsión, secado al aire, y expuestos por autorradiografía durante 6 días a 4 ° C. El índice de timidina etiquetado se calculó contando el número de la etiqueta y etiqueta células en 20 campos microscópicos (100X objetivo).

Para determinar el índice de pyknotic, las células fueron separadas por la tripsina, fijados en glutaraldehido, cytocentrifuged, y frotis se tiñeron con Feulgen como se ha descrito anteriormente. Pyknotic El índice se calcula contando el número de células pyknotic, es decir, células con condensados o fragmentados cromatina nuclear [44], y no pyknotic células en 20 campos microscópicos (100X objetivo). Resultados anteriores han establecido que la presencia de células pyknotic ADN está asociada con la fragmentación característica del proceso apoptótico cultivadas en GC [14].

Por tanto el índice de timidina etiquetado y la pyknotic índice, los cálculos se hicieron sobre 500-1000 células por diapositiva.

- 17 β estradiol y progesterona radioimmunoassays

Las concentraciones de estradiol y progesterona en el medio de cultivo de la GC de los grandes folículos se midieron después de 144 h de la cultura. Esta ha demostrado ser la óptima cultura tiempo para el estudio de los efectos de los componentes de ECM en la esteroidogénesis de las especies ovina cultivadas GC [6, 14]. El radioinmunoensayo protocolo descrito previamente [45 - 47], fue adaptada para medir los esteroides en medios de cultivo de células directamente. Estradiol El límite de detección fue de 1,5 pg / tubo (7,5 pg / así) y la intra-e inter-ensayo de los coeficientes de variación fueron inferiores al 7% y 9%, respectivamente. La progesterona límite de detección fue de 12 pg / tubo (60 pg / así), y la intra-e inter-ensayo de los coeficientes de variación fueron inferiores al 10% y 11%, respectivamente. Los resultados se expresaron como la cantidad de esteroides secretadas entre 96 h y 144 h de la cultura por 50000 células recuperado al final del período de cultivo.

Inmunotransferencia

GC toda extractos fueron obtenidos por la resuspensión de 100 μ l de buffer de lisis celular [150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% Igepal, deoxycholate de sodio al 0,5%, 0,1% SDS] contiene varios inhibidores de la proteasa (10 mM PMSF, 1 μ g / ml leupeptina, 1 μ g / ml aprotinina) y los inhibidores de la fosfatasa (100 mM de fluoruro de sodio, 10 mM de pirofosfato de sodio, 2 mM orthovanadate de sodio) a 4 ° C por 20 min. Lisados de células fueron centrifugadas a 20000 × g durante 20 min, y la concentración de proteínas en los sobrenadantes se determinó por el BC proteína kit de ensayo después de la del fabricante de protocolo. Alícuotas (5 a 10 μ g, correspondiente a 5 × 10 4 a 10 5 GC) fueron sometidos a 10% SDS-PAGE en virtud de la reducción de las condiciones, las proteínas fueron transferidas por electroforesis en geles de las membranas Immobilon P. Estas membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con 20 mM Tris-buffer salino (TBS, pH 7.6), que contiene un 3% de BSA y el 0,1% de Tween-20 para saturar los sitios inespecíficos. Posteriormente fueron incubados durante 1 h a temperatura ambiente con anti-P-ERK1 / 2, o anti-ERK1 / 2, o anti-P450scc, o anti-3 β HSD (final diluciones 1:1000) en TBS que contienen 1% y el 0,1 BSA % De Tween-20. Después de lavar en TBS que contiene 0,1% de Tween-20, las membranas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con peroxidasa de rábano-conjugado IgG anti-conejo (dilución final 1:10000) en TBS que contiene 0,01% de Tween-20, y la señal fue Visualizado utilizando ECL sistema seguido por autorradiografía. El autoradiograms se cuantificarán mediante un videodensitometer (VDS-CL, Amersham Pharmacia Biotech).

Actina tinción y microscopía de fluorescencia

Después de cultura en la cámara de diapositivas, GC fueron fijadas durante 15 min con paraformaldehído al 4% en PBS. Las células fueron lavadas con PBS y de la izquierda en 0,1 M glicina en PBS durante 15 min. Después de un nuevo lavado, las células se permabilized con 0,2% Triton X-100 (w / v) en PBS con 1% BSA durante 10 min, y sitios de unión inespecíficos fueron bloqueadas en el 2% de BSA. Las células fueron tratadas durante 30 minutos con 0,5 μ M FITC-conjugado phalloidin. Todo lo anterior incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Después del lavado, las células fueron montadas en Mowiol y se estudió con microscopía de fluorescencia. El porcentaje de los diferentes estados morfológicos de GC (propagación de células, las células con forma de huso, ronda células) fue establecido por el recuento de 1000 a 1500 células por la cultura.

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales se presentan como la media ± SEM. Los datos fueron provistos a sigmoidal dosis - respuesta de las curvas de distribución gaussiana o con GraphPrad software PRISM (San Diego, CA, EE.UU.). Los efectos de dosis crecientes de inhibidores (citocalasina D o PD98059) en el número de células, los porcentajes de células redondas, índice de timidina etiquetado y pyknotic índice se analizaron mediante un ANOVA de una vía para medidas repetidas seguido de Tukey-Kramer pruebas. Para un determinado sustrato, el efecto de la adición de IgG anti-α6 en el número de células, los porcentajes de células redondas, índice de timidina etiquetado y pyknotic índice se analizaron mediante la prueba t de Student para datos apareados. Los efectos de la anti-α 6 o inhibidores de IgG (o PD98059 citocalasina D) sobre la esteroidogénesis GC se analizaron mediante un ANOVA de dos vías con el fin de evaluar los efectos del tratamiento, así como de la cultura como consecuencia de las variaciones entre los animales y la calidad de Los folículos ováricos disecados para cada cultura. Los resultados de los análisis de inmunotransferencia occidental fueron analizados por la prueba t de Student para datos apareados. Las comparaciones con p> 0,05 no se consideraron importantes.

Resultados y discusión
Consecuencias de la activación de la integrina α6β1 LN GC en forma y funciones

Resultados anteriores han demostrado que la LN, utilizado como sustrato de la cultura ovina GC, induce a la difusión de las células, aumenta la proliferación y las tasas de supervivencia, estimula la progesterona y estradiol disminuye la secreción de GC y que estos efectos son consecuencia de la activación de la integrina α6β1 LN [6, 14]. En consecuencia, además de anti-α 6 IgG a la mediana de la GC cultivadas en LN inducida de células redondeo de las cifras dramáticas e importantes cambios funcionales, como una disminución de la tasa de proliferación y un aumento de la tasa de pyknotic de GC, así como una disminución de la progesterona y un Aumento de la secreción de estradiol (p <0,01 para todos los parámetros, Fig. 1]. Estos efectos fueron muy específicos a la presencia de LN en el sustrato de la cultura [6].

Efectos de los trastornos del citoesqueleto por citocalasina D GC cultivadas en el sustrato LN

Para evaluar si la totalidad o una parte funcional de estos cambios podrían ser la consecuencia de la célula redondeo de las cifras, la acción de la citocalasina D, un inhibidor de la polimerización de actina, se estudió en la GC cultivadas en un sustrato LN. Además de citocalasina D para el medio de cultivo de la GC de las pequeñas y grandes folículos reducción de la formación de fibras de actina estrés e impiden la difusión de las células de LN, que induce la formación de células con forma de huso en dosis superiores a 0,1 μ g / ml, y de células redondas En dosis superiores a 0,5 μ g / ml (p <0,001 para la GC de los dos pequeños y grandes folículos, Fig. 2 a, b y 2 c]. En GC de los dos grandes y pequeños folículos, citocalasina D, el tratamiento induce una clara disminución dependiente de la dosis en el número de células (p <0,001 para la GC de los dos pequeños y grandes folículos, Fig. 3 bis y 3 b]. En las culturas de la GC de los pequeños folículos con una alta actividad proliferativa, esta disminución en el número de células se asoció con una disminución dependiente de la dosis en la tasa de proliferación celular (p <0,001, Fig. 3 c]. En las culturas de la GC de los dos grandes y pequeños folículos, citocalasina D también indujo un aumento de la tasa de pyknotic a 5 μ g / ml, la dosis (p <0,05, Fig. 3 d]. En las culturas de la GC de los grandes folículos con una alta actividad androgénica, citocalasina D indujo un aumento dosis-dependiente (p <0,001) y la disminución (p <0,01) en la secreción de estradiol y progesterona, respectivamente (Fig. 4 bis y 4 ter ). De conformidad con la disminución de la secreción de progesterona, una clara disminución de la expresión de la clave androgénica, enzimas P450scc (p <0,05) y 3 β HSD (p <0,01) fue observado también en citocalasina tratados con GC (Fig. 4 c y 4 d ). Todos estos efectos de la citocalasina D GC en funciones imitaron las acciones de la anti-α 6 IgG en GC cultivadas en LN sustrato (Fig. 2, 3 y 4]. En general, las células de redondeo se asoció con dramáticos cambios funcionales en GC. Sin embargo, los cambios en la tasa de proliferación y la secreción de estradiol se observaron citocalasina D, en dosis inferiores a 0,1 μ g / ml, que no indujo cambios observables en la morfología celular.

A partir de nuestros resultados, citocalasina D impedido GC propagación de las especies ovina y LN celular inducida redondeo de las cifras. Estos cambios en la forma de células se asociaron con una disminución de la tasa de proliferación, el aumento de la muerte de la célula, una disminución en la secreción de progesterona y un aumento de la secreción de estradiol. Investigaciones anteriores del uso de inhibidores de polimerización de la actina microfilament, como la citocalasina B ó D, han demostrado la importancia del citoesqueleto de actina en GC funciones. En GC, citocalasina disminuye la síntesis de actina y tropomyosin [29], las causas de la desorganización microfilamentos, filamentos intermedios y microtúbulos [48] e induce células redondeo de las cifras. Estos efectos se han notificado a mimick en cierta medida los efectos de las gonadotropinas en el citoesqueleto [28, 32, 34]. Por lo que sabemos, nuestro estudio es el primer informe de los efectos de la citocalasina sobre GC tasa de proliferación y muerte celular. En diversos modelos de células, como las células epiteliales renales [49], [50] hepatocitos o carcinoma de células [51], citocalasina ha demostrado inducir destacamento de la célula el sustrato, a fin de promover la apoptosis y de inhibir la proliferación celular. Sin embargo, citocalasina cambios inducidos en la esteroidogénesis son todavía objeto de polémica. Citocalasina se ha demostrado, ya sea para mejorar (rata: [28, 33, 52]] o inhiben (hámster: [53], cerdo: [54], las ovejas: presente estudio), la secreción de progesterona por GC y para inhibir por lútea células ( Vaca: [55], cerdo: [56]]. De los pocos datos disponibles en relación con la secreción de estradiol, se observó citocalasina B para bloquear la actividad de la aromatasa hámsters GC [53] sino de mejorar en las células de Sertoli inmaduras de rata [57]. Si estas diferencias son consecuencia de las diferencias de tipos de células, las especies animales, o condiciones de cultivo es desconocida. En cualquier caso, los efectos funcionales de una perturbación de drogas como la citocalasina deben considerarse con cautela debido a su general de las acciones sobre el metabolismo celular y la membrana de intercambio de iones. Además, los experimentos con citocalasina no han permitido que la función específica de LN citoesqueleto inducida por cambios en la GC funciones que deben evaluarse. En nuestros experimentos, los efectos observados de citocalasina probablemente ser consecuencia de los trastornos del citoesqueleto y pérdida de la interacción entre las células y que acompañen a sus LN destacamento del sustrato.

Efectos de la inactivación específica de la integrina α6β1 señalización en la vía GC cultivadas en LN y / o sustrato péptido RGD

Para investigar más a fondo la existencia de una relación entre la forma y la función GC, un experimento fue diseñado con la finalidad de inactivar la integrina α6β1 específicamente la vía de señalización sin cambiar GC forma. Cuando cultivadas en los sustratos que contienen diferentes proporciones de LN y péptidos RGD (que varía entre el 100% y 0% LN), GC propagación de todos estos diferentes sustratos (Fig. 5a y 5b]. Además de anti-α 6 IgG en el medio de cultivo de células inducida por redondeo de las cifras significativas sólo cuando el sustrato que figuran por lo menos 43% de LN de GC culturas de los pequeños folículos (p <0,01), y el 14% LN para que las culturas de la GC de los grandes folículos ( P <0,05) (Fig. 5 c 5 y d]. En las culturas de la GC de los pequeños folículos, el redondeo de células inducida por la adición de anti-α 6 IgG se asoció con una disminución en el número de células (p <0,01 para las células cultivadas en un sustrato que contenga al menos un 43% LN), una disminución de la proliferación Tasa (p <0,01 para las células cultivadas en un sustrato que contenga al menos un 43% LN) y un aumento de la tasa de pyknotic (p <0,05, sólo para las células cultivadas en un 100% LN) (Fig. 6 a, b y 6 c ). En las culturas de la GC de folículos grandes, de células inducida por redondeo Además de los anti-α 6 IgG se asoció con una disminución en el número de células (p <0,01), un aumento de la tasa de pyknotic (p <0,05), un aumento de estradiol Secreción (p <0,001) y una disminución en la secreción de progesterona (p <0,05), para las células cultivadas en un sustrato que contenga al menos un 14% LN (Fig. 7 a, b, c y 7 d]. En general el análisis de los resultados de este experimento puso de manifiesto la existencia de correlaciones significativas entre el porcentaje de células redondas y de la tasa de proliferación de pequeños folículos GC (r = -0,87, p <0,001), por una parte (Fig. 8a], y Pyknotic la tasa de GC de pequeños folículos (r = 0,76, p <0,05) y grandes folículos (r = 0,75, p <0,05) en el otro (Fig. 8b]. En cambio, no se encontró correlación significativa entre el porcentaje de células redondas y de la cantidad de estradiol o la progesterona secretada por GC de los grandes folículos (Fig. 8c]. Estos resultados apoyan la existencia de separación de la forma y la esteroidogénesis GC y sugieren que los mecanismos independientes de la reorganización del citoesqueleto también participan en la integrina α6β1 mediada LN acciones en GC.

Cuando GC propagación de LN, la proliferación celular y la supervivencia están claramente mayor [13, 14]. A partir de nuestros resultados, tanto la proliferación y la supervivencia de GC cultivadas en LN, a diferencia de la esteroidogénesis, están estrechamente relacionados con la forma y el citoesqueleto celular organización. En otros modelos de células, que se ha comprobado que las células de la difusión de ECM y de los correspondientes cambios en el citoesqueleto de actina son necesarios para la progresión a través de G1 y la entrada en la fase S del ciclo [50], y que las señales suscitado por el citoesqueleto actuar con independencia de ERK1 / 2 señales para conducir el ciclo celular a través de la maquinaria G1 / S de límites y, por tanto, a promover la proliferación celular [58]. Curiosamente, el trabajo reciente ha demostrado que orienta el citoesqueleto de la célula metabólica y mecanismos de transducción de señales, y que la distorsión mecánica de las células y el citoesqueleto a través de los receptores de la integrina superficie de las células puede cambiar entre los distintos programas de genes (por ejemplo, la proliferación, diferenciación y apoptosis) [59 - 61 ]. En los folículos ováricos, GC se extiende directamente en la lámina basal contiene ECM adoptar una forma columnar, mientras que GC situado en la pared folicular cerca de la cavidad antral son generalmente ronda [62 - 64]. Estas células diferentes morfologías están asociados con diferentes distribuciones intracelular de actina [65]. Cabe la hipótesis de que estas diferentes formas de células, las células resultantes de ECM a través de la interacción con los receptores de la integrina, puede influir directamente en el GC funciones. En particular, podría ser la encargada de establecer el gradiente de la supervivencia y la proliferación existente entre la basal y el antro de la zona de la granulosa en la pared de los folículos ováricos [64, 66 - 68].

Efectos de la inactivación específica de la ERK1 / 2, vía de señalización en la GC cultivadas en LN

Para un estudio más a fondo los mecanismos de acción de la LN en GC, probamos la importancia de la ERK1 / 2, vía de señalización, que se ha demostrado que la transducción algunos de los α6β1 integrina mediada por efectos de la LN [36 - 39], tanto en la regulación de GC Forma y funciones. A las 24 h de la cultura, la fosforilación de ERK1 y ERK2 fue mayor en las células cultivadas en LN que en el sustrato de plástico, lo que indica que podría activar la LN ERK1 / 2 en la vía GC (p <0,01, Fig. 9]. Además de PD98059, un inhibidor específico de la ERK1 / 2, vía de activación, inhibido ERK1 / 2 en la fosforilación GC cultivadas en LN sustrato (p <0,01), como se esperaba, pero el anti-α 6 IgG y citocalasina D no tuvo ningún efecto (Fig . 9]. La ausencia de efecto de la función de bloqueo de anticuerpos contra planteadas subunidad α6 de ERK1 / 2 en la fosforilación GC cultivadas en LN fue inesperada. Se podría explicar por la existencia de otras integrinas como la subunidad α3 v α y que también son capaces de obligar a LN [41] y se ha demostrado que estar presente en GC ([19, 69] y nuestro observaciones no publicadas). Si estas integrinas participan en la activación de ERK1 / 2, vía de señalización GC cuando se adjuntan a la LN sustrato sigue siendo objeto de estudio. Alternativamente, la ERK1 / 2, vía de señalización puede responder mal a la activación de la integrina α6β1, o la parte occidental de immunoblotting método podría no ser lo suficientemente sensibles como para detectar pequeños cambios cuantitativos en ERK1 / 2 fosforilación.

En las culturas de la GC de los dos grandes y pequeños folículos, PD98059 inducido ningún cambio significativo en la difusión de GC en LN (Fig. 10 bis y 10 ter], o en la tasa de pyknotic GC, y sólo tienen un débil efecto inhibitorio sobre la proliferación tasa de GC, Actuando a la dosis más alta de 30 μ M (p <0,05, Fig 10 quáter y 10 d]. En cambio, PD98059 firmemente el aumento de la secreción de estradiol (p <0,001) y la disminución de la secreción de progesterona (p <0,001), así como P450scc (p <0,05) y 3 β HSD (p <0,05) en la expresión de los grandes folículos GC cultivadas en LN (Fig. 10 e, f, g y 10 h]. Estos efectos no se observaron cuando se cultivaron en GC plástico (datos no presentados). En conjunto, estos resultados sugieren que la ERK1 / 2, vía de señalización podrían participar en acciones LN GC en la esteroidogénesis, independientemente de las acciones LN en forma de células. Por el contrario, la supervivencia y la proliferación de GC son probablemente estrechamente asociado con la forma y el citoesqueleto celular organización.

En investigaciones anteriores, la ERK1 / 2, vía de señalización se ha demostrado que interviene en la regulación de la esteroidogénesis GC, pero su activación se ha ya sea estimulando o inhibiendo los efectos en función del estímulo [70]. Por ejemplo, ERK1 / 2 inhibe la activación de las gonadotropinas Star expresión de la proteína y la secreción de progesterona, contribuyendo así a la desensibilización de los mecanismos de acción hormonal [71, 72]. Asimismo, la prostaglandina F2alpha-adenosina trifosfato o inducida ERK1 / 2 activación inhibe hCG-estimulado la secreción de progesterona [73, 74], mientras que el IGF-I-melatonina o inducida ERK1 / 2 activación aumenta [75, 76] y de IGF-I Inducida por ERK1 / 2 aumenta la activación de la expresión del receptor de LDL [77]. Curiosamente, ERK1 / 2 se ha demostrado que las moléculas de señalización intracelular que regulan diferencialmente FSH inducida por progesterona y estradiol en la síntesis de GC [78]. Por lo tanto, la divergencia de regulación de la LN inducida por la secreción de progesterona y estradiol por PD98059 observada en ovinos GC apoya la hipótesis de que ERK1 / 2 es una importante vía de señalización en la regulación de la esteroidogénesis por LN en GC.

Conclusión

Los resultados de este estudio ponen de relieve el papel del citoesqueleto celular y de la forma en el control de la proliferación y la supervivencia GC. En GC, como en muchos otros tipos de células, mechanotransduction firmemente el control de los procesos básicos de estas funciones de la célula [60]. A partir de nuestros resultados, LN participa en el control de esta por su α6β1 integrina mediada por las acciones de GC citoesqueleto. En contraste, la esteroidogénesis es una función específica de la GC plenamente diferenciadas que se encuentra bajo el control de diferentes vías de señalización que el citoesqueleto sería de menor importancia en comparación con el AMPc o ERK1 / 2 vías. Se sugiere que los cambios en el citoesqueleto celular y de forma inducida por las acciones de las gonadotropinas, factores de crecimiento o ECM componentes acompañaría en lugar de producir un cambio en la esteroidogénesis. Curiosamente, la ERK1 / 2 vía podría desempeñar un importante papel de mediador de la acción de la LN en la luteinización GC.

Contribuciones de los autores

FLB, SF, PC y DM llevan a cabo experimentos de la cultura. FLB llevado a cabo ensayos de los esteroides y el oeste de immunoblotting experimentos, participó en la tinción de actina experimentos, análisis estadístico e interpretación de datos, y participó en la redacción del manuscrito. SF participó en los ensayos de esteroides y ha contribuido a la concepción y diseño del estudio, la interpretación de los datos y el proyecto del manuscrito. CP llevado a cabo el índice de timidina etiquetado y pyknotic índice determinación experimentos y participó en la tinción de actina experimentos y la interpretación de los datos. DM concibe el estudio, participaron en su diseño y coordinación, el análisis estadístico y la interpretación de los datos y redactó el manuscrito. FLB, SF y DM leído y aprobado el manuscrito final. CP murió durante la preparación del manuscrito, pero su contribución es tal que merece ser reconocido como un autor. Este estudio está dedicado a su memoria.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a F. Dupont y todos los miembros de la unidad experimental de las especies ovina animal gestión y colaboración en el diseño experimental. Este trabajo fue apoyado en parte por un fondo de la organización francesa "La Ligue contre le cancer". FLB fue apoyado por una beca de francés, financiado conjuntamente por el INRA y de la "Región Centro".