Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 22-22 (más artículos en esta revista)

Factor de crecimiento transformante beta-1 reduce el rendimiento de la segunda división meiótica de los espermatocitos pachytene rata in vitro

BioMed Central
Anne Damestoy (damestoy@lyon.inserm.fr) [1], Marie-Hélène Perrard (perrard@lyon.inserm.fr) [1], Michèle Vigier (vigier@lyon.inserm.fr) [1], Odile Sabido ( Odile.Sabido @ univ-st-etienne.fr) [2], Philippe Durand (durand@lyon.inserm.fr) [1]
[1] INSERM U418; INRA UMR1245, Université Claude Bernard-Lyon 1, 29 rue sœur Bouvier, 69322 Lyon Cedex 05, Francia
[2] Centre commun de Cytométrie en Flux, Faculté de Médecine, Université Jean Monnet, 42023 St Etienne, France

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

TGF beta y sus receptores están presentes tanto en las células germinales y las células somáticas de la gónada masculina. Sin embargo, las estrategias de knock-out para el estudio de la regulación de la espermatogénesis TGF beta han sido desalentadores, ya TGF-beta o TGF-beta receptor null ratones no sobreviven más tiempo que un par de semanas.

Métodos

En el presente estudio, hemos examinado la función de TGF beta-1 en la finalización de la meiosis por rata pachytene espermatocitos (PS) cocultured con células de Sertoli. La identificación y conteo de células meióticas se realizó por citología y citometría.

Resultados

En virtud de las condiciones de nuestra cultura, algunos PS diferenciadas en espermátidas redondas (RS). Cuando TGF beta-1 se añade al medio de cultivo, ni el número de PS o de espermatocitos secundarios ni la vida media de la RS fue modificada por el factor. Por el contrario, el número de RS y de la cantidad de mRNA TP1 fueron menores en el TGF-beta 1-tratadas las culturas que en el control de las culturas. Muy pocas células en metafase I nunca se observó tanto en el control y la TGF beta-1 tratados con pozos. A mayor número de metafase II estaban presentes y su número se incrementó por TGF beta-1 tratamiento. El TGF-beta como bioactividad se detectó en el control de medios de cultivo, la concentración de la que aumentó con el tiempo de la cultura.

Conclusión

Estos resultados indican que el TGF beta-1 no cambió mucho, en su caso, el rendimiento de la primera división meiótica, pero probable aumento de un cuello de botella a nivel de metafase II. En conjunto, nuestros resultados sugieren firmemente que el TGF beta participa en el auto y paracrina vía de la regulación de la diferenciación meiótica de los espermatocitos de rata.

Antecedentes

Multiplicación, la diferenciación y la supervivencia o la muerte de las células germinales testiculares son estrictamente regulados procesos. Durante las últimas décadas se ha hecho evidente que, además de la regulación ejercida por las hormonas de la pituitaria (sobre todo la FSH y LH) [1], la espermatogénesis está bajo el control de una compleja red de factores procedentes de las células somáticas y germinales de la Células de los testículos [2, 3]. Por otra parte, es cada vez más evidente que las hormonas y intratesticular factores pueden compensar al menos en parte, por la ausencia de algunas hormonas o factores, entre ellos la FSH [4 - 6] y andrógenos [7 - 10] o de hormona luteinizante [11] receptores. Por lo tanto, es probable que la sinergia y / o redundancia de reglamentación entre las moléculas es una característica del proceso espermatogénica. Como la mayoría de los factores de crecimiento, citocinas y neurotrophins producidos en el testículo son ampliamente expresado en el organismo, los intentos de comprender su papel en la espermatogénesis por knock-out estrategias a menudo han sido decepcionantes. La transformación del factor de crecimiento (TGF β) es un ejemplo de este tipo de moléculas. TGF β1, TGF β2 y TGF β3 se expresan en la gónada masculina y sus receptores están presentes en el testículo de rata en células somáticas y las células germinales [12 - 16]. TGF-β o TGF-β receptor null ratones se han creado [17 - 23]. Sin embargo, como estos ratones no sobreviven más que unas pocas semanas, su utilidad para el estudio de la espermatogénesis es limitado. Por lo tanto, la utilización de sistemas de cultivos de células y asociar espermatogénica testicular células somáticas podría ser una alternativa valiosa para estudiar la posible participación de intratesticular factores como el TGF β s paso sobre algunos (s) de la espermatogénesis. Nosotros [24, 25] y otros [26 - 28] han demostrado que pueden proceder meiosis in vitro cuando las células de mamíferos espermatogénica se cocultured con células de Sertoli. En roedores, la cinética del proceso es similar meióticas en vivo y en la primera semana de la cultura [24, 26, 29] y espermátidas redondas desarrolladas in vitro pueden producir descendencia normal [30]. Esos sistemas han permitido a la cultura para estudiar algunos aspectos de la celular meiótica proceso [31] o de su reglamento [32]. Por lo tanto, en el presente trabajo, hemos abordado el papel de TGF β1 en la finalización de la meiosis por pachytene espermatocitos de rata cultivadas junto con células de Sertoli.

Métodos
El aislamiento y la cultura de la co-rata células de Sertoli pachytene espermatocitos y espermátidas redondas o

Co-culturas de los 21 días de edad en ratas adultas y células de Sertoli de rata pachytene espermatocitos (PS) o espermátidas redondas (RS) se realizaron en las cámaras, tal como se describe bicameral por Weiss et al. [24]. Más del 90% de las células en el PS se 4C fracción de las células y más de 80% en la RS fracción se 1C células, es más, anteriormente hemos encontrado que el 13% de PS fueron elutriated principios de PS (etapas XIV-IV), el 61% Se media PS (etapas V-IX) y el 26% eran finales de espermatocitos (etapas X-XIII) [32]. En algunos experimentos, ratas adultas fueron inyectados con 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU, Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, Francia) (50 mg / kg) 14 días antes de ser asesinados, con el fin de etiqueta PS / diplotene Espermatocitos de las fases VII-XIII [32]. En estas condiciones, las etapas que llevan la etiqueta BrdU XI, XII y XIII (el único que contiene espermatocitos etapas que pueden tener tiempo para distinguir en más de un RS de 3 días de duración período de cultivo [24, 26, 29]] representaron el 18% del número total De las etapas que llevan la etiqueta que contiene BrdU PS / diplotene espermatocitos. Estos procedimientos fueron aprobados por la Agencia de Investigación Científica (aprobación n ° 69306) y llevarse a cabo de conformidad con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Las células fueron cultivadas en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (F12/DMEM) complementado con antibióticos, NaHCO 3 (13,4 mM), insulina (10 μ g / ml), de transferrina (10 μ g / ml), vitamina C (10 -4 M), la vitamina E (10 μ g / ml), testosterona (10 -7 M), ácido retinoico (3,3 × 10 -7 M), retinol (3,3 × 10 -7 M), piruvato (1 mM) (todos los productos de Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, Francia), y las especies ovina NIH FSH-20 (1 ng / ml) obtenidos a través de NIADDK a 33 ° C en un ambiente humidificado de aire del 95%: 5% de CO 2. En TGF-β1 tratados pozos, TGF β1 humano recombinante (10 ng / ml) (R & D Systems, Lille, Francia) fue añadido en la apical y la basal compartimentos de la cámara bicameral. Sólo basales medios de comunicación (con o sin 10 ng / ml TGF β1) se renueva cada dos días; TGF β1 fue añadido a los medios de comunicación apical en el mismo intervalo.

Immunolabeling de células para citometría de flujo

En determinados días de la cultura, las células se separan de la cultura pozos por trypsinization. Después de contar y determinación de la viabilidad celular por el azul de Trypán exclusión, las células fueron fijadas con helada el 70% de etanol.

Immunolabeling de cultivos celulares y de citometría de flujo se realizaron análisis como se describe por Vigier et al. [32] y Godet et al. [33]. Después de un lavado con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS), las células fueron fijadas permeabilizing resuspendido en buffer (0,25% Triton X-100 / 1% BSA / PBS) durante 20 minutos en hielo. Las células fueron expuestas a un anticuerpo anti-vimentina (clon V9 - Dako SA, Trappes, Francia), a una dilución de 1:500 en el amortiguador de bloqueo (5% suero de ternera fetal / 1% BSA / PBS) durante 3 a 4 h ° C. Después de 3 lavados en el 1% de BSA / PBS, las células fueron incubadas con fluoresceína (FITC)-conjugado de conejo anti-inmunoglobulinas de ratón (Dako SA, Trappes, Francia) diluido 1:60 en el amortiguador de bloqueo durante 1 hora a 4 ° C. Antes de análisis, Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, Francia) se añadió a la etiqueta suspensión celular a una concentración final de 20 μ g / ml.

Citometría de flujo y análisis de la computadora

Después de immunolabeling, las células se analizaron mediante un FacsStar más Cytometer (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Francia), equipado con un 50 mW sintonizado con láser de argón a 448 nm y una INNOVA 300 ion multilined / UV láser sintonizado a los rayos UV. Emisión de fluorescencia se midió con un filtro DF 530/30 para FITC, y un filtro para el DF 42/44 Hoechst 33342. De adquisición de datos y el análisis fueron realizados con el software CellQuest (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Francia). Cuatro datos de los parámetros fueron adquiridas y almacenadas en el modo de lista de archivos: lineal hacia adelante de dispersión de luz (FSC) y lineal ángulo de dispersión de luz (CDC), que representan aproximadamente el tamaño de la celda celular y granularidad, respectivamente; logarítmica FITC (vimentina) para detectar immunolabeling, y lineal Hoechst para medir el contenido de ADN de las diferentes poblaciones de células. Eventos tales como la contaminación de los desechos y agrupada células fueron eliminados del análisis. Cada adquisición se realizó en células de 50000 negativos para vimentina y permitió identificar 1C, 2C y 4C células germinales. Por lo tanto, el porcentaje de cada categoría de las células germinales se multiplican por el número total de células por igual, a fin de obtener el número absoluto 1C, 2C y 4C células.

La extracción de RNA

Total de ARN de las células en cultivo se extrajeron de acuerdo a Chomczynski y Sacchi [34], utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia). La pureza y la integridad del ARN se verificaron spectroscopically y por electroforesis en gel, respectivamente.

Transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)

Secuencias correspondientes a TP1 mRNA [EMBL: X07284] o mRNA p21 [EMBL: NM080782] y 16S rRNA [EMBL: XM341815] fueron amplificados por RT-PCR de la siguiente manera. Capítulo único de ADNc se obtuvieron a partir de la transcripción reversa (RT), de 1 μ g de RNA total en un volumen final de 10 μ l con 100 UI de virus de la leucemia murina Moloney la transcriptasa inversa (MMLVRT), 1,25 mM dNTPs, 0,4 μ g de oligo-dT, 10 MM de TDT y 15 UI de RNasa Guardia (todos los productos de Invitrogen, Cergy-Pontoise, Francia). RT se realizó durante 1 hora a 37 ° C. Una muestra de RNA en la que fue sustituido por el agua estéril se utilizó como control negativo.

TGF β bioensayo

TGF β concentraciones apical en medios de cultivo se determinó utilizando el visón de pulmón de células epiteliales (CCl-64), de acuerdo con Danielpour et al. [35]. En pocas palabras, CCl-64 células se mantuvieron en frascos de 75 cm 2 en MEDM F-12 suplementado con 10% de suero fetal de ternera. En el 0,32-cm 2 pozos (placa de 96 pocillos), alícuotas (5-10 μ l), de medio condicionado con calefacción (o no) a 80 ° C durante 5 minutos se agregaron en 100 μ l ensayo suplementado con 5% de suero de ternera fetal. Después de 1 hora a 37 ° C, CCl-64 células en fase logarítmica de crecimiento trypsinised, una vez lavado con medio de ensayo, y chapada en 3,10 4 cells/100 μ l en los pozos. CCl-64 células fueron cultivadas de la noche a la mañana, seguida de pulso etiquetado con [3 H] timidina (40-60 Ci / mmol, Amersham Biosciences, Orsay, Francia) a una concentración final de 1 μ Ci / ml durante 4 horas a 37 ° C. Las células fueron fijadas tres veces con 250 μ l de metanol-ácido acético (3:1, vol / vol) y se lavaron dos veces con 80% de metanol. 3 H-etiquetados Se extrajo el ADN de 250 μ l 0,4% deoxycholate 0,5 N NaOH. La radiactividad fue medida por un líquido scintillation counter. En algunos casos TGF β bioactividad de los medios de cultivo se determinó en presencia de un bloqueo de TGF β1/2/3 de anticuerpos (clon 1D11, R & D Systems, Lille, Francia).

Inmunocitoquímico estudios en cultivos celulares

En determinados días de la cultura, las células fueron fijadas directamente en el bien con fijador Bouin durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Análisis estadístico

ANOVA se utilizó para comparar entre los datos de más de dos grupos. Pareadas Prueba t de Student se utilizó para evaluar diferencias estadísticas entre el control y el TGF-β1 células tratadas.

Resultados
Efectos de TGF β1 sobre el número total y la viabilidad de las células germinales y las células somáticas

Cuando unos 3,10 5 purificada PS se cocultured con alrededor de 3,10 5 células de Sertoli, tanto el número total de células (células somáticas además de las células germinales) y su viabilidad se redujo ligeramente durante el período de cultivo, como se esperaba [24]. Para ambos parámetros, los descensos fueron similares en el control y TGF-β1 tratados culturas. El día 7, los porcentajes de las células, en comparación con el día 1, fueron 79 ± 8 y 79 ± 10% (m ± SEM, n = 7) para los controles y las células tratadas; el viabilities fueron 71 ± 4 y 69 ± 3%, Respectivamente. Cada día en que se estudiaron los porcentajes de células germinales y de células somáticas fueron similares en el control y TGF-β1 tratados culturas, pero el porcentaje de disminución de las células germinales en la cultura, mientras que el de las células somáticas aumento de 1,3 veces (datos no presentados). Esto indica que las células germinales se perdieron a un ritmo similar independientemente de la condiciones de cultivo, mientras que el número de células somáticas se mantuvo constante durante el período de cultivo.

Efectos de TGF β1 en el número de células germinales de diferentes ploidía y de la cantidad de mRNA TP1

El número de semillas PS (4C células) disminuyó 2,5 veces entre el día 1 y el día 7 en el control y TGF-β1 tratados culturas (ambas p <0,01) y no se observó diferencia entre estas dos condiciones estudiadas en cualquier día (Fig. 1] . En virtud de las condiciones de nuestra cultura, algunos de los PS diferenciadas en RS (1C células) [24, 31, 32]. Sin embargo, cuando TGF β1 se añadió al medio de cultivo, el número de RS formado in vitro fue significativamente menor en los días 5 y 7 que en las culturas de control (p <0,01 yp <0,05, respectivamente). En cambio, ninguna diferencia significativa se observó nunca en la población compuesta por los espermatocitos secundarios y de dobletes de RS (células 2C) (Fig. 1]. Además, la cantidad de TP1 mRNAs (específico del estado haploides), evaluada por la relación TP1/16S el día 14, de TGF-β1 tratados culturas fue inferior a la de los controles (p <0,05) (Fig. 2].

Efectos de TGF β1 en la supervivencia de RS cultivadas con células de Sertoli

En conjunto, estos resultados sugieren que la TGF β1 inhibe la diferenciación de PS en RS y / o afectado a la supervivencia de la RS. Por lo tanto, en la próxima serie de experimentos, se purifica RS cocultured con células de Sertoli durante 5 días, ya sea en la ausencia o presencia de TGF β1 y el número de RS se determinó diariamente entre los días 2 y 5. Como era de esperar [24, 32], se produjo una disminución progresiva en el número de RS durante el período de cultivo. La línea de regresión adecuado el número de RS de cada día permite el cálculo de la vida media de la RS, que es idéntica en la ausencia o presencia de TGF β1 (Tabla 2].

Efectos de TGF β1 sobre el número de BrdU marcado meióticas células germinales y el número de metafases meióticas

Por lo tanto, por encima de los resultados indican que muy probablemente, el TGF β1 fue capaz de inhibir, al menos en parte, alguna (s) de paso en la vía de la diferenciación del PS en RS. En un intento por identificar este paso, en los próximos experimentos, BrdU marcado PS / diplotene espermatocitos de etapas VII-XIII se cocultured con células de Sertoli, en la ausencia o presencia de TGF β1; entonces, el número de la etiqueta BrdU-PS, BrdU - Etiquetados espermatocitos secundarios (SII) y la de la etiqueta BrdU-RS fueron evaluados por el examen microscópico. Los datos presentados en la Tabla 3 muestran que la TGF β1 tratamiento modificado ni el número de PS ni el número de SII sobre cualquier estudiados día, pero disminuyó el número de RS en el día 3 de la cultura. Además, el número de metafases parece aumentar un poco en el día 3, en presencia de TGF β1.

Por lo tanto en los próximos experimentos, cultivos celulares se tiñeron con un 10 fosforilados Ser histonas H3 de anticuerpos con el fin de etiqueta de la división de las células en fase [36, 37] y el número de metafase Iy metafase II se registraron a nivel de todo el germen Población de células, no sólo BrdU marcado con células (Fig. 3 y Tabla 4]. Muy pocas células meióticas metafase I nunca se observó tanto en el control y en el TGF-β1 tratados culturas que excluyen el análisis estadístico significativo. Por el contrario, un mayor número de metafases II estaban presentes en cualquier estudiados día. Además, el número de metafase II fue significativamente mayor por el control de TGF β1 en los días 3 y 5 del experimento (p <001 y p <0,05, respectivamente).

Efectos de TGF β1 en la expresión de mRNA p21

En un intento de explorar el mecanismo de este efecto inhibidor de la TGF β1 en el ciclo celular de las células meióticas, en los siguientes experimentos de la cantidad de mRNA de codificación de la ciclina dependiente de inhibidor de quinasa p21 waf1/cip1 se evaluó en los días 1, 2, Y 3 de cocultures realizado en la ausencia o presencia de TGF β1. El p21/16S proporción fue similar en el control y TGF-β1 culturas tratados sobre cualquier prueba día (datos no presentados).

Los cambios en la concentración de TGF β bioactividad durante coculture de PS con células de Sertoli

La secreción de TGF β1 por las células de Sertoli de células germinales cocultures ha quedado demostrado por el Western Blot [38]. Por lo tanto, en los siguientes experimentos se estudió si el TGF-β como bioactividad fue puesto en libertad en virtud de las condiciones de nuestra cultura. No TGF-β como bioactividad podría ser detectado en los medios de comunicación de la apical compartimentos de la cultura antes de las cámaras de tratamiento térmico (datos no presentados). Por el contrario cantidades significativas se observaron después de la activación de calor, el aumento de la concentración de casi linealmente con el tiempo de la cultura de 0,8 ± 0,1 en el día 3, hasta 4,0 ± 0,2 ng / ml en el día 15 (m ± SEM, n = 3). Este bioactividad fue completamente bloqueado por un TGF β anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el TGF β1, 2,3 (datos no presentados).

Discusión

Que sepamos, no ha habido ningún estudio previo sobre el efecto de TGF β meióticas en la diferenciación de las células germinales masculinas. Sin embargo, se ha demostrado que las células germinales y sintetizar TGF β son los objetivos para el péptido (ver [39] para su revisión). Sin embargo, el TGF-β nula ratones mueren en la validez de las etapas o neonatal, por lo que es prácticamente imposible de investigar la importancia del TGF β en las últimas etapas de la espermatogénesis [17 - 23], por lo tanto, hemos estudiado el efecto de TGF β meióticas en la diferenciación de las células espermatogénica Mediante el uso de un sistema de cultura de la rata PS previamente establecidos en nuestro laboratorio [24, 31, 32]. No efecto de TGF β1 se observó en el número de células de Sertoli PS o en cualquier día en virtud de las condiciones de nuestra cultura. Asimismo TGF β1 no modificó la vida media de semilla RS. Por lo tanto, parece razonable concluir que el menor número de RS observado en el TGF-β1 tratados pozos se debió a un efecto inhibidor de este factor en la transformación del PS en RS. Esta hipótesis parece justificado por el menor contenido en TP1 mRNAs (específico del estado haploides), de TGF-β1 tratados culturas, de 14 días. Proyección de mRNA TP1 contenido se realizó en el día 14 por dos razones: i) el número total de RS en el TGF-β1 culturas tratadas fue significativamente menor que en los controles sólo desde el día 5 en adelante (Fig. 1]. Ii) Se mostró anteriormente que la expresión de TP1 parece ser importante sólo de los pasos del 5-6 de spermiogenesis, es decir, 4-5 días después de la finalización de la meiosis [40]. Sin embargo, la posibilidad de que la TGF β1 podría disminuir la transcripción de TP1 y / o la vida media de su ARNm no se puede excluir.

Un efecto de TGF β1 sólo se observó más allá de un día de cultura, que es el tiempo necesario para la más avanzada elutriated espermatocitos (etapa XIII), para distinguir en los espermatocitos secundarios en virtud de las condiciones de nuestra cultura [31], y ha afectado a la población de células 1C-, pero no 2C-la población de células. Además, el seguimiento citológico de la suerte de BrdU marcado PS mostró que el número de SII fueron similares en la ausencia o presencia de TGF β1, mientras que el número de BrdU marcado metafase parece mayor por este factor. Este último punto fue confirmado, a nivel de toda la población de células germinales, mediante la utilización de un Ser 10 fosforilados histona H3 de anticuerpos, que nos permitió mostrar que el número de metafases segundo se mejoró en presencia de TGF β1. En conjunto, estos resultados sugieren que la TGF β1 no cambió mucho, en su caso, el rendimiento de la primera división meiótica, pero probable aumento de un cuello de botella que resulta en un aumento en el número de metafase II.

La progresión de las células a través del ciclo celular requiere de reunión y de la activación de los complejos CDK-ciclina [41]. CDK actividad puede ser regulada por los cambios en los niveles de ciclina CDK o, por modificaciones después de la traducción de la subunidad CDK y por la formación de un complejo con un conjunto de proteínas llamadas CKI [42]. P21 waf1/cip1 pertenece a la familia CKI y se une a la CDK2-ciclina A / E complejos [43], que se activa durante la fase G1, S fase y / o de la G2 / M transición. Además, CDK2 y ciclina A1 parecen esenciales para la meiosis [44 - 46]. Varios estudios han demostrado que el TGF β1 induce p21 waf1/cip1 expresión [47, 48]. En el testículo, Beumer et al. [49] han sugerido que p21 waf1/cip1 podrían ser importantes durante la fase meiótica de los espermatocitos, ya que está presente en PS de la etapa V hasta el paso 5 RS. Dado que el trabajo actual, no observamos un aumento de la cantidad de mRNA p21 waf1/cip1 en TGF-β1 tratados culturas. Sin embargo, aparecen nuevos mecanismos capaces de mediar en la detención del ciclo celular causado por TGF β [43, 50 - 52].

In vivo, TGF β1 está presente principalmente en los espermatocitos y RS [13, 53] y la rata testiculares de células germinales y células de Sertoli liberación diferentes tipos de bioactivos TGF β s in vitro ([12, 38, 53] y presentar los resultados).

Inmunohistoquímica estudios han localizado tanto de tipo I (T β RI) y el tipo II (T β RII) transducing receptores para TGF β al epitelio seminífero en el testículo de ratas [12, 15, 16]. Además, Smad2 y Smad3 señalización intracelular que median de la superfamilia TGF β de la superficie celular al núcleo están presentes en células meióticas [54, 55] y TGF β puede regular la expresión génica en estas células [56]. Las cantidades de TGF-β como bioactividad mide en nuestra cultura los medios de comunicación encaja bastante bien con las que se registraron en sobrenadantes de cultivo de células de los diferentes tipos de células testiculares por Haagmans et al. [53]. Además, estas concentraciones son bastante en el rango de las concentraciones de TGF β Cyp19 necesarios para regular la expresión génica en ratas aisladas PS y RS [56] o perturbar la gestión interinstitucional de Sertoli apretado nudo de barrera de permeabilidad in vitro [57]. Además, la labor de Haagmans et al. [53] indica que latente TGF β liberados por cultivos primarios de células germinales y las células de Sertoli se puede convertir en una forma bioactiva en el medio de cultivo. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que la TGF β puede ser involucrado en un auto y paracrina vía de la regulación de la diferenciación meiótica de los espermatocitos de rata. En experimentos de no presentarse aquí, hemos tratado de inhibir la acción de meióticas "endógeno" TGF β con la lucha contra el TGF-β anticuerpos usamos en el bioensayo anterior; sin embargo, el ácido de lavado necesaria para eliminar los anticuerpos antes de contar las células germinales por cualquiera de los métodos Excluida análisis precisos.

Se podría argumentar que los efectos de TGF β1 observada en el presente estudio son relativamente menores. Sin embargo, hay que subrayar que su amplitud es muy similar a los efectos de TGF β en [3 H] timidina incorporación por segmentos de túbulos seminíferos de rata [58] o en la reducción del número de gonocytes rata [59]. Por otra parte, hay que destacar que el elevado nivel de errores de los medios, tanto en el control y TGF-β1 tratados culturas, eran mucho más debido a las variaciones entre los distintos experimentos, como ocurre a menudo en vitro, que a las variaciones de los efectos de los tratamientos TGF β1 . De hecho, por ejemplo, de los siete experimentos reportados en la Fig. 1 o en el Cuadro 3 (día 3), seis o siete exhiben un menor número de RS en el TGF-β1 pozos tratados vs controles. Por lo tanto no es de extrañar que el análisis estadístico dado lugar a importantes diferencias. Además, es evidente que la sinergia y / o redundancia entre los factores reguladores locales son una característica del proceso espermatogénica ([2, 32] y los resultados no publicados). Por lo tanto no es inesperado que muchas moléculas reguladoras, producidos en el testículo, pueden tener un efecto limitado en cierta medida cuando se analizaron en presencia de los otros factores que regulan, en el mismo sentido, el mismo paso de la espermatogénesis. En cuanto a los efectos de TGF β1 observado en el presente trabajo, dos puntos hay que destacar: i) lo más probable es que la amplitud de los efectos de la exógena (añadido) TGF β1 fueron limitados por el TGF β producido por nuestro células germinales-células de Sertoli cocultures (Véase más arriba), ii) en los demás estudios no informaron de aquí, se observó que la NGF, que se produce por PS y RS tanto in vivo [60, 61] y con arreglo a las condiciones de nuestra cultura (MH Perrard, resultados no publicados) también es capaz de Regulan negativamente la división meiótica de rata PS. Por lo tanto, es muy probable, de que la presencia de NGF endógeno también limita los efectos de TGF β1 observado en el presente estudio. De hecho, tal sinergismo / redundancia que parece ser un problema importante cuando el estudio de la reglamentación local de la espermatogénesis, que hace que el conocimiento de este tema dista mucho de ser completa. Estudios adicionales son necesarios para comprender el mecanismo de esta acción de la TGF β1 y por qué es probable que sea en la segunda división meiótica.

Conclusión

Estos resultados in vitro, junto con estudios anteriores que mostraron la presencia de TGF β y sus receptores en las células germinales y las células somáticas de la gónada masculina, sugieren firmemente que el TGF β1 participa en el auto y paracrina vía de la regulación de la diferenciación de rata meióticas Espermatocitos.

Contribuciones de los autores

AD participó en el diseño del estudio, realizado culturas y inmunocitoquímicas y análisis de citometría de flujo y llevó a cabo experimentos de PCR. MHP participado en el diseño del estudio, en las culturas y realizó estudios de inmuno. MV participado en el diseño del estudio, en las culturas y en los experimentos de PCR, y se lleva a cabo TGF β bioensayos. OS llevaron a cabo análisis de citometría de flujo. PD diseñado y coordinado de los experimentos, participó en las culturas, los análisis estadísticos realizados y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique y la Universidad Claude Bernard-Lyon I dC fue apoyada por el Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseñanza Supérieur et de la Recherche. Damos las gracias a T. O'Neill Inglés para revisión y J. Bois de excelente asistencia de la Secretaría.