Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 22-22 (más artículos en esta revista)

La actividad antitumoral de Apo2L/TRAIL paciente sobre los adenocarcinomas de páncreas crecido como xenoinjertos en ratones SCID

BioMed Central
Bonnie L Hylander (Bonnie.Hylander @ Roswellpark.org) [1], Rose Pitoniak (Rose.Pitoniak @ Roswellpark.org) [1], Remedios B Penetrante (Remedios.Penetrante @ Roswellpark.org) [2], John Gibbs F (John.Gibbs @ Roswellpark.org) [3], Dilek Oktay (dilekoktay@hotmail.com) [1], Jinrong Cheng (Jinrong.Cheng @ Roswellpark.org) [4], Elizabeth A Repasky (Elizabeth.Repasky @ Roswellpark . Org) [1]
[1] Department of Immunology, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, 14263, USA
[2] Department of Pathology, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, 14263, USA
[3] Department of Surgery, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, 14263, USA
[4] Department of Experimental Therapeutics, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY, 14263, USA

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Apo2L/TRAIL es bastante prometedor para el cáncer de la terapia basada en el hecho de que este miembro de la familia del factor de necrosis tumoral induce la apoptosis en la mayoría de las células malignas, mientras que las células normales son más resistentes. Además, en muchas células, Apo2L/TRAIL cuando se combina con la quimioterapia, el efecto es sinérgico. La mayor parte de este trabajo se ha llevado a cabo utilizando líneas celulares. Por lo tanto, la investigación de cómo los pacientes responden a los tumores Apo2L/TRAIL puede validar y / o complementar la información obtenida de las líneas de células y resultar útiles en el diseño de futuros ensayos clínicos.

Métodos

Hemos investigado la Apo2L/TRAIL sensibilidad de los tumores pancreáticos de pacientes derivados a un paciente utilizando xenoinjertos de tumores / SCID ratón modelo. Teniendo arraigado tumores de los ratones fueron tratados con Apo2L/TRAIL, gemcitabina o una combinación de ambas terapias.

Resultados

Paciente crecido como xenoinjertos de tumores exhiben un espectro de sensibilidad a la Apo2L/TRAIL. Ambos Apo2L/TRAIL sensibles y resistentes a los tumores de páncreas se encontraron, así como de los tumores que mostraron heterogeneidad de la respuesta. Los cambios en las moléculas de señalización de apoptosis en un delicado tumor se analizaron por Western blot siguientes Apo2L/TRAIL tratamiento; pérdida de procaspase 8, de oferta y procaspase 3 y se observó una correlación con la inhibición del crecimiento tumoral. Sin embargo, en un tumor que fue altamente resistentes a la muerte por Apo2L/TRAIL, aunque hubo una pérdida parcial de procaspase 8 y de oferta en respuesta a Apo2L/TRAIL tratamiento, la pérdida de procaspase 3 fue insignificante. Este tumor resistente también expresaron un alto nivel de la molécula anti-apoptótica Bcl-X L que, en comparación, no se detectó en un delicado tumor. Es importante destacar que en la mayoría de estos tumores, además de gemcitabina a Apo2L/TRAIL dado lugar a una mayor actividad antitumoral de la terapia, ya sea utilizado solo.

Conclusión

Estos datos sugieren que en un entorno clínico veremos heterogeneidad en la respuesta de los pacientes con tumores Apo2L/TRAIL, incluidos los tumores que son muy sensibles, así como los que son resistentes. Aunque todavía queda mucho por hacer para comprender las bases moleculares de esta heterogeneidad, es muy alentador, que Apo2L/TRAIL gemcitabina en combinación con el aumento de la eficacia terapéutica en casi todos los casos y, por lo tanto, puede ser una estrategia muy eficaz para controlar el cáncer de páncreas humanos y de la validación de A la ampliación de lo que se ha informado de las líneas celulares.

Introducción

La alta tasa de mortalidad observado en pacientes con cáncer de páncreas refleja tanto la dificultad en la detección temprana y la falta de un tratamiento eficaz para aumentar la cirugía [1, 2], de modo que, tras el diagnóstico, la media del tiempo de supervivencia de la mayoría de los pacientes se sitúa entre el 4 -- 5 meses [3]. En los últimos años, el uso de la gemcitabina deoxycytodine analógico se ha demostrado que redunden en un mejor beneficio clínico, la supervivencia media ligeramente más largo tiempo y se ha convertido en la primera línea de quimioterapia para el adenocarcinoma pancreático [4, 5]. Sin embargo, desde los cinco años la tasa de supervivencia se ha mantenido en el 4%, muchos de los nuevos enfoques para el tratamiento del adenocarcinoma de páncreas son objeto de investigación [5, 6]. Varios de estos enfoques se centran en las terapias combinadas en las que gemicitabine se combina con un segundo agente citotóxico (por ejemplo auristatin-PE, [7]], o una terapia biológica dirigidos (por ejemplo, el anticuerpo anti-EGFR C225, [8, 9]; OSI-774, Tarceva, [10]].

En 1995, un nuevo miembro del factor de necrosis tumoral (TNF), la familia se identificaron de forma independiente por dos grupos diferentes y el nombre RUTA (Factor de Necrosis Tumoral relacionados Apoptosis inductoras ligando, [11]] y Apo2L (sobre la base de su homología a Fas/Apo1L [ 12]]. Esta molécula induce la apoptosis en un gran número de líneas de células tumorales humanas, tanto in vitro como in vivo, mientras que las células normales no son susceptibles [11 - 15]. Esto es en contraste con otros miembros de esta familia de ligandos (es decir, FasL y TNF), que han marcado la toxicidad cuando se administra sistémicamente (para más discusión ver los últimos comentarios de [16 - 18]]. Un importante papel natural para Apo2L/TRAIL en el immunosurveillance de tumores se ha propuesto sobre la base de su expresión en varias células inmunitarias, incluyendo activado NK y células T (ver [19] para el debate). Esta función natural de Apo2L/TRAIL en la actividad anti-tumor proporciona más razones para tratar de desarrollar Apo2L/TRAIL como molécula terapéutica. Los estudios originales con Apo2L ha demostrado que puede actuar sinérgicamente con los agentes quimioterápicos 5-FU y CPT-11 en los estudios en animales utilizando una línea de células tumorales de colon [14, 20]. Existe desde entonces han sido numerosos los estudios ampliar estas observaciones utilizando un gran número de líneas de células de los diferentes tipos de tumores con una variedad de quimioterapias, tanto in vitro como in vivo. Entre los tipos de tumores sólidos, que han sido estudiadas son de mama [21], [22] de pulmón, de próstata [23], el mesotelioma, [24], [25] renal, de ovario [26], [27] vejiga, glioma [28 ] Y páncreas [29]. Sin embargo, existe la preocupación de que estos resultados podrían no ser predictivos de la respuesta real de los pacientes de tumores. Por lo tanto, una investigación de cómo los pacientes responden a los tumores Apo2L/TRAIL podría validar y / o complementar la información obtenida de las líneas de células y resultar útiles en el diseño de futuros ensayos clínicos.

Nuestro grupo ha investigado la eficacia de Apo2L/TRAIL CPT-11 y la terapia de combinación en pacientes derivados de los tumores de colon [30] utilizando un ratón SCID xenoinjertos modelo que nuestro laboratorio ha desarrollado [31 - 34]. El valor de este modelo es que permite la evaluación real de los tumores de pacientes que mantienen la heterogeneidad histológica y de la arquitectura original del tumor. RUTA ejerció una importante actividad antitumoral en tres diferentes tumores de colon del paciente crecido como xenoinjertos y este efecto fue significativamente aumentada por la adición de CPT-11 ó 5-FU [30]. No obstante, la utilización de este modelo también ha puesto de manifiesto la existencia de pacientes derivados de los tumores de colon, que son resistentes a Apo2L/TRAIL solos, pero son sensibles a la combinación de Apo2L/TRAIL y CPT-11 (Kenji, manuscrito en preparación) Esto sugiere la posibilidad Que una respuesta diferencial a Apo2L/TRAIL puede ocurrir entre los pacientes y la investigación adicional que es fundamental para 1) apreciar el grado en que se produce la variabilidad entre los tumores, 2) el desarrollo de estrategias para el uso de terapias combinadas en Apo2L/TRAIL y 3) la determinación de métodos para predecir De antemano qué pacientes se beneficiarán de Apo2L/TRAIL.

Ha sido informado de que las líneas de células pancreáticas presentan diferentes grados de sensibilidad a Apo2L/TRAIL y que algunas de estas líneas son extremadamente resistentes [35, 29, 37]. También se ha informado de que las células resistentes pueden ser alérgicas a las Apo2L/TRAIL (por ejemplo, [29, 38]]. Sin embargo, aunque la combinación de gemcitabina y Apo2L/TRAIL in vitro ha sido investigado utilizando líneas de células pancreáticas, ha habido informes contradictorios sobre si esta combinación hace [39] o no [40] tiene un efecto citotóxico sinérgico.

En este trabajo describimos nuestra experiencia en la evaluación de cinco pacientes los tumores de páncreas crecido en ratones SCID a Apo2L/TRAIL. La forma recombinante de la muestra utilizada humanos Apo2L/TRAIL baja actividad frente a la murino RUTA receptor y, por tanto, este modelo puede no reveló ninguna toxicidad potencial de Apo2L/TRAIL, sin embargo sí proporciona un modelo pertinente para la evaluación de la sensibilidad de los tumores de pacientes. Nuestros datos apoyan la idea de que algunos de los pacientes pueden presentar tumores de sensibilidad importante, mientras que otros pueden ser resistentes. Sin embargo, otros de los pacientes los tumores pueden ser heterogéneos y exposición de las dos regiones de la sensibilidad y resistencia. Sin embargo, la combinación de gemcitabina y Apo2L/TRAIL puede aumentar la actividad antitumoral contra tumores Apo2L/TRAIL sensible y, sobre todo, puede superar la resistencia a cualquiera de agente único, y en consecuencia la supresión de los tumores resistentes. Por lo tanto, estos resultados predicen que los pacientes los tumores se exhiben tanto la sensibilidad y la resistencia a Apo2L/TRAIL tratamiento y de que puede ser posible desarrollar criterios para la superación de esta resistencia mediante la combinación de quimioterapia y Apo2L/TRAIL.

Materiales y métodos
Paciente tumor pancreático-SCID modelo murino

Nuestro uso de los ratones SCID-modelo de xenoinjertos de tumores de pacientes se ha descrito anteriormente ([31, 33, 41, 32, 34, 30]]. Para estos estudios, de los especímenes quirúrgicos de los pacientes los tumores pancreáticos se recibió poco después de la resección de tejido a través del Servicio de Adquisiciones (TP), de RPCI y cortar en 2 mm × 2 mm en piezas de medio de cultivo de tejidos (RPMI 1640) en condiciones estériles. Ratones SCID fueron anestesiados por inyección intraperitoneal de Avertin 0.4-0.5 ml (2,5 g 2,2,2-tribromoethanol disuelto en 5 ml 2-methyl-butanol/200 ml ddH 2 O) y tumor de piezas individuales que se implantó por vía subcutánea en el abdomen Muro de tres ratones (1 ° paso), y supervisado por el crecimiento. Los ratones utilizados en todos los experimentos fueron 7-8 semanas de edad CB17 ratones SCID con un promedio de peso de 18-20 g. Se les mantiene en jaulas estéril (4-5 ratones por jaula) y alimentados con autoclave chow y el agua. Los ratones fueron mantenidos en el aire acondicionado y luz controlada habitaciones (12 hr ciclos). Todos los procedimientos, las inyecciones y el tumor de las mediciones se llevaron a cabo bajo una campana de flujo laminar usando las precauciones asépticas. Tumor especímenes que creció a un tamaño de 1 cm (8-12 semanas) se recuperaron y posteriormente mediante pasajes en ratones receptores (2 º paso), y se considera que se ha arraigado con éxito estos tumores cuando creció. El diagnóstico histopatológico de las muestras de los pacientes y la evaluación de los arraigado / pasajes tumores se realizó en colaboración con un miembro del Departamento de Patología en RPCI.

Diseño experimental

Cinco diferentes que los adenocarcinomas de páncreas arraigado con éxito en ratones SCID fueron seleccionados para el paso de los grupos experimentales en ratones. Tumores llegó a 4-5 mm de diámetro en aproximadamente 4-6 semanas y los ratones se dividieron en grupos experimentales de tumor de tamaño similar. Estos tumores se denominan Tumor # 1 (TP N º 10791), del tumor # 2 (TP N º 10978), del tumor # 3 (TP N º 11424), del tumor # 4 (TP # 12424), y del tumor # 5 (TP # 11727 ).

Apo2L/TRAIL

Apo2L/TRAIL utilizado en esta investigación fue elaborado por Genentech, Inc, tal como se describe anteriormente [14], y siempre como un regalo por Amgen y Genentech. Un ciclo de tratamiento con Apo2L/TRAIL consistió en la inyección intraperitoneal diaria de 500 μ g Apo2L/TRAIL / 200 ul de solución salina durante 14 días. Ratones tales recibió 2 ciclos separados por un período de 7-10 días de descanso. Control de ratones recibieron salina estéril. El volumen de los tumores se calculó con la fórmula V = × LD (SD) 2 / 2, donde V es el volumen de los tumores, LD es el más largo y el diámetro del tumor SD es el menor diámetro del tumor. Los datos se grafica y los Estudiantes unpaired t-test se calculó utilizando SigmaPlot. En distintos momentos a lo largo y a la terminación de un experimento, los ratones fueron sacrificados y piezas de tumor fueron fijadas en formalina, snap-en cryovials congelados en nitrógeno líquido, o de ambos, para su posterior análisis. Secciones de todas las muestras tumorales fueron procesadas para microscopía de luz por métodos estándar.

Quimioterapia

Gemcitabina (Gemzar, Eli Lilly obtenidos de McKesson, Buffalo, NY) fue administrada por inyección intraperitoneal diario 5 días / semana en dos ciclos de dos semanas de duración, con un intervalo de descanso de una semana en dosis entre 1,0 - 2,5 mg / kg como se indica. Por lo tanto, los ratones recibieron 7.5-13.5 mg / kg semanales, que es menor que la administrada rutinariamente a los pacientes clínicamente (25 mg / kg / semana).

TUNEL ensayo

La apoptosis fue evaluada por terminal deoxynucleotidyl transferasa mediada-dUTP nick de fin de etiquetado (TUNEL) tinción (ApopTag, Intergen, Corp), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Western Blot

Lisados celulares y de tejidos (buffer de lisis que contiene 20 mM Tris pH 7,5, 120 mM de NaCl 100 mM NaF, 0,5% Nonionic P 40, 200 μ M Na 3 VO 4, 50 mM β-Glycerophosphate, 10 mM NaPPi, 4 mM PMSF, 10 Μ g / ml Leupeptine, 2 mM Benzamidine, 10 μ g / ml aprotinina) fueron separados por SDS-PAGE y transferidos a membrana de nitrocelulosa. Blots fueron immunostained por técnicas estándar: no específicas se ha bloqueado y las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. Los anticuerpos utilizados fueron anti-caspasa 8 (Oncogene # AM46), anti-Bcl-X L, (Señalización Celular # 2762), la lucha contra la Oferta (Señalización Celular # 2002), anti-humano mitocondrias (Chemicon AM # 1273; reconoce un 65 Kd epítopo en la membrana de la mitocondria humana intacta) y la lucha contra la caspasa-3 (Imgenex IMG-144). Esto fue seguido por el lavado, la peroxidasa-incubación con anticuerpo secundario conjugado y visualización de las bandas de mayor chemoluminescence (ECL) y la exposición de la blots a BioMax película Kodak. Anti β-actina se utilizó como control de carga.

Inmunohistoquímica

Evaluación inmunohistoquímica de p53 (anticuerpo monoclonal de ratón DO-7, Novocasta) se realizó en las secciones fijas de formol, embebidos de parafina tumores. Antígeno recuperación se logró con DAKO Meta Retrieval Solution utilizando un Negro y Decker vapor durante 20 minutos seguida de 20 minutos en un período de enfriamiento.

Resultados y discusión
Paciente de páncreas adenocarcinomas arraigado en ratones SCID mantener las características histológicas del tumor original

Con el fin de evaluar la sensibilidad del paciente a los tumores de páncreas novela agentes terapéuticos, hemos desarrollado un tumor del paciente / SCID ratón xenoinjertos modelo en el que los especímenes de los adenocarcinomas de páncreas proceden directamente de las cirugías realizadas en el Roswell Park Cancer Institute se estableció como xenoinjertos en ratones SCID. Engraftment éxito se ha obtenido en el 33% de los tumores de páncreas (18 de 53 tumores implantados durante un período de seis años), incluidos los adenocarcinomas y tumores neuroendocrinos. Los tumores utilizados en este estudio fueron seleccionados al azar, de xenoinjertos de tumores de pacientes disponibles. Evaluación histológica de estos tumores demostró que los tumores arraigado mantenido un notable grado de similitud, en términos de las características histológicas visto, a los tumores originales. Las células malignas de los xenoinjertos formaron glándulas se asemejan a los de la de los pacientes y los tumores secretores material se considera a menudo en el lumen de estas glándulas (Figura 1]. Al igual que en los tumores de pacientes, estas glándulas están separados y rodeados de tejido estromal.

El crecimiento de los pacientes derivados de los adenocarcinomas de páncreas puede ser inhibida por Apo2L/TRAIL

En nuestra primera experiencia, los animales tratados con Tumor arraigado # 1 con dos ciclos de Apo2L/TRAIL siguiente horario de 5 semanas (500 μ g/mouse- día durante 2 semanas, 1 semana sin tratamiento, al día durante 2 semanas). Al final de las cinco semanas, el tamaño de los tumores en el grupo tratado fueron significativamente menores que los del grupo control (Figura 2A]. El análisis histológico de tumor en la mediana de cada grupo mostró que hay zonas de necrosis sustancial en el interior de estos tumores. Sin embargo, la periferia de un tumor sin tratamiento consistió en numerosas glándulas de tamaño bastante uniforme que contiene abundante material secretora (Figura 2B]. Por el contrario, en los más pequeños, tratados tumor (Figura 2C], la mayoría de los restantes glándulas son menores, aún más allá y contenía menos material secretoras. Además, en comparación con los no tratados tumor, el tratamiento consistió en tumor proporcionalmente más tejido conectivo. Curiosamente, en la periferia del tumor tratado, había charcos de secretora material que no figura en las glándulas, lo que sugiere que las células epiteliales que forman estas glándulas se había perdido (Figura 2C]. Sin embargo, aunque existe una marcada actividad antitumoral de Apo2L/TRAIL sobre este tumor, el tumor no fue totalmente erradicado y zonas de las células tumorales sigue siendo viable. Se obtuvieron resultados similares con un segundo paciente tumor (Tumor # 2; Figura 3]. El crecimiento de este tumor fue también significativamente inhibido durante los 35 días calendario de tratamiento con Apo2L/TRAIL. Sin embargo, se observó que el crecimiento del tumor se reanudó tras la suspensión del tratamiento estos tumores y creció a un ritmo similar al de los controles no tratados. Por lo tanto, aunque Apo2L/TRAIL pueden suprimir el crecimiento del tumor, es posible que no resulte ser totalmente eficaz como agente único, y es importante desarrollar estrategias para utilizarlo en combinación con otros agentes terapéuticos.

La terapia de combinación con gemcitabina Apo2L/TRAIL y dio lugar a una mayor inhibición del crecimiento del tumor sobre la de agente único ya sea por sí solo

Seguidamente, llevaron a cabo una serie de experimentos para determinar si la eficacia de los pacientes derivados Apo2L/TRAIL contra los adenocarcinomas de páncreas se podría mejorar la utiliza en combinación con gemicitabine. Los resultados de un experimento utilizando Tumor # 2, dependientes de la dosis demostraron una respuesta de este tumor a la gemcitabina y se basa en el hecho de que 1,5 mg / kg de peso moderadamente, pero incompleta, reprimido el crecimiento del tumor (Figura 4], que eligió esta dosis para futuros experimentos Con el fin de observar mejor cualquier beneficio de la terapia de combinación. Posteriormente, el tumor teniendo ratones fueron tratados con 500 μ g de Apo2L/TRAIL solo (para un calendario de 35 días que el anterior), 1,5 mg / kg de gemcitabina sola (5x/week) o de los dos agentes en combinación. Las respuestas de cuatro diferentes tumores paciente a la terapia de combinación se investigaron y los resultados indican la diversidad interesante en las respuestas de estos tumores.

Un tumor, tumoral # 3 fue sensible a la vez Apo2L/TRAIL y gemcitabina sola y sufrió un crecimiento significativo en la inhibición de la respuesta a cualquiera de estos agentes. Aunque el crecimiento represión por combinación de tratamiento no fue estadísticamente diferente de los efectos del tratamiento, ya sea sola sola, el efecto antitumoral parece ser mayor y estos tumores sufrió regresión completa (Figura 5, A-D]. Este tumor es sensible a Apo2L/TRAIL constantemente en varios pasajes (datos no presentados).

En contraste con Tumor # 3, # 4 Tumor exhiben resistencia a la vez Apo2L/TRAIL y gemcitabina cuando se administra como agentes únicos. Sin embargo, el uso de estos dos agentes en combinación es capaz de superar esta resistencia y significativa el crecimiento del tumor se logró la inhibición (Fig. 5, E-H].

# 2 tumor mostró variabilidad en la sensibilidad a la Apo2L/TRAIL. Aunque, cuando originalmente evaluados, Tumor # 2 ha demostrado sensibilidad a la Apo2L/TRAIL solo, en un experimento posterior, el crecimiento no fue significativamente reprimidas por cualquiera Apo2L/TRAIL o gemcitabina sola (Figura 6, A-D]. En este caso, sin embargo, el crecimiento del tumor fue significativamente inhibido por el tratamiento con los agentes en combinación. Durante esta prueba, un representante del tumor fue removido de cada grupo en los días 7 y preparado para la histología (Figura 7, A-D]. La apariencia histológica normal de este adenocarcinoma se muestra en un control de este tumor consistía en elaborar las glándulas secretoras que contienen abundante material y una moderada cantidad de estroma (Figura 7A]. En comparación, tanto la Apo2L/TRAIL (Figura 7B], y gemcitabina (Figura 7C] tratados tumores demostrado evidentes cambios histológicos con menos, más pequeñas glándulas. En marcado contraste con los tumores tratados con agentes únicos solos, el tumor tratados con la terapia de combinación consistía casi en su totalidad de la fibrosis del tejido conectivo y figura sólo viable aislados focos de células tumorales (Figura 7D]. Tinción de estos tumores con el ensayo TUNEL mostró muy pocos en apoptosis en las no tratadas o tratadas gemicitabine solos tumores (Figura 7, E y 7 G]. Sin embargo, un gran número de células apoptóticas están presentes tanto en los tumores tratados con Apo2L/TRAIL solo y Apo2L/TRAIL en combinación con gemcitabina (Figura 7, y 7 F H]. Este experimento con Tumor # 2 se repitió y aunque hubo heterogeneidad en el crecimiento de tumores dentro de cada grupo de tratamiento, los resultados fueron similares en los que la inhibición del crecimiento tumoral significativa se logró por la terapia de combinación (datos no presentados). La evaluación de Tumor # 5 (Figura 6, E-H] arrojó resultados similares en que el crecimiento de los tumores en el grupo sin tratamiento es variable y el crecimiento del tumor no fue significativamente reprimidas por cualquiera Apo2L/TRAIL o gemcitabina. Sin embargo, la terapia de combinación fue capaz de suprimir significativamente el crecimiento del tumor de # 5 (Figura 6H].

En este momento, la base para la cooperación entre Apo2L/TRAIL y gemcitabina no se conoce. Es probable que el conocimiento sobre la expresión de moléculas como p53 en estos tumores será importante en la comprensión de los factores que afectan a la sensibilidad a la quimioterapia. A pesar de que no han secuenciado mutaciones de p53, hemos evaluado por la expresión inmunohistoquímica de p53 en tumores # 2, 3, 4 y 5. Considerando que la sobreexpresión de p53 no fue detectado en tumores # 2, 3 y 4, heterogéneo sobreexpresión del tumor fue detectado en # 5 (datos no presentados). Esto sugiere que las respuestas de estos tumores a la terapia de combinación puede ser independiente del estado de p53. Se ha demostrado que la respuesta de los tumores a la gemcitabina puede ocurrir en una forma independiente de p53 en [42]. Los futuros estudios de investigación de los mecanismo (s) de la cooperación entre Apo2L/TRAIL y gemicitabine se incluirá un análisis de la situación de la crítica como moléculas p53.

Por lo tanto, estos tumores demostró una gama heterogénea de las respuestas a Apo2L/TRAIL. Tumor # 3 es significativamente sensible a la muerte con Apo2L/TRAIL sola y esto fue visto constantemente en posteriores experimentos. Curiosamente, Tumores # 4 y 5 fueron resistentes a la Apo2L/TRAIL solo en el pasaje en que se evaluó. Es informativo que con Tumor # 2, que fue evaluado en varios experimentos, la respuesta varía en diferentes pasajes. Aunque la base de esta variabilidad es desconocida, parece probable que este es el resultado de una heterogeneidad inherente en el tumor original. Por otro lado, esto puede indicar que la respuesta de este tumor a distintos factores en el microambiente tumoral. Curiosamente, aún cuando Tumor # 2 no fue inhibida por Apo2L/TRAIL por sí solo, una mayor cantidad de apoptosis se detectó en el tumor en una fase temprana del tratamiento. A pesar de esta variabilidad es problemática, es probable reflejo de la situación que se puede esperar en la clínica y, por lo tanto, es especialmente alentador el hecho de que la terapia de combinación con gemcitabina muestra ese potencial para complementar y realzar la actividad antitumoral de Apo2L/TRAIL en el Mayoría de estos tumores.

La investigación de la base de la diferencia en la sensibilidad a la Apo2L/TRAIL

Para investigar más a fondo la respuesta de un tumor sensible y resistente a Apo2L/TRAIL, analizamos los tumores de los experimentos con tumores # 3 y # 4 se muestra en la Figura 5. Dos ratones fueron eliminados de la Apo2L/TRAIL control y grupos tratados en el segundo día de tratamiento (6 horas después del tratamiento), y estos tumores analizados por Western Blot (Figura 8]. Se observó una clara diferencia en los niveles críticos de varias moléculas en las vías de la apoptosis en respuesta a Apo2L/TRAIL. En Tumor # 3 (Figura 8A], que es sensible a Apo2L/TRAIL, reducido en gran medida los niveles de procaspase 8 y pujas se detectan en los tumores siguientes Apo2L/TRAIL tratamiento. La reducción de los niveles de la mitocondria intacta humanos también son observadas y hay una clara reducción en detectables procaspase 3. Las muestras de Tumor # 4 fueron igualmente examinados. Como puede observarse en la Figura 8B, los tumores tratados con Apo2L/TRAIL sólo han reducido ligeramente las cantidades de procaspase 8 y los niveles de oferta y de la mitocondria intacta y procaspase 3 son comparables a las observadas en los tumores no tratados. Estos resultados sugieren que Tumor # 3 sufre activación de procaspase 8 y 3 en respuesta a Apo2L/TRAIL y que la señalización a través de oferta de división resultados en la contratación de la vía mitocondrial, y posteriormente, la apoptosis. Por otro lado, es sólo parcial procaspase activación de las 8 de la resistencia del tumor # 4 lo que sugiere que existe un defecto aguas arriba de la activación de caspasa 8, que se traduce en la falta de adecuada activar caspasas 8 y así iniciar la señalización de apoptosis. Una posible explicación de esta reducción de la activación de la caspasa 8 puede ser un defecto en Apo2L/TRAIL la expresión del receptor en la superficie de estas células y esto queda por determinar.

Se ha informado anteriormente que la resistencia de líneas de células pancreáticas establecido a Apo2L/TRAIL y quimioterapia es, en parte, asociada a los niveles de la molécula anti-apoptótica Bcl-X L [35, 43]. Por lo tanto, la expresión de Bcl-X L, una molécula que puede bloquear la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, se ha investigado en estos tumores. Bcl-X L expresión es alta en varias muestras de la resistencia del tumor # 4, frente a la delicada Tumor # 3 en el que Bcl-X L es indetectable en varios pasajes (Figura 9]. Esta expresión diferencial de la molécula anti-apoptótica Bcl-X L en el que un tumor es resistente a Apo2L/TRAIL es coherente con la idea de que en el # 4 del tumor, en el que sólo poco activación de la caspasa 8 ocurre, Bcl-X L puede jugar un Papel en la resistencia mediante la inhibición de la activación de la vía intrínseca de apoptosis por los bajos niveles de cleaved Bid.

Trauzold [37] caracteriza cinco líneas de células pancreáticas con respecto a Apo2L/TRAIL sensibilidad y llegó a la conclusión de que, aunque Bcl-X L se expresa en diferencialmente sensibles (Capan1, Colo357) vs resistentes (PancTul, Panc89, Panc1) las células y hace una importante contribución A la resistencia a la Apo2L/TRAIL observado, no es el único factor. Estos autores concluyeron que la resistencia surge de los efectos combinados de la downregulation de moléculas pro-apoptóticas (FADD, Oferta) y el upregulation concurrente de las moléculas anti-apoptóticas (Bcl-X L, FLIP o IAP). Sus experimentos apoyan la idea de que existe un saldo de varios pro-y anti-apoptóticos factores en células pancreáticas que, en última instancia determina la eficacia de la señal de apoptosis. Recientemente, Bai et al. Han encontrado que golpee abajo de Bcl-XL en células pancreáticas que predominantemente se sobreexpresan, se traduce en aumento de la sensibilidad de estas células a RUTA en combinación con otros medicamentos anti-tumor [44]. El posible papel de Bcl-X L y otras moléculas esenciales, en particular las aguas arriba de la caspasa 8, en la resistencia de los pacientes a los tumores de páncreas Apo2L/TRAIL necesita ser investigado más a fondo. Además, el mecanismo (s) de la interacción entre Apo2L/TRAIL y gemcitabina necesidades que se determinen.

Conclusión

Aunque mucho más trabajo por hacer, especialmente en la evaluación de un mayor número de pacientes los tumores, estos estudios son importantes porque investigar, por primera vez, la respuesta de los tumores de páncreas del paciente, crecido como xenoinjertos en ratones SCID, a Apo2L/TRAIL. Los resultados confirman el trabajo previo realizado con líneas celulares y el apoyo a la idea de que tanto la sensibilidad y la resistencia a la muerte por Apo2L/TRAIL que se ha observado en líneas celulares se verá en los tumores de pacientes. Además, estos pacientes muestran la heterogeneidad de los tumores de respuesta tanto entre los tumores y en el mismo tumor que puede ser predictivo de la variabilidad en un entorno clínico. Es importante destacar que es alentador que la combinación de Apo2L/TRAIL con gemicitabine es capaz de mejorar la eficacia antitumoral y de los resultados significativos en la supresión de tumores que presentan resistencia a una o ambas de estas terapias. Un beneficio potencial que queda por explorar es si la mayor eficacia lograda con la terapia de combinación permitirá a dosis más bajas de quimioterapia y / o Apo2L/TRAIL a utilizar, lo cual reduce las posibilidades de la toxicidad y la resistencia adquirida. Los resultados de este estudio apoyan firmemente el desarrollo ulterior de Apo2L/TRAIL como agente terapéutico para el tratamiento del adenocarcinoma de páncreas.

Agradecimientos

Este trabajo utiliza las instalaciones básicas, en parte, por el apoyo Roswell Park Cancer Institute del Instituto Nacional del Cáncer financiado por la subvención de Apoyo Cancer Center CA 16056. Los autores gracias Jeanne Prendergast y Diane Thompson por su asistencia expertos de laboratorio. También agradecen la valiosa contribución de Nancy Reska, Harry Slocum y el Servicio de Adquisiciones de tejido en RPCI.