Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 12-12 (más artículos en esta revista)

Cu / Zn superóxido dismutasa expresión en el cerebro de rata postnatal después de una lesión excitotoxic

BioMed Central
Hugo Peluffo (hugo.peluffo @ uab.es) [1], Laia Acarin (laia.acarin @ uab.es) [1], Maryam Faiz (maryam.faiz @ uab.es) [1], Bernardo Castellano (bernardo. Castellano@uab.es) [1], Berta González (berta.gonzalez @ uab.es) [1]
[1] Unit of Histology, Department Of Cell Biology, Physiology, and Immunology; Autonomous University of Barcelona, 08193, Spain
[2] Institute of Neuroscience, Autonomous University of Barcelona, 08193, Spain

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Resumen
Antecedentes

En el sistema nervioso, como en otros órganos, Cu / Zn superóxido dismutasa (Cu / Zn SOD) es una enzima clave antioxidante superóxido implicados en la desintoxicación en el metabolismo celular normal de la célula y después de la lesión. Aunque se ha sugerido que el cerebro inmaduro tiene una diferente susceptibilidad a daño oxidativo que cerebro adulto, y la distribución de células específicas de la expresión de esta enzima en el cerebro inmaduro y postnatal después de daño cerebral no ha sido documentada.

Métodos

En este estudio, hemos utilizado la inmunohistoquímica y occidental blot para analizar la expresión de Cu / Zn SOD intacta en el cerebro de ratas inmaduras y en el cerebro de ratas inmaduras tras un NMDA excitotoxic cortical inducida por lesión realizados en el día después del 9. Inmunofluorescencia doble etiquetado se utiliza para identificar Cu / Zn-SOD expresando las poblaciones de células.

Resultados

En intacto cerebro inmaduro, Cu / Zn enzima SOD fue ampliamente expresado en altos niveles en las neuronas se encuentran principalmente en las capas corticales II, III y V, en la sub-placa, en la corteza piriforme, en el hipocampo, y en el hipotálamo. Proteína gliofibrilar ácida de las células positivas sólo mostró Cu / Zn SOD expresión en la neuroglia limitans y dispersas en las células de las paredes del ventrículo. No se detectó expresión en interfascicular oligodendroglia, microglia o de las células endoteliales. Tras excitotoxic daño neuronal Cu / Zn SOD fue rápidamente downregulated (más de 2-4 horas) en el lugar de inyección antes de la neurodegeneración y de señales TUNEL se observaron manchas. Más tarde, a partir del 1 de días después de la lesión en adelante, una upregulation de Cu / Zn SOD se encontró debido a una mayor expresión en astroglia. Un mayor aumento se observó en el 3, 5 y 7 días que correspondían a la inducción de la extensa Cu / Zn SOD muy reactivas en astrocitos y en la cicatriz astroglial.

Conclusión

Mostramos aquí que, en el cerebro inmaduro intacta, la expresión de Cu / Zn SOD se encuentra principalmente en las neuronas. Cuando ocurre el daño, una fuerte y muy rápido downregulation de esta enzima precede a la degeneración neuronal, y es seguido por un upregulation de Cu / Zn SOD en células astroglial.

Antecedentes

Se ha demostrado que el ~ 2-5% de la corriente de electrones en las mitocondrias aisladas cerebro produce radicales anión superóxido (O 2 -.) y peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) [1]. Celular niveles de O 2 -. normalmente son bajos debido a la acción de citosólicas cobre zinc superóxido dismutasa (Cu / Zn SOD) mitocondrial y manganeso superóxido dismutasa (SOD Mn). Estas enzimas catalizar la clave dismutation de O 2 -. de oxígeno y de H 2 O 2 [2]. El aumento de la producción de superóxido y sus derivados pueden provocar lesiones por diversos mecanismos, entre ellos la iniciación de la peroxidación lipídica, la inactivación de las enzimas, el daño al ADN, proteínas y sulfhydryl oxidación. En particular, en presencia de óxido nítrico (NO.), O 2 -. y NO. Reaccionar rápidamente y de manera espontánea para formar el potente oxidante peroxinitrito (ONOO -), que es capaz de nitrating tirosina [3, 4], que contribuye a la Neuropatológicos proceso [5]. En este sentido, los radicales superóxido han sido identificados como importantes mediadores del daño oxidativo durante la isquemia-reperfusión y muchas otras lesiones neurológicas [6]. Isquemia cerebral [7 - 9] y la lesión cerebral traumática [10] causa un rápido y sostenido incremento en la formación de O 2 -., que se aceleró durante disfunción mitocondrial, y también puede ser consecuencia de un aumento de la actividad de varias enzimas citosólicas como fosfolipasa A 2 [11] o la ciclooxigenasa 2 (COX2) [7].

En los adultos, sistema nervioso central (SNC), Cu / Zn SOD es ampliamente expresado en diferentes poblaciones neuronales: las neuronas piramidales del hipocampo CA y las neuronas granulares del giro dentado, las neuronas corticales, especialmente en las células piramidales, las neuronas de la sustancia negra, y en muy Altos niveles en las neuronas motoras de la médula espinal [12 - 17]. En cuanto a las células gliales, en general se supone que microglial oligodendrocitos y las células no muestran expresión de Cu / Zn SOD [12, 16 - 19], pero astroglial la expresión de esta enzima es controvertido. Algunos estudios han encontrado Cu / Zn SOD expresión y sobre todo más intensamente en astrocitos [18, 19], pero una serie de obras no han podido detectar esta expresión en astrocitos [13 - 15, 17], han informado de expresión o sólo en algunos dispersos Astrocitos [12, 16]. Por otra parte, la expresión de Cu / Zn SOD ha sido bien documentado en astrocitos reactivos varios días después de los diferentes tipos de lesión cerebral de adultos, como la isquemia cerebral transitoria [13], kainato tratamiento [14], quinolinic tratamiento [18], o la enfermedad de Alzheimer Y Síndrome de Down [16].

De acuerdo con su función antioxidante, en la mayoría de los modelos de adultos CNS perjuicio de la sobre expresión de Cu / Zn SOD se piensa que es neuroprotector [20 - 22]. De común acuerdo, sintéticas O 2 -. dismuting metalloporphyrins protección contra transitorios oclusión de la arteria cerebral media [23], y con objetivos de supresión de la Cu / Zn SOD SOD extracelular o genes empeora resultado después de la isquemia focal [24, 25]. Sin embargo, los resultados han sido contradictorias con respecto a la toxicidad de O 2 -. después de hipoxia isquémica de la lesión del cerebro inmaduro. Considerando que varias moléculas antioxidantes incluyendo SOD miméticos (como O 2 -. dismuting metalloporphyrins) han demostrado ser neuroprotector [26], un resultado ligeramente empeorado neuropatológicos se observa en ratones transgénicos que expresan un exceso de Cu / Zn SOD [27]. Varias otras diferencias en cuanto a estrés oxidativo y defensas antioxidantes se han notificado en el inmaduros frente a la madurez cerebral. Por ejemplo, y en comparación con el cerebro adulto, en el cerebro inmaduro dañados glutation peroxidasa no es upregulated después de un trauma [28]; libre de hierro se acumula más rápido dentro de las 4 horas después de la isquemia cerebral transitoria estimular reacciones Fenton [29, 30], y metallothioneins , Enzimas antioxidantes potentes que unen metales de transición como Zn, están menos concentrados [31, 32]. Por último, el cerebro postnatal es más sensible que el cerebro adulto a los neurotóxicos acciones de la N-metil-D-aspartato (NMDA) [33], lo que llevará a un aumento de la generación de O 2 -. [34, 35]. Curiosamente, se ha informado de que Cu / Zn SOD es downregulated rápidamente después de varios tipos de lesiones en el SNC maduro [13, 14, 36, 37], pero no hay datos disponibles acerca de este fenómeno en el cerebro inmaduro, en donde en general resultados sugieren un Diferencial escenario de oxígeno y nitrógeno reactivo especies en la evolución de una lesión cerebral [38].

En este contexto, el objetivo de nuestro estudio fue evaluar la dinámica temporal y espacial, y la identidad de Cu / Zn-SOD que expresan las células, en el cerebro de ratas inmaduras intactos, y tras una lesión excitotoxic.

Métodos
Excitotoxic lesiones

Nueve días de edad Long-Evans-negro con capucha crías de ratas de ambos sexos fueron colocados estereotáxica en un marco adaptado para los recién nacidos (Kopf Ubicado) bajo anestesia con isofluorane. El cráneo se abrió utilizando una cuchilla quirúrgica, y el 0,15 μ l de solución salina (0,9% NaCl, pH 7.4), que contiene 18,5 nmol de N-metil-D-aspartato (NMDA) (Sigma, H-3262, Alemania) fueron inyectados En el derecho sensoriomotoras corteza a nivel de la sutura coronal (2 mm lateral de bregma y en 0,5 mm de profundidad). Los controles recibieron una inyección de 0,15 μ l de solución salina vehículo. Después de sutura, las crías fueron colocados en una almohadilla térmica y se mantiene en normotermia por 2 horas antes de ser devueltos a sus madres. Experimental animal trabajo se realizó de acuerdo a la normativa española, de acuerdo con las directrices de la Unión Europea. Este procedimiento experimental fue aprobado por la comisión de ética de la Universidad Autónoma de Barcelona. Se hicieron todos los esfuerzos para reducir al mínimo el sufrimiento de los animales en cada paso.

Estudio inmunocitoquímico

Intactos inmaduros cerebros de P9, P10, P12, P16 y ratas de ambos sexos, donde se utilizan para el análisis de Cu / Zn SOD expresión bajo condiciones fisiológicas (2-4 animales por hora). Por otra parte, a los 2, 4, y 10 horas, y 1, 3, 5 y 7 días después de NMDA (3-4 animales por hora) o de inyección de solución salina (2 animales por hora), las ratas fueron anaesthetized y perfundidos intracardially con paraformaldehido 4% En buffer fosfato 0,1 M (pH 7.4). Cerebros fueron después de los fijos en el mismo fijador por 2 horas y se hunde en un 30% de sacarosa solución antes de ser congelado en seco con el CO 2. Secciones coronales (30 - μ m de espesor) fueron obtenidos en un criostato Leitz. Flotan libremente en las secciones paralelas se trataron con 10% de suero fetal de ternera en Tris-buffer salina (TBS: 0,05 M Trizma base con 150 mM de NaCl, pH 7,4) +1% tritón X-100 durante 1 hora, y se incubaron durante la noche a las 4 ° C con ovejas policlonales anti-Cu/Zn SOD (574597, Calbiochem, Darmstad, Alemania) (1:300) en la misma solución. Después, las secciones fueron lavadas e incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente con Cy3-conjugadas anti-ovejas secundaria de anticuerpos (AP147C, Chemicon, California, EE.UU.) (1:150). Como controles negativos, las secciones fueron incubadas en los medios de comunicación carecen de la primaria de anticuerpos.

Doble etiquetado con marcadores específicos de células

Doble etiquetado se llevó a cabo con el fin de identificar Cu / Zn-SOD células que expresan en las secciones previamente immunoreacted de Cu / Zn SOD como se informó anteriormente.

Por neuronal de identificación, las secciones fueron incubadas con un mayor monoclonal anti-NeuN de anticuerpos (MAB377, Chemicon, California, EE.UU.) (1:1000) y Cy2-conjugadas anti-anticuerpo secundario del ratón (PA-42002, Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) ( 1:1000).

Por astroglial etiquetado, las secciones fueron incubadas con un policlonal de anticuerpos anti-GFAP (Z-0334, Dakopatts, Dinamarca) (1:1800), y se visualiza con inmunoticción Cy2-conjugadas anti-conejo secundaria de anticuerpos (PA-42004, Amersham Pharmacia Biotech , Inglaterra) (1:1000).

Como microglial marcador, secciones fueron procesados por doble tinción con tomate histoquímica de lectinas por incubando con la biotina lectina de Lycopersicon esculentum (tomate) (Sigma, L-9389, Alemania) diluido al 6 μ g / ml, seguida de Cy2-conjugado streptavidina ( PA-42000, Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra) (1:1000).

Selección de las secciones de todas las técnicas de doble etiquetado se incubaron durante 5 min con una 0,00125 μ g / ml de solución de 4, 6-diamino-2-phenylindole (DAPI) en TBS. Doble manchadas secciones se analizaron utilizando una Nikon Eclipse E600 y un microscopio epifluorescence LEICA TCS SP2 AOBS microscopio confocal.

TUNEL etiquetado

Terminal dUTP Nick Fin Etiquetado (TUNEL) tinción para la detección de fragmentación de ADN se realizó en las secciones paralelas montadas sobre portaobjetos. Muestras de tejido fueron lavadas en buffer de Tris (10 mM, pH 8) y EDTA (5 mM) y luego incubadas en el mismo buffer además de proteinasa K (20 μ g / ml) durante 15 min. A temperatura ambiente. Después de varios lavados con EDTA (5 mM), las secciones se incubaron durante 10 min. En TdT buffer (30 mM Tris, 140 mM Cacodilate de sodio, cloruro de cobalto 1 mM, pH 7,7). Las secciones fueron incubadas en TdT buffer más 0,161 unidades / μ l de la enzima TdT (Terminal Transferase, 3333566 Roche, Manheim, Alemania) y 0,0161 nmol / μ l de biotina-16-dUTP (1093070, Roche, Manheim, Alemania) durante 30 min. A 37 ° C. La reacción fue detenido por lavado de las secciones de citrato buffer (300 mM de cloruro de sodio, citrato de sodio 30 mM, 5 mM EDTA). Después de varios lavados con TBS, las secciones fueron incubadas con avidina-peroxidasa (P-0364, Dakopatts, Dinamarca) (1:400) por una hora a temperatura ambiente. Finalmente, el producto fue la reacción peroxidasa visualizado en 100 ml de Tris buffer que contiene 50 mg de 3'-diaminobenzidine y 0,01% de peróxido de hidrógeno.

Western Blot y densitometría

Tres o cuatro NMDA-inyectado y dos intactas y salinas de los animales inyectados para cada tiempo de supervivencia fueron decapitados, y la corteza completa inyecta rápidamente extraídos, picado y congelado en nitrógeno líquido. Las muestras se resuspendió en Tris / HCl (50 mM, pH7.8), EDTA (1 mM), TDT (1 mM), PMSF (100 μ g / ml), pepstatin A (2 μ g / ml), leupeptina (2 μ g / Ml), inhibidor de tripsina (10 μ g / ml), benzamidine (0,2 mM) y presentado a la disociación mecánica. Total concentración de proteínas se midió por el método de ácido bicinchoninic y la igualdad de las cantidades de proteína se ejecutan en un 15% SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Electrotransfered proteína de las muestras a polivinilideno fluoruro (PVDF) membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con TBS +0,3% Tween 20 y 5% de leche, y por 2 horas a temperatura ambiente con ovejas policlonales anti-Cu/Zn SOD (574597 , Calbiochem, Darmstad, Alemania) (1:1000). Membranas fueron lavadas e incubadas en biotina de anticuerpos anti-oveja (1:1000) (RPN-1025, Amersham Pharmacia Biotech, Inglaterra), la avidina-peroxidasa (1:2000) (P0364, Dakopatts, Dinamarca) y, por último, en el sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal West Pico (PIERCE), en combinación con la exposición sobre Hyperfilm ECL (Amersham).

Semi-estimación cuantitativa de la mancha occidental señales de la proteína se realizó mediante la medición de la intensidad con la banda integral analySIS ® software después de barrido de alta resolución.

Análisis estadístico

Todos los resultados se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). ANOVA seguida de Fisher PLSD post-hoc test fue usado para determinar diferencias significativas (p <0,05) después de densitometría mancha occidental.

Resultados
Cu / Zn superóxido dismutasa expresión en el cerebro de ratas inmaduras

Como no se dispone de descripción de Cu / Zn-SOD células expresión específica en el cerebro inmaduro, comenzamos nuestro estudio con esta descripción general. No hay cambios en el patrón de distribución y la identidad celular de Cu / Zn-expresando células son encontradas entre P9 a P16 y, por tanto, se describe en general. El cerebro de ratas inmaduras generalizada mostró inmunoreactividad para Cu / Zn SOD, principalmente ubicados en las neuronas. La más intensa tinción se observó en las neuronas piramidales situadas en las capas corticales V, II y III (Fig. 1A, B], en la corteza piriforme, y en las neuronas piramidales del tubérculo olfatorio. Sub-placa de neuronas, una población de células transitorio situado debajo de la placa cortical [39] también se encontraban entre los más intensos células (Fig 4A]. Además, las neuronas piramidales del hipocampo CA y algunas entre las neuronas (Fig. 1C], así como giro dentado granular y sub-granular neuronas, las neuronas medial septum, hipotálamo y las neuronas también se muestra tinción intensa. También hubo más difusa tinción en muchas otras poblaciones neuronales, como por ejemplo, en diversos núcleos talámico, sustancia negra (Fig. 1D], y el cuerpo estriado. La mayor parte de la inmunoreactividad se observó principalmente en el soma neuronal, aunque menos intensa tinción también estuvo presente en los núcleos, escatima el nucleolo.

No específicos Cu / Zn SOD inmunoreactividad se detectó en el parénquima materia gris GFAP-positivas astrocitos (Fig. 2A]. Sin embargo, la co-expresión de Cu / Zn SOD GFAP y se observó en tanycytes dispersas del tercer ventrículo pared (Fig 2B], en el cuerpo calloso, y en astrocitos que forman la neuroglia limitans (Figura 2C]. La mayoría de las células ciliadas ependymal expresó Cu / Zn SOD (Figura 2B]. Por otra parte, además de la ependymal células descritas anteriormente, la co-localización confocal de estudios con lectina de tomate, que detecta específicamente microglial, así como células de endotelio [40], no se superponen con Cu / Zn SOD tinción (Figura 2D]. N constantemente Cu / Zn-SOD etiquetados células fueron observadas en la materia blanca panfletos, que indicó que en esta ubicación oligodendrocitos no parecen expresar esta enzima.

Por último, Western-Blots mostró un aumento significativo de desarrollo en la cantidad total de cerebro Cu / Zn SOD entre P9 y P16 (Fig. 3B], pone de manifiesto como una única banda de 16 KDa correspondiente a la espera masa molecular de la enzima monómero.

Control intracortical inyección de solución salina local y causó un aumento transitorio de Cu / Zn SOD inmunoreactividad principalmente en neuronas corticales (datos no presentados) 10 horas más tarde en torno a la zona de inyección. Una tendencia a un rápido aumento transitorio y podría también ser observados por Western-Blots (Fig 3B].

Cu / Zn superóxido dismutasa expresión excitotoxic después de la lesión cerebral a los inmaduros

Como se indica anteriormente, la administración intracortical NMDA es un modelo de excitotoxic daños que provoca la rápida muerte neuronal y daño tisular, que se expande rostro-caudalmente e incluye parte de la corteza, cuerpo calloso, el cuerpo estriado dorsal, hipocampo, el septo y rostral [33, 41].

En contraste con solución salina inyectada animales, como se ha observado tanto por las tendencias occidentales blot (Fig. 3] e inmunohistoquímica (Fig. 4, 5] en 2-4 horas después de la inyección de NMDA, el tejido nervioso lesioned mostró una drástica downregulation del total de Cu / Zn SOD inmunoreactividad en las células neuronales, que regresó a los niveles basales 24 horas después de la lesión y posteriormente aumentó significativamente debido a la expresión en las células astroglial. Curiosamente, la primera disminución en neuronal Cu / Zn SOD inmunoreactividad en 2-4 horas (Fig. 4A-B] fue acompañada de una ligera condensación de la cromatina nuclear (Fig. 4C-D] y los cambios en NeuN marcador neuronal (Fig. 4F - G], en la aparente ausencia de signos de degeneración neuronal o la tinción de TUNEL (Fig. 4H]. En otro momento de puntos, de las 10 horas, las neuronas degeneren aún mostró downregulated Cu / Zn SOD inmunoreactividad, pero mostradas condensada núcleos, blebbing nuclear (Fig. 4E], y también se observó la fragmentación del ADN por la tinción de TUNEL (Fig. 4I]. Downregulation de Cu / Zn SOD y signos de degeneración neuronal se observaron de 10 horas en primaria y áreas corticales degenerando a partir del 1 de días posteriores a la lesión secundaria degenerando en regiones como la corteza, el hipocampo y striatal penumbra (Fig. 5A]. Sin embargo, el total de Cu / Zn enzima SOD nivel aumentado de 1 día después de la lesión, alcanzando un máximo de 3-7 días después de la inducción (Fig 3B y 5B], debido a astroglial upregulation de la enzima. Cu / Zn SOD fue inducida en el soma y proximal de las proyecciones de los más hipertrofiados y más intensamente GFA-immunopositive astroglial células degenerativas de toda la zona incluyendo la sustancia blanca (Fig. 5C], pero no en astrocitos activados ligeramente inferior con GFAP inmunoreactividad. Esta elevada expresión siguió a los 5 y 7 días posteriores a la lesión, cuando la mayoría de astrocitos de la zona se vieron fuertemente degenerativas hipertrófica y formaron la cicatriz glial (Fig. 5D]. Sólo reacción microglial células dispersas expresó Cu / Zn SOD en 3 días después de la lesión, pero la mayoría de reacción microglial de las células de parénquima lesioned siguió siendo negativo.

Discusión

En la última década, se ha avanzado con respecto a la compleja evolución de los daños en el cerebro en desarrollo [38] y en qué se diferencia de adultos con lesión cerebral. En este sentido, una de las divergencias que se propone es que el cerebro inmaduro trata mal con el estrés oxidativo. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de la clave de la enzima antioxidante Cu / Zn SOD se encuentra principalmente en las células neuronales. Cuando ocurre el daño, una fuerte neuronal downregulation de esta enzima precede a la vez la muerte de las células neuronales y la posterior Cu / Zn SOD upregulation en astroglial células.

Cu / Zn SOD intacta en el cerebro inmaduro

Es bien sabido que el cerebro total de los niveles de enzimas antioxidantes varía a lo largo de la vida [32, 41, 42]. En consecuencia, el cerebro y la glutatión peroxidasa Mn SOD se informó a aumentar durante el primer mes de vida postnatal de rata, y que siga aumentando ligeramente durante la edad adulta y el envejecimiento [28, 43 - 46]. Catalasa se ha informado a pico alrededor de la primera semana de vida y luego negarse a llegar a una meseta por el primer mes [43, 44]. En relación Cu / Zn SOD, se sabe que su nivel aumente rápidamente después de su nacimiento, en horas pico alrededor de la segunda semana postnatal, de común acuerdo con nuestros estudios mancha occidental. Más tarde, Cu / Zn SOD disminuye un poco para llegar a los niveles de adultos, pero aumenta ligeramente de nuevo en el envejecimiento [42, 44, 45]. Así pues, parece claro que el cerebro de ratas inmaduras tiene un equilibrio diferente de las enzimas antioxidantes, que llegan a la pauta general de los adultos sólo después del primer mes de vida.

Hemos demostrado que, en el cerebro postnatal, la mayoría de Cu / Zn SOD inmunoreactividad se observa en somas neuronales con menos intensa tinción presente en los núcleos, ahorradores de la nucleolos, como se ha informado anteriormente para los animales adultos [12 - 17, 47]. En consecuencia, a pesar de los cambios en Cu / Zn SOD niveles se producen en el desarrollo postnatal, el tipo de células de distribución de esta enzima no cambia. Las neuronas son las células del cerebro con el mayor consumo de oxígeno, constantemente presentado al estrés oxidativo, como se sugiere por O 2 -. mediada la oxidación de hydroethidine [9], o por la presencia de nitrotirosina [48, 49]. En consecuencia, no es sorprendente que los altos niveles de Cu / Zn SOD se observan en un gran número de poblaciones neuronales, específicamente en las grandes neuronas con altos requerimientos energéticos, al igual que las neuronas piramidales, o catecolaminérgicos neuronas que se presentan al elevado estrés oxidativo, debido a Catecholamine metabolismo [50]. Muy recientemente, un sitio para la pro-inflamatorias factor de transcripción NF κ B ha informado de los humanos en Cu / Zn SOD promotor, que puede inducir su expresión [51]. En consecuencia, en el SNC, las neuronas son las principales células que muestran constitutivamente activado NF κ B [52, 53], y su actividad es necesaria para su supervivencia [54]. Además, el otro importante celular superóxido dismutasa, la Mn SOD, es también enriquecido en subgrupos de neuronas [55], aunque diferentes de los enriquecidos en Cu / Zn SOD.

No inmunoreactividad para Cu / Zn SOD se observó en la que expresan GFAP-astrocyte población del tejido nervioso en el cerebro inmaduro, como se ha informado anteriormente para el cerebro adulto [13 - 15, 17, 47], y, a pesar de que astrocitos inmaduros Difieren de los adultos astrocitos. Esta falta de Cu / Zn SOD expresión contrasta con la mayor tolerancia de astrocitos con el estrés oxidativo [48, 56]. En consecuencia, y en comparación con las células neuronales, astrocitos en cultivo se ha demostrado que tienen niveles más elevados de glutatión y de la vitamina E antioxidante lipofílico [57], y que son capaces de sintetizar su propio glutatión de cisteína [58], los mecanismos que probablemente conferir A los astrocitos un elevado estado antioxidante y una mayor resistencia a estrés oxidativo, a pesar de la ausencia de niveles detectables de Cu / Zn SOD. Digno de mención, Cu / Zn SOD inmunoreactividad sólo se encuentra en neuroglia limitans astrocitos y en tanycytes GFAP-positivas, que podrían ser atribuidos al contacto de estas con los astrocitos no CNS moléculas, que también son conocidos para inducir la expresión de marcadores de activación de varios otros Observado anteriormente en estas regiones, como la sobreexpresión GFAP, vimentina o metallothioneins [41]. En cuanto a las células microglial, ni descanso ni ramificado microglia amoeboid microglial células inmaduras encuentran en el cerebro mostró Cu / Zn SOD inmunoreactividad, como se ha demostrado para adultos descanso microglial células [12, 17, 47]. Además, no podemos encontrar en consonancia inmunoreactividad para Cu / Zn SOD oligodendrocitos en la materia blanca del cerebro inmaduro, como se ha descrito en los adultos [12, 17, 47]. La falta de esta enzima podría ayudar a explicar la conocida alta sensibilidad de oligodendrocitos a excitotoxicity y el estrés oxidativo [59], especialmente en el cerebro inmaduro, donde la materia blanca lesión se piensa que es el mecanismo subyacente del daño cerebral [38].

Cu / Zn SOD heridos en el cerebro inmaduro

Después de una lesión excitotoxic al cerebro postnatal, hemos observado una dramática y rápida neuronal downregulation de Cu / Zn SOD NMDA en el sitio de la inyección, que es evidente principios de 2-4 horas después de la inyección en las neuronas que sólo muestran leve y muy temprana de los signos Degeneración y son negativos para la tinción de TUNEL. De hecho, ya hemos demostrado que estas neuronas pantalla, 10 horas después de la inyección de NMDA, de activación de NF κ B upregulation y COX2, lo que sugiere que aún están activas y funcionales [53, 60]. La Cu / Zn SOD downregulation también coincide con nitration neuronal [48] sugiriendo endógeno O 2 -. / peroxinitrito en la formación de estos puntos muy temprana hora en entredicho las neuronas. Aunque a nuestro entender este es el primer estudio que describe la expresión de Cu / Zn SOD después de inmaduros daño cerebral, los estudios sobre el cerebro adulto las lesiones también han demostrado, ya en 4 horas después de la isquemia cerebral transitoria, Cu / Zn SOD inmunoreactividad en el cuerpo estriado y downregulation Corteza [37] y en las neuronas del hipocampo CA región [13]. Además, 24 horas después de la inyección de kainato de hipocampo de rata adulta, Cu / Zn SOD es también downregulated inmunoreactividad en las neuronas de CA, a pesar de la aparente ausencia de la degeneración neuronal en ese momento-punto [14]. En consecuencia, se sabe que la basura superóxido protegerlo de las lesiones en estos primeros puntos temporales [23, 26, 61]. Aunque el mecanismo por el cual se produce esta rápida downregulation no está claro, parece que podría ser mediado por el estrés oxidativo, como PC12 células tratadas con H 2 O 2 con rapidez (después de 4 horas) downregulate Cu / Zn SOD [51]. Curiosamente, la hipotermia, la más potente neuroprotector estrategia conocida, no sólo inhibe la rápida downregulation de Cu / Zn SOD después de una lesión cerebral traumática, pero también induce a la sobre-expresión [36]. La mayoría de sorprender, este efecto es específico para Cu / Zn SOD, y, de hecho, la hipotermia induce un menor importancia upregulation de otras enzimas antioxidantes como la catalasa y la glutatión peroxidasa, en comparación con los no hipotermia cerebral.

Resultados contradictorios se ha informado acerca de la toxicidad de O 2 -. después de hipoxia isquémica de la lesión del cerebro inmaduro. Considerando que empeoró ligeramente neuropatológicos resultado se observó en ratones transgénicos overexpressing Cu / Zn SOD y presentado a grave hipoxia / isquemia [27], incluyendo varias moléculas antioxidantes SOD miméticos como O 2 -. dismuting metalloporphyrins se mostraron como neuroprotectores [26]. Una hipótesis es que Cu / Zn SOD ratones transgénicos producen exceso de H 2 O 2 que en el cerebro inmaduro no se elimina con la upregulation la de la glutatión peroxidasa como ha sido reportado en los animales adultos [28, 62]. Sin embargo, una explicación adicional sería que a medida que el cerebro postnatal expresar aumento de los importes de los receptores NMDA [63], cuya activación conduce a un aumento de la generación de O 2 -. [34, 35], un primer aumento de estrés oxidativo se produciría. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que en el cerebro inmaduro sometido a la isquemia / excitotoxicity, las neuronas en la zona de lesión se presentó muy temprano a un elevado estrés oxidativo, y por tanto, Cu / Zn SOD downregulation contribuye a una mayor amplificación de las células y el daño de células neuronales Muerte.

Aunque Cu / Zn SOD expresión sigue siendo muy baja en las neuronas en peligro, el retorno a los niveles normales de expresión es vista por 24 horas después de la lesión, y un aumento en el nivel total de la enzima se observa más adelante. Esta secundaria Cu / Zn SOD se debe a la inducción upregulation en astrocitos reactivos hipertrófica en el sitio de la lesión. Hemos demostrado en estudios previos que estos astrocitos reactivos pantalla activado NF κ B de las 10 horas después de la lesión excitotoxic [53], que podrían contribuir a la inducción de la Cu / Zn SOD observado aquí. También hemos demostrado que la hipertrófica Cu / Zn-SOD overexpressing astrocitos son muy nitrados, y también mostrar metalotioneína I-II expresión, lo que sugiere una elevada tasa de estrés oxidativo en este grupo particular de células [48]. Nuestros resultados están en el cerebro inmaduro, de conformidad con los estudios de los adultos de los daños cerebrales han demostrado que la inducción de la Cu / Zn y Mn SOD SOD en astrocitos varios días después de la isquemia focal excitotoxicity [37] [14, 18], o en la enfermedad de Alzheimer y Síndrome de Down [16]. Además de las defensas antioxidantes enzimáticos upregulated, astrocitos han demostrado producir sus propios glutatión y también con neuronas cisteína, un tipo de limitación neuronal precursor en la síntesis de glutation [58]. Así, astrocitos parece ser el principal tipo de células aumento de la capacidad antioxidante total en el tejido nervioso después de una lesión, que puede además explicar su elevada resistencia a la muerte celular después de una lesión. En este sentido, los estudios anteriores mostraron que Cu / Zn-SOD overexpressing astrocitos han aumentado la resistencia a daño oxidativo [64] atenuada oxidativo y la inhibición de la captación de glutamato [65], lo que permite un mantenimiento de sus funciones fisiológicas después de una lesión.

En cuanto a las células microglial, es en cierto modo sorprendente que sólo un número reducido de células reactivas ameboides microglial expresar Cu / Zn SOD, y que esto ocurre muy transitoriamente, al igual que en algunas circunstancias activado microglia producen grandes cantidades de radicales de oxígeno después de una lesión incluida de O 2 -- . [66].

Creemos que los resultados presentados aquí de relieve la importancia de las células in vivo de los estudios de localización de antioxidantes, como algunas de las especies reactivas de O 2 -. como no difusa a través de las membranas celulares y, por tanto, lo más probable reaccionar dentro de la celda donde se formó .

Conclusión

En conclusión, nos muestran que en el cerebro de ratas inmaduras intacta durante la ventana de plasticidad, Cu / Zn SOD es expresada principalmente en las neuronas, aunque también es expresado en el sistema nervioso central como la neuroglia fronteras limitans o la ependymal células. Además, nos muestran que el cerebro Cu / Zn SOD expresión niveles varían excitotoxic después de una lesión: es rápido downregulated en las neuronas, las neuronas que hacen que el afectado aún más susceptible a daño oxidativo, y más tarde es muy hipertrófica upregulated en astrocitos. Por lo tanto, como no ha habido cambios en la especificidad de células se encuentran en la inmaduros versus el cerebro adulto, más estudios serían necesarios para dilucidar los mecanismos que subyacen a la susceptibilidad a diferentes daño oxidativo en estos dos paradigmas lesión.

Lista de abreviaturas

SOD: superóxido dismutasa; O 2 -.: superóxido; H 2 O 2: peróxido de hidrógeno; NO.: Óxido nítrico; COX: ciclooxigenasa; SNC: sistema nervioso central; NF κ B: factor nuclear kappa B; NMDA: N-metil-D - Aspartato; TUNEL: terminal dUTP nick final etiquetado; DAPI: 4, 6-diamino-2-phenylindole; GFA: fibrilary la proteína ácida glial.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

HP lleva a cabo parte de las lesiones cerebrales y de los animales de trabajo, realizó la mayor parte de la inmunohistoquímica y estudios mancha occidental, concibió y redactó el estudio del manuscrito. LA llevado a cabo parte de las lesiones cerebrales y de los animales de trabajo, participó en el diseño del estudio y ayudó a redactar el manuscrito. MF lleva a cabo parte de la inmunohistoquímica y ayudó a redactar el manuscrito. BC BG y bajo la coordinación y supervisión del desarrollo del estudio, fueron los responsables de este proyecto de dar apoyo económico y ayudó en la última versión del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a MA Martil por su excelente ayuda técnica. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación (DGES BFI2002-02079) y "la Caixa" 00/074-00. HP es actualmente un becario FI de la Generalitat de Catalunya (AGAUR).