Journal of Nanobiotechnology, 2005; 3: 4-4 (más artículos en esta revista)

Estabilidad de frecuencia de las palizas en los miocitos cardíacos por su comunidad medida por efecto de agarosa microchamber chip

BioMed Central
Kensuke Kojima (kojima_kensuke@bpx.cu-tokyo.ac.jp) [1], Tomoyuki Kaneko (ckaneko@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp) [1], Kenji Yasuda (cyasuda@mail.ecc.u - Tokyo.ac.jp) [1]
[1] Departamento de Ciencias de la vida, la escuela de Posgrado de Artes y Ciencias de la Universidad de Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro, Tokio 153-8902, Japón

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Resumen

Para comprender la contribución de la comunidad efecto en la estabilidad de los golpes myocyte frecuencia cardíaca en grupos de células, la formación de redes de paso de las células como la reconstructiva utilizando el enfoque on-chip de agarosa microchamber células microcultivation sistema con foto-térmica grabado método se aplicó. En el sistema, las formas de agarosa microestructuras se cambiaron paso a paso con foto-térmica grabado de agarosa-de la capa utilizando un chip 1064-nm centrado rayo láser infrarrojo para aumentar la interacción de las células cardíacas myocyte durante el cultivo. En primer lugar, cada rata cardíaca myocyte en cada microestructura se cultivaron bajo condición aislada, y luego conectado uno por uno a través de nueva creación microcanales en foto-térmica grabado para comparar la contribución de la comunidad para el tamaño de la magnitud de golpear a la estabilidad de los grupos de células. A pesar de que el individuo aislado células tienen un 50% de fluctuación de la frecuencia de las palizas, el aumento de su estabilidad como el número de células conectadas aumentado. Y, por último, cuando el número llegó a ocho células, que se estabilizó en torno al 10% de fluctuación, que es la misma magnitud de la modelo de tejido se cultiva en el plato. El resultado indica la importancia de la comunidad tamaño de las células para estabilizar su rendimiento para que la célula-modelo de red para el uso de células para la vigilancia de sus funciones al igual que el modelo de tejido.

Introducción

Desarrollo de la célula de base fiable de ensayo es importante para la alta velocidad, bajo costo de detección de drogas. Sin embargo, el método convencional utilizando células son todavía inestables y, por tanto, aún están en juicio para hacer modelos confiables de células que muestran el mismo grado de fiabilidad como de tejidos y de órganos modelos. Como corazón es uno de los órganos más importantes de la toxicología en la detección de drogas, las propiedades de las células del corazón y se examinan informó arduamente. Por ejemplo, se ha informado de que una paliza de células pueden influir en la tasa de un vecino con el que hace el contacto, y que un grupo de células en el corazón de la cultura, la paliza sincrónicamente con un ritmo rápido, puede actuar como marcapasos para una celda contigua hoja De los anteriores estudios de cultivo de tejidos de células cardíacas myocyte [1]. A pesar de que estos ex resultados predijo que la importancia de una rápida paliza región de tejido actúa como marcapasos de un lento y examinó la forma en que el proceso de sincronización de dos golpes aislados miocitos cardíacos [2] y que la importancia de la comunicación de cada células en la celda - Red, el tamaño de la comunidad efecto no se puede medir con éxito utilizando el método convencional de cultivo en la cultura plato plato. Como medio para alcanzar el arreglo espacial de los miocitos cardíacos, incluso durante el cultivo, hemos desarrollado una nueva célula única-método basado en el cultivo y la utilización de un sistema de agarosa microestructuras, sobre la base de 1064-nm foto-térmica grabado [3 - 5]. El uso de este sistema, que mide el tiempo de proceso de sincronización de dos golpes adyacentes cardíaca myocyte células conectadas por 2 - μ m de ancho de vías, y encontró la sincronización de las dos células se produjo 90 minutos después de su primer contacto físico [6, 7].

En este trabajo se reporta el efecto tamaño de la red celular (efecto de la comunidad) para la estabilización de sus golpes utilizando el método de nuestro on-chip único basado en el cultivo de células de ensayo con la modificación gradual de las estructuras micorcultivation cámara durante el cultivo.

Resultados

El esquema de la sobre-chip único basado en el cultivo de células de ensayo se ilustra en la Figura 1. Nuestro sistema consta de tres partes: control de temperatura en el cultivo de células, en el que solo los miocitos cardíacos están dispuestos en cada microchambers de cultivo de células de agarosa chip; foto-térmica grabado sistema de fabricar tanto el microchambers y microcanales de una fusión por portar una de las 5 - Μ m de espesor de la capa de agarosa de calefacción de un terreno de 1.064 nm rayo láser infrarrojo centrado, y adquirir la imagen y sistema de análisis. Figura 2 se resume el diseño de chips y el procedimiento de cultivo de células en el chip. En este ejemplo, organizó nueve 30 - μ m de diámetro microchambers en el chip y la adyacente cámaras están conectadas por los microcanales, que se fabricó durante el cultivo de la foto-térmica grabado. Como el 1064-nm rayo láser no es absorbido por el agua o bien de agarosa, que se derrite una porción de la agarosa sobre la fina capa de cromo, puesto que sólo la capa de cromo absorbe el haz. El uso de este grabado sin contacto, se puede hacer fácilmente microestructuras como agujeros y canales dentro de tan sólo unos minutos sin utilizar ningún proceso de fundición de moldeo. La fusión de agarosa por láser ocurrió de la siguiente manera (ver Figura 2]. Nos hemos centrado el 1064-nm rayo láser infrarrojo sobre la capa de agar en el portaobjetos de vidrio, para que se funda la agarosa en el centro de coordinación y en la vía de la luz hasta la forma del agujero formado por células (figura 2a]. Cuando el haz se trasladó centró en paralelo a la superficie de chips, una porción de agarosa todo el punto focal del láser derretido y difundido en el agua (figura 2b]. Después de la acalorada terreno había sido trasladado, se ha creado un canal en la parte inferior de la capa de agar que conecta las dos agujeros adyacentes (figura 2c]. Un microscopio de observación confirmó que se había producido la fusión, y luego o bien la calefacción se continuó hasta el lugar alcanzado el tamaño deseado, o la calefacción posición fue trasladado a lograr la forma deseada. Individual miocitos cardíacos se cultivan en cada agujero de la agarosa microchambers en el chip, como se muestra en la Figura 2d. En nuestro método hemos añadido micro canales, uno por uno, para conectar en los miocitos cardíacos vecinos adyacentes microchambers durante su cultivo. Para mejorar la fijación de las células de la parte inferior de la microchambers, colágeno de tipo I (Nitta gelatina, Osaka, Japón) se ha revestido de la capa de cromo el chip antes de recubrimiento de la capa de agar (Figura 3].

Un micrograph en la figura 4 se muestra las nueve células aisladas cultivadas en la sala nueve de agarosa microcultivation chip (24 h tras el inicio del cultivo) y dos aisladas, independientemente golpear a los miocitos cardíacos entre en contacto a través del microcanal. Durante el cultivo, la frecuencia de cambio de la paliza de la celda indicada por la flecha se observaron continuamente.

El tiempo de cambiar el corazón golpes causados por la formación gradual de red adicionales, como se muestra en la Figura 5. La frecuencia de aislados sola célula cardíaca myocyte la paliza fue fluctuó entre el valor medio (2,1 Hz, véase la figura 5a]. Los golpes de las dos células de la red (Figura 5b], en la que uno de los dos miocitos cardíacos fue el mismo que se muestra en la Figura 5a. Esta red de células de dos mostró mucho más estabilizado la paliza que la condición de aislado. Además, hemos añadido más canales a los dos por encima de la red celular para formar las células de nueve modelo de red. Como se muestra en el gráfico en la figura 5c, de nueve células de la red, casi la constante frecuencia de las palizas. El resultado de los nueve conjuntos de diferentes muestras (una de las cinco series se muestra en la Figura 5] se resume en la figura 6. Como se muestra en el gráfico, la fluctuación de los golpes de frecuencia se redujo de acuerdo a la red adicionales myocyte formación de las células cardíacas. En otras palabras, el aumento del tamaño de la red mejora la estabilidad de la frecuencia de las palizas. Cabe señalar que la magnitud de las fluctuaciones de la red de nueve de células fue de alrededor del 10%, que es el mismo valor del cultivo de tejidos muestra de la misma muestra en la placa de cultivo (datos no presentados). Por otra parte, creemos que confirmó que la gradual formación de los canales adicionales durante el cultivo en foto-térmica grabado no perjudicase su capacidad de golpear a la misma que acaba de gradual formación de la red neuronal que hemos informado en anteriores documentos [5, 8].

Debido a los resultados obtenidos indican dos hechos. En primer lugar, de la única célula basada en la investigación de células-como el modelo de red, la consideración de la comunidad el tamaño de la célula del grupo es importante para la adquisición de los fiable, estable datos. En segundo lugar, el tamaño de la comunidad, necesaria para la medición del tejido como modelo no es tan grande, es decir, nueve celdas fueron suficientes en este caso. Eso podría significar que los menores que lo esperado del número de células es necesaria para obtener el mismo efecto que la comunidad en el modelo de tejido. Y, por lo tanto, el potencial para la creación de células individuales basadas en células, podría ser el modelo de red para la práctica de ensayo fiable de detección de drogas en especial para el modelo de órganos humanos. Por otra parte, cabe señalar que hemos tenido éxito en la separación de dos de los factores que afectan a la sincronización de golpes en este sistema, la brecha de la salida de la conexión física y estiramiento. En otras palabras, con este sistema se puede medir el efecto de la brecha de la salida de las conexiones de sincronización con claridad. Si no hemos podido eliminar el efecto de estiramiento físico causado por el contacto físico de las células vecinas, tenemos dificultades de aclarar el efecto de los productos químicos para inhibir la brecha de la salida de las conexiones. Debido a que el grupo de células sincronizan por su estado físico se extiende incluso después de la salida brecha se inhibió (datos no presentados). Desde este punto de vista, nuestro sistema podría ser más beneficiosa en la detección de drogas.

En conclusión, se aplicó el 1064-nm foto-térmica método de grabado y realizado en el chip de agarosa única célula microcultivation sistema utilizado para generar cardíaca myocyte redes de diferente tamaño, que es importante para la comprensión de la comunidad efecto de la sincronización ritmo. Utilizando el sistema, que por primera vez observó las diferencias en el proceso de sincronización de las células cardíacas myocyte y su dependencia de la comunidad de tamaño. Este sistema puede ser utilizado en la biológicos / médicos campos para cultivar la próxima generación de redes de los distintos cultivos celulares y la medición de sus propiedades.

Materiales y Métodos

Miocitos del ventrículo fueron aisladas de 1 - a 3 días de edad neonatal ratas Wistar, tal como se describe anteriormente [6, 7]. Corazones fueron extirpados de ratas anaesthetized con éter etílico y trasladado a buffer fosfato salino (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7.4) que contenía 0,9 mM CaCl2 y 0,5 mM MgCl2. Ventrículos después de que se separaron y picada en pequeños fragmentos. Fragmentos de tejido fueron incubando más disociarse por ellos dos veces con PBS que contenía 0,25% colagenasa (Wako, Osaka, Japón) durante 30 minutos a 37 ° C. Las células en suspensión fueron transferidos a un medio de cultivo celular (MEDM [Invitrogen Corp, Carlsbad, CA EE.UU.] suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml penicilina, y 100 μ g / ml estreptomicina) a 4 ° C. Las células fueron filtradas a través de un 40 - μ m de malla de nylon y fueron centrifugadas a 180 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El pellet de células se volvió a suspender en una HEPES buffer (20 mM HEPES, 110 mM NaCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM de glucosa, 5 mM KCl, y 1 mM MgSO 4, pH 7,4). Los miocitos cardíacos presentes en la suspensión fueron separados de otras células (es decir, los fibroblastos y las células endoteliales) por el método de centrifugación de densidad. La suspensión celular fue capas en 40,5% Percoll (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) diluido en el HEPES buffer, que previamente había sido capas de 58,5% Percoll diluido en el buffer. La suspensión celular fue después se centrifuga a 2200 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Miocitos cardíacos fueron recuperados de la interfaz del 40,5% y 58,5% Percoll concentraciones. Obtenido células fueron luego re-suspendidas en el medio de cultivo celular. El 5 - μ l de la suspensión, que se ha diluido para alcanzar una concentración final de 3,0 × 10 5 células / ml, se chapada en el chip y cada cardíaca myocyte fue recogido por un micropipette y manualmente en cada microchamber introducido en el chip. A continuación, se incubaron en un cultivo de células, microscopio sistema a 37 ° C en un ambiente humidificado de 95% de aire y 5% de CO 2. Cabe señalar que, debido a que el microchamber laterales se hicieron de agarosa, las células no pueden fácilmente pasar más de las cámaras. Un contraste de fase microscopio fue utilizado tanto para medir el ritmo de contracción (es decir, golpes de frecuencia) de los miocitos cardíacos, y para registrar la forma de la célula de red en microchambers.

El ritmo de contracción espontánea cultivadas miocitos cardíacos fue evaluada por un video-método de registro de imagen. Imágenes de golpear a los miocitos cardíacos se registraron con una cámara CCD a través de la utilización de un microscopio de contraste de fases. El tamaño (área de sección transversal de la célula) de los miocitos cardíacos, que ha cambiado considerablemente con la contracción, también fueron analizados y registrados cada 1 / 30 s por un ordenador personal con una placa de captura de vídeo y las estimaciones de sus golpes fenómeno por el cambio de su cruz Zona de sección tamaños [6, 7].

Contribuciones de los autores

KK y de los conocimientos tradicionales microchamber llevó a cabo el diseño, la preparación de células, de un solo cultivo de células y de observación, de análisis de imágenes. Fueron igualmente contribuyó a este artículo. KY concebido del estudio, y participaron en su diseño y coordinación. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.