Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 20-20 (más artículos en esta revista)

Evaluación simultánea de las respuestas de linfocitos T citotóxicos contra múltiples infecciones virales por el uso combinado de óptima epítopo matrices, anti-CD3 mAb células T expansión y "RecycleSpot"

BioMed Central
Florian K Bihl (fbihl@partners.org) [1], Elisabetta Loggi (epalab@med.unibo.it) [3], John Chisholm V (jchisholmiii@partners.org) [1], Hannah S Hewitt (hshewitt socios @ . Org) [1], Leah M Henry (lmhenry@partners.org) [1], Caitlyn Linde (clinde1@partners.org) [1], Todd J Suscovich (tsuscovich@partners.org) [1], T Johnson Wong (jwong1@partners.org) [2], Nicole Frahm (nfrahm@partners.org) [1], Pietro Andreone (andreone@med.unibo.it) [3], Christian Brander (brander@helix.mgh.harvard . Edu) [1]
[1] Centro de Investigación Asociados SIDA, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, EE.UU.
[2] Departamento de Patología, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, EE.UU.
[3] Dipartimento di Cardioangiologia ed Epatologia, Ospedale S. Orsola-Malpighi, Università degli Studi di Bologna, Italia

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen

La evaluación de celular inmunidad anti-viral a menudo se ve obstaculizada por la limitada disponibilidad de muestras adecuadas, sobre todo al intentar simultáneamente, de alta resolución de determinación de las respuestas de células T contra múltiples infecciones virales. Así, el desarrollo de sistemas de ensayo, que optimice el uso de células, al tiempo que permite una determinación detallada de la amplitud y magnitud de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) respuestas, se necesita con urgencia. Este estudio ofrece una actualizada lista de los actualmente conocidos, bien definidos CTL epítopos virales para el VIH, EBV, CMV, VHB y VHC y describe un enfoque que supera algunas de las limitaciones anteriores mediante el uso de matrices de péptido de forma óptima se define CTL epítopos virales en combinación con anti-CD3 in vitro de células T de expansión y re-utilización de las células de las consecuencias negativas para ELISpot pozos. Los datos muestran que, en comparación con directa ex vivo de células preparativos, antígeno-inespecíficos in vitro de células T expansión mantiene la amplitud de las respuestas de células T detectables y demuestra que la recolección de las células negativas ELISpot pozos de reutilización en ensayos posteriores ELISpot (RecycleSpot) , Además aprovechar al máximo el empleo de las células. Además, cuando la combinación de células T RecycleSpot expansión y con el uso racional de péptido diseñado matrices, la inmunidad antiviral contra más de 400 diferentes epítopos CTL de cinco diferentes virus puede ser evaluado y reproducen de muestras de menos de 10 mililitros de sangre sin comprometer información sobre la amplitud y Magnitud de estas respuestas. En conjunto, estos datos apoyan un enfoque que facilita la evaluación de la inmunidad celular contra múltiples co-infecciones virales en entornos en los que muestra la disponibilidad es muy limitada.

Introducción

Inmunidad celular se considera fundamental para la prevención y el control de muchas infecciones virales [1 - 6]. Los enfoques desarrollados para detectar estas respuestas in vitro han evolucionado a lo largo de los años y han proporcionado información cuantitativa y cualitativa sobre el virus de las células T específicas para una serie de infecciones virales. Estos ensayos incluyen, además de otros, utilizando linfoproliferativos ensayos de 3 H-timidina incorporación CFSE o tinción, la limitación de la dilución de la frecuencia ensayos de precursores para la enumeración de los precursores CTL frecuencias, la tinción intracelular de citoquinas (ICS) y la enzima-ligado immunospot (ELISpot) ensayos [7 -- 10]. A pesar de que estos ensayos difieren en sus requisitos mínimos de células, las detalladas, análisis simultáneo de la inmunidad anti-viral contra múltiples infecciones virales es a menudo limitada por la disponibilidad de células, independientemente de que el ensayo empleados.

El ensayo se ha convertido en ELISpot ampliamente utilizado para evaluar rápidamente la respuesta inmune celular a la amplia cantidad de antígenos mientras utiliza relativamente pocas células. Una serie de estudios también han aplicado el péptido matriz enfoques, en el que cada péptido antigénico se prueba en dos péptido piscinas, para que las respuestas reactivas a las piscinas de compartir un péptido específico puede ayudar a identificar los objetivos péptido [9, 11]. Esto ha reducido el número de células necesarias significativamente, de manera que por ejemplo el VIH-respuestas concretas puede, en general, ampliamente evaluado utilizando menos de 15 × l0 6 células [9]. Sin embargo, a pesar de tales avances, la enumeración simultánea de la inmunidad específica para el virus a múltiples infecciones virales todavía supera el tamaño de la muestra necesaria que habitualmente pueden ser obtenidos. Tamaño de la muestra puede no ser de gran preocupación en la evaluación de la respuesta inmune mediada por CTL contra el único, pequeño genoma de los virus como el VIH y el VHC, que puede ser probado de manera exhaustiva usando la superposición de péptido conjuntos que abarcan todo el genoma viral expresado [9, 12]. Sin embargo, estos planteamientos globales no son viables para los virus más grandes, como el basado en el ADN herpesviruses como EBV, CMV y HVSK [4, 13]. En lugar de ello, los análisis inmunológico necesidad, ya sea que se limita a un número determinado de proteínas virales específicas, o para el uso de la definida anteriormente, óptimo epítopos CTL. Las respuestas en contra de tal forma óptima definida epítopos pueden representar una parte significativa del total de virus específicos de la respuesta inmune, sobre todo cuando representan inmuno-epítopos que abarcan los más inmunogénico de las proteínas específicas de los genomas virales. Para bien estudiados los virus como el VIH, VHC, CMV y VEB, los grandes conjuntos de tal forma óptima definida epítopos CTL, de común Restringido alelos HLA, se han descrito en el pasado [14 - 17], y proporcionar una valiosa alternativa a la medida de patógenos CTL específicos de las respuestas sin la necesidad de sintetizar la amplia péptido conjuntos que abarcan todo el genoma viral.

En el presente trabajo se describe un algoritmo por el que se definen las matrices de forma óptima CTL epítopos derivados de cinco humanos infecciones virales se utilizan en la misma ELISpot ensayo. Como no todos los pozos de la placa ELISpot contienen antígenos a los cuales la prueba PBMCs responderá, constantemente hay algunos pozos con células que no han sido estimuladas durante este primer ensayo. En teoría, estas células podrían ser recuperados de la placa ELISpot antes de desarrollar y volver a utilizar en los análisis posteriores. De hecho, otros han sugerido el uso de "reciclado" de ADN de las células de aislamiento [18], sin embargo, a nuestro conocimiento, no existen datos acerca de la reutilización de estas células en ensayos funcionales. Desde el péptido matriz enfoque está idealmente seguida de la posterior confirmación de la única orientada péptidos presentes en dos correspondientes péptido piscinas, reciclado de células no ELISpot pozos podría ser utilizado para estos ensayos. A pesar de que este segundo paso se podría lograr mediante ampliación de las células in vitro, por ejemplo, anti-CD3 anticuerpo monoclonal (mAb) de estimulación, la ampliación de las células pueden perder algunas de las respuestas frente directamente a las células ex vivo a prueba [19, 20]. Además, la magnitud relativa y absoluta de las respuestas puede ser distorsionado durante la expansión de células y ensayos sólo se puede ejecutar después de un prolongado cultivo in vitro [21, 22] Por lo tanto, siempre y cuando la funcionalidad de las células reciclados en ensayos de secundaria se puede garantizar, pueden Proporcionar una forma sencilla de completar ELISpot proyecciones iniciales, dando información fiable sobre la magnitud de las respuestas CTL específicos. La viabilidad de este enfoque se puso a prueba y se demostró que el uso combinado de óptima epítopo matrices, in vitro de células T expansión y RecycleSpot inmune pueden proporcionar datos pertinentes sobre múltiples infecciones virales, incluso cuando la disponibilidad de células es muy limitada.

Materiales y métodos
Aislamiento de PMBCs frescos de sangre total

Toda la sangre se recogió mediante citrato de tubos Vacutainer (BD, Franklin Lakes, NJ) y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron por Histopaque (Histopaque ® 1077, Sigma, St Louis, MO), tal como se describe centrifugación de densidad [9]. Fresh PBMC o bien fueron utilizados directamente después de aislamiento, después de la expansión in vitro o después de la congelación y descongelación con y sin ulterior expansión in vitro. Para uso in vitro, las células fueron re-suspendido en medio R10 (RPMI 1640 containg 10% FCS inactivado por calor (Sigma), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, 50 μ g / ml streptomucin y 10 mM HEPES (todos Mediatech, Hemdon, VA)) en una concentración de 1 × 10 6 células / ml. Las células fueron descongelados utilizando R10 soporte de 50 U / ml DNAse (Deoxyribnuclease I, libre de RNasa, Sigma), lavar dos veces en el mismo medio, de nuevo suspendida en el R10 y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 por 3-4 Horas antes de que fueran contados y re-suspendido en el R10 en 1 × 10 6 células / ml. El descongelado células fueron entonces utilizados, ya sea directamente o en ensayos de ELISpot ampliado.

Para la expansión in vitro, del 1 al 5 × 10 6 PBMC se añadieron a la cultura frascos de 25 ml en 10 ml R10 complementado con 1 μ l de la anti-CD3 anticuerpo monoclonal específico (mAb) 12F6 [23]. Las células fueron alimentados dos veces por semana usando R10 complementado con 50 U / ml recombinante de Interleukina 2 (IL-2) durante 2 semanas. Antes de su utilización en ensayos de ELISpot, las células fueron lavadas dos veces en medio R10 noche a la mañana y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 en ausencia de IL-2. Esta noche a la mañana hambrientos paso era necesario para eliminar el fondo en el subseqnet ELISpot ensayo, que es, en nuestras manos, no un problema, independientemente de cuánto tiempo el cultivo in vitro se ha mantenido.

Diseño óptimo de péptido matriz

Un total de 416 epítopos óptimo de los cinco virus diferentes se reunieron en 98 diferentes péptidos utilizados en piscinas y 5 matrices de cada péptido que contiene péptidos de un solo virus. El número de piscinas y el número total de péptidos que figura en cada una específica para el virus péptido matriz se resumen en la Tabla 1. Cada péptido estuvo presente en una concentración final de 200 μ g / ml en el péptido piscinas. Listas detalladas de todos los epítopos óptima incluidos en este estudio, junto con su secuencia y HLA restricción, se indican en los cuadros 2 a 6.

ELISpot ensayo

96-así polivinilideno placas (Millipore, Bedford, MA), la validez de la noche a la mañana revestido con 2 μ g / ml de anti-interferón gamma (IFN-γ) mAb 1-D1K (Mabtech, Estocolmo, Suecia), se lavaron con seis veces estériles Buffer fosfato salino (DPBS, no Ca y Mg, Mediatech) con 1% de suero fetal ternera (FCS) antes de su uso. Después del lavado, de 30 μ l R10 se añadieron a cada pocillo para evitar la desecación de la membrana, y 100000 a 200,00 células por así se agregaron en 100 μ l R10. 100,00 células / así se utilizaron para detectar respuestas al VIH, CMV y VEB, en tanto que las respuestas a VHC y VHB se sometieron a pruebas de 200000 células /. Cada péptido se añadió a una concentración final de 14 μ g / ml (ambos péptidos único, así como las piscinas). Como control negativo, las células fueron incubadas en el medio por sí solas, y PHA se añadió a una concentración de 1,8 μ g / ml para servir como un control positivo. Las placas fueron incubadas durante 16 horas a 37 ° C con 5% de CO 2 antes de ser desarrollado. Después de seis veces el lavado con PBS, 100 μ l de biotina anti-IFN-γ mAB 7-B6-1 (0,5 μ g / ml, Mabtech) y se agregaron placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las placas se lavaron nuevamente y se incubaron con una dilución de 1:2000 junto streptavidina-fosfatasa alcalina (ALP-Estreptovidina-PQ Mabtech) por 1 hora a RT en la oscuridad. Después de lavar los platos una vez más, la producción de IFN-γ se detectó como manchas oscuras después de un corto de incubación de 10-20 minutos con nitroblue tetrazolium y 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indolyl (BioRad, Hercules, CA). La reacción de color fue detenido por lavado de los platos con agua del grifo y las placas fueron secadas al aire antes de contar utilizando un AYUDAS ELISPOT Reader Dependencia (Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Alemania). Los resultados se expresaron como lugar la formación de las células (SFC) por millón de células de entrada. Los umbrales de respuestas positivas fueron determinados como cualquiera de 5 puntos (50 SFC/10 6 celdas de entrada) o como la media más 3 desviaciones estándar de los pozos de control negativo, el que fue superior.

RecycleSpot

Después de incubación de la noche a la mañana en una de las principales ELISpot ensayo, las células de todos los pozos de la placa ELISpot fueron trasladados a una ronda de 96 pozos de bandeja inferior y se incuba a 37 ° C con 5% de CO2 al tiempo que se desarrolla el ELISpot ensayo. Células de los pozos sin ningún tipo de manchas (incluida la negativa de control de los pozos) se agruparon entonces, y contó utilizado para los ensayos de secundaria ELISpot. En el control de los experimentos, las casillas correspondientes a los pozos con respuestas positivas también fueron agrupados, lavada ampliamente (> 5 veces) y volver a utilizarse en el posterior, secundaria ELISpot ensayos también. Células de los pozos de control positivo (PHA estimulado) no se utilizaron para posteriores ensayos.

Resultados
Diseño de la matriz óptima epítopo durante cinco infecciones virales

A la vez prueba de las respuestas CTL contra cinco virus diferentes con un número limitado de PBMCs, un péptido matriz enfoque que se utilizó incluyeron todos los publicados anteriormente, bien definidos epítopos CTL en el VIH, VHC, VHB, CMV y VEB. El número total de epítopes CTL descritas para estos virus varía de 37 epítopes óptimo descrito en el VHB a más de 170 en óptimas epítopos del VIH. Una lista de todos los epítopos óptimo incluido en el presente estudio se da en los cuadros 2 al 6, con un total de 416 bien definidos, HLA clase I-Restringido epítopos CTL. La incluido el VIH epítopos se deriva de la lista actualizada anualmente CTL epítopos del VIH en el Laboratorio Nacional de Los Álamos VIH inmunología base de datos [24]. Para todos los demás agentes patógenos, los epítopos se enumeran aquellos para los que, a lo mejor de nuestros conocimientos, por lo menos una publicación que muestra existen en contra de esta actividad CTL epítopo en por lo menos una persona infectada. Si bien el óptimo epítopos del VIH, VHC y VHB cubrir grandes partes de sus respectivos genomas virales, la epítopos define en el CMV y VEB representan sólo una parte de las proteínas expresadas por estos virus. En vista de los aproximadamente 100 marcos de lectura abierta en el genoma de estas grandes-virus, la representación completa de todas las proteínas víricas difícilmente puede lograrse y la mayoría de los estudios sobre estos patógenos han concentrado en un número relativamente pequeño de las proteínas virales, en especial las que contienen la concentración en los factores determinantes y serológicos Aquellos caracterizados por la expresión de genes virales específicos de los patrones de uso. Así, se describe CMV y VEB codificada epítopos CTL se derivan de once y cuatro diferentes proteínas virales, respectivamente, mientras que el conocido VIH, VHC y VHB epítopos cubrir todas las proteínas virales en el genoma de estos pequeños agentes patógenos.

Como el número de epítopes CTL descrito óptima varía entre los agentes patógenos, aparte péptido matrices se han diseñado para cada virus (Tabla 1]. Es importante destacar que el primer conjunto de piscinas ( "proteínas piscinas") fue diseñado para que las piscinas que figuran todos los epítopos derivados de la misma proteína viral, mientras que la segunda mitad de la matriz que figura el péptido piscinas epítopos de forma no específica composición de proteínas ( "Piscinas de azar"). Este diseño de la matriz permite la evaluación de la respuesta inmune específica del virus en los diferentes niveles de resolución incluida i) una "total virus" respuesta específica sumando todas las proteínas específicas de la piscina o al azar péptido piscina respuestas específicas, ii) una "proteína" específicas Centrando la atención en las respuestas piscinas único que contiene todos los epítopos de una determinada proteína, y iii) a solo péptido confirmación, en un solo epítopo nivel, mediante la comparación de las respuestas en las piscinas que contienen el mismo epitopo. Juntos, el epítopo diseño de la matriz facilitará la evaluación de las respuestas de células T con más de 400 epítopos CTL de cinco virus diferentes al mismo tiempo, utilizando menos de 10 × 10 6 PBMCs mismo tiempo la posibilidad de determinación de la amplitud y magnitud de virus, proteínas, y epítopo - Respuestas específicas para cada virus por separado.

Además, como cada epítopo es probado dos veces en diferentes piscinas, que debería reflejar la misma magnitud de la respuesta en cada grupo, por lo tanto, el método de la matriz proporciona su propio control interno. Además, la "proteína de las piscinas" y "aleatorios piscinas" teóricamente debería rendimiento total de la misma magnitud de las respuestas, ya que, en su conjunto, contienen el mismo conjunto de péptidos. Para probar esto, y descartar la posibilidad de que péptido composiciones en las diferentes piscinas interferido con la detección de respuestas concretas, la magnitud de todos los "pool de proteínas" y "aleatorios piscina" respuestas concretas se compararon en 19 sujetos infectados por el VEB ( N = 19) y co-infectados con el CMV (n = 14), el VIH (12), y el VHC (9). Estos análisis mostraron una correlación estadísticamente muy significativa entre el total de magnitudes de las respuestas detectado por alguno de los conjuntos de piscinas péptido, lo que indica que el péptido mezclas en las piscinas de compartir una respuesta concreta no inciden significativamente en la detección de la orientados epítopo (Figura 1]. De la nota, de los cuatro virus analizados, el "azar piscinas" detectado un ligero aumento, no significativo estadísticamente total de la respuesta específica para el virus de la "proteína de piscinas". Esto es probable debido a la presencia de epítopes altamente reactivas que, cuando se analizaron en el mismo péptido piscina, puede exceder de la parte superior del límite de detección del ensayo ELISpot por lo que pueden subestimar el total específica para el virus magnitud de las respuestas. Esto puede ser más probable para epítopos en "péptido piscinas" que "aleatorios piscinas" si algunas proteínas en general, obtener la respuesta inmune más fuerte que otros. Una piscina de la acumulación de la proteína reactiva enérgicamente epítopos se traduciría en un menor número de puntos que el total de los respectivos "azar piscinas" que contengan estos epítopes distribuyen por igual y totalmente cuantitativos.

Células de pozos ELISpot negativo puede ser utilizado en ensayos de secundaria ELISpot (RecycleSpot)

Con el fin de maximizar el uso de células en muestras de células con disponibilidad limitada, se determinó si las células de la matriz inicial ELISpot pantallas se pueden volver a utilizar en posteriores ensayos funcionales. En concreto, las células de los pozos que no respondió a péptidos añadido en el primer ensayo, así como las células negativas en el control de los pozos se puede utilizar para ensayos de secundaria ELISpot. Para evaluar la viabilidad de esta estrategia, todos los pocillos de la placa inicial ELISpot fueron transferidos a una placa de 96 pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 mientras que la placa se desarrolló ELISpot. Las células de las consecuencias negativas para ELISpot pozos fueron utilizados para confirmar la identidad de la (s) epítopo blanco de la matriz péptido piscinas. En experimentos separados, inicialmente de las células de los pozos también fueron probados en ensayos posteriores para determinar si la continuación de la producción de IFN-γ en estas células podría impedir que sean utilizados en los ensayos de nuevas ELISpot. El análisis también ELISpot comparación de resultados en las placas que estaban bien inalteradas, o de las células que fueron trasladados para su uso posterior.

Representante RecyleSpot ensayos utilizando PBMC y recuperado de las células ELISpot inicial de tres ensayos de los individuos se muestran en la Figura 2. En todos los casos, la negativa inicial de los pozos péptido matriz ELISpot ensayos se volverá a utilizar para volver a confirmar la identidad de la presunta, solo orientadas epitopo compartido por las dos piscinas. Además, inicialmente de piscinas fueron re-probados para determinar si las células reciclado respondió con una magnitud diferente en comparación con el ensayo inicial. Los datos muestran que suficientes células se recuperaron a partir de los ensayos iniciales para realizar reconfirmations de epítopos única orientada en la RecycleSpot, y que la actividad de fondo y la magnitud de las respuestas no fueron significativamente diferentes entre el primer y el posterior ensayos. RecycleSpot ensayos que utilizaron inicialmente de los pozos, o de mezclas inicialmente positivas y negativas de los pozos, mostró alta experiencia en la secundaria de ensayo, indicando en curso la producción de IFN-γ y, por tanto, excluyen la utilización de estas células en el RecycleSpot (datos no presentados). Sin efectos sobre la calidad y el número de puntos entre el manipulado y no manipulada se observaron pozos, lo que indica que la cosecha de células de la placa ELISpot no interfieren negativamente con la calidad del ensayo, por lo menos cuando las células son eliminadas por el uso cuidadoso de pipeteado 12 canales de pipetor Además, RecycleSpot ensayos se realizaron con tanto dulce y congelación de las células y puso de manifiesto que el VIH-y VEB-respuestas concretas fueron mantenidos en celdas de reciclado en ambos casos (datos no presentados). En conjunto, los datos indican que RecycleSpot puede proporcionar un número suficiente de células de ensayos iniciales, y que estas células mantienen la capacidad funcional para su uso en ensayos posteriores, sin aumentar la actividad de fondo. Asimismo, los datos muestran que la reutilización de las células de forma negativa los pozos de la noche a la mañana después de una incubación de no reducir la magnitud de las respuestas a un nivel estadísticamente significativo.

In vitro de las células T de montaje ampliado las respuestas detectadas en fresco ex vivo PBMC muestras

Aunque racional epítopo óptimo diseño de la matriz y RecycleSpots pueden contribuir a reducir el número de células necesarias de análisis in vitro, la disponibilidad de células puede ser la limitación en la configuración de la que sólo muy pequeñas muestras biológicas se pueden obtener. En esos casos, los investigadores han recurrido al uso de la ampliación de las células in vitro [19, 20, 25]. Sin embargo, a pesar de su posible utilidad en situaciones de pequeño tamaño de la muestra (por ejemplo, de tejidos o biopsias de pequeño volumen de muestras de sangre periférica), se conoce relativamente poco acerca de cómo los impactos de expansión in vitro magnitud y la amplitud de las respuestas detectables [20, 25]. Además, CTL respuestas a los agentes patógenos como el VIH, para que un defecto en su capacidad proliferativa se ha demostrado, puede ser gravemente distorsionado por expansión in vitro, incluso cuando estimulado unspecifically [7]. Para resolver este problema e investigar si la estimulación de PBMC con un anti-CD3 mAb (12F6) amplía CTL especificidad de las diferentes igualmente bien, probamos las células ya sea directamente o después de la expansión contra el péptido describen conjuntos de VIH-VEB y específicos de epítopos restringidos por Los alelos HLA del individuo.

Estos análisis incluyen doce temas, de los cuales siete fueron respuestas a la prueba del VIH y el VEB epítopos, mientras que los cinco restantes se les realizó pruebas de VEB-sólo respuestas concretas (Figura 3].

En un primer análisis, congelados PBMC o bien fueron probados directamente o después de 2 semanas de duración utilizando la estimulación 12F6 y de la serie de VIH o VEB epítopos fueron comparados, por lo que en 19 puntos de datos (siete individuos la prueba del VIH y EBV y cinco respuestas de los sujetos a prueba Para VEB específicos de las respuestas). Citometría de flujo en nueve individuos mostraron preferente expansión de las células T CD8, como expresión de las células T CD4 osciló entre el 0,5% y sólo el 14%, independiente de la infección por el VIH y a partir de células T CD4 (datos no presentados). El Elispot resultados revelaron ninguna diferencia en la amplitud de las respuestas (número de epítopos dirigida) entre la prueba directa y la expansión de las células, como una mediana de 6,4 y 6,9 se detectaron respuestas positivas para el VIH y el VEB, respectivamente (Figura 3A]. El reconocimiento de que el VIH-y VEB-epítopos derivados es igualmente frecuente por las dos preparaciones diferentes de células (datos no presentados). Cuando la magnitud de las respuestas se compararon directamente entre las células utilizan y ampliada, la ampliación de las células respondió con una magnitud ligeramente mayor que unexpanded células. Esta tendencia fue más prominente cuando el VIH y el VEB respuestas fueron analizadas por separado. Las respuestas al VIH en las células directamente probados mostraron una mediana de 185 SFC/10 6 PBMC, en comparación con 285 SFC/10 6 PBMC ampliado en células (p = 0,0005), mientras que la mediana de VEB-respuestas concretas tenido una magnitud de 170 SFC / 10 6 en unexpanded PBMC, frente a 190 SFC/10 6 PBMC ampliado en células (p> NS).

Por otra parte, para determinar si las células recién aisladas podrían ampliarse sin cambios drásticos en los patrones de respuesta, PBMC de cinco sujetos con infección por VEB se probaron directamente después de aislamiento, o después de la congelación, y con o sin la expansión in vitro. De acuerdo con los datos de las muestras congeladas, no hubo diferencia significativa en el número de piscinas objeto de ataques o la mediana magnitud de estas respuestas se observó (Figura 3 y C 3 D]. A pesar de la concordancia entre los patrones de respuesta entre las diferentes preparaciones de células que fue tan baja como 80%, la amplitud y magnitud de estas respuestas no cambió. Además, al comparar las magnitudes de las respuestas entre sí, la magnitud relativa de las respuestas se mantuvo entre los cuatro preparaciones diferentes de células (datos no presentados). Combinados, los datos demuestran que los anti-CD3 ampliado células mantener su especificidad y magnitudes relativas en comparación con las células unexpanded (tanto cuando se utiliza fresco o después de la descongelación) in vitro, lo que indica que la expansión podría ser empleado cuando la amplitud, pero no la magnitud absoluta de las respuestas , Es que se está evaluando. Este fue el caso para la evaluación de VIH, así como la VEB-respuestas concretas, lo que sugiere que las células específicas para el VIH no difieren en medida significativa de EBV células específicas en su capacidad para someterse a la expansión in vitro utilizando un estímulo antigénico no.

Discusión

Cell disponibilidad puede obstaculizar gravemente análisis in vitro de antígenos específicos de la respuesta inmune, por lo tanto, los enfoques que optimizar el uso de células se necesitan con urgencia. Esto es especialmente cierto en el caso de ensayos que requieren amplios conjuntos de antígenos que deben someterse a prueba, mientras que sólo un número limitado de células se pueden obtener. Sin embargo, las consideraciones logísticas pueden impedir la repetición de recogida de muestras para ensayos más grandes, y la reutilización de los frescos o congelados muestras podría proporcionar los medios más eficaces para llevar a cabo los análisis necesarios. En el presente estudio se introduce un nuevo enfoque por el cual algunos de la muestra limitaciones pueden superarse, y puede ser de gran ayuda en las pruebas de laboratorio de rutina que en la actualidad no se hace un uso óptimo de las células disponibles. Esto puede no sólo facilitar actualmente realiza ensayos, pero puede abrir posibilidades de ampliar los análisis a la evaluación simultánea de aún mayores conjuntos de antígenos y otros aspectos funcionales.

En el presente estudio, hemos diseñado y probado un método que permite la evaluación de la inmunidad mediada por CTL contra cinco diferentes infecciones virales, como el VIH, VHC, VHB, CMV y VEB. Nos ofrecen una actualizada lista de epítopos virales actualmente determinado para el que la longitud mínima restricción HLA y se han establecido. En el caso de los pequeños genoma del VIH y los virus VHC, estos epítopes óptima representan una gran parte de los respectivos objetivos inmune [26]. Aunque no se incluyen todas las respuestas detectadas en exámenes OLP, nuestro análisis comparativos de VIH específicas de las respuestas de 100 individuos, ya sea detectado por la superposición de péptido (OLP) establece óptimo o epítopes muestran que en promedio el 68% de las respuestas se observó OLP cubierto previamente por Establecido óptima epítopos del VIH (datos no presentados).

Los datos actuales muestran también que PBMC reciclado de las consecuencias negativas para los pozos de un ensayo ELISpot se pueden reutilizar para posteriores ensayos funcionales. En función de los análisis realizados en el siguiente ensayo, como la reconfirmación de las respuestas solo epítopo previsto en el análisis inicial de la matriz, un número relativamente pequeño de células tal vez necesario. Así, si bien los individuos con una amplia respuesta en el ensayo inicial ELISpot no dará muchos pozos, de donde los negativos de reciclar las células, con los pozos no específica péptido además de la negativa de control de los pozos a menudo, ofrecen una cantidad suficiente de células de reciclado para completar la matriz de la base Análisis. Desde las respuestas en el RecycleSpot no son significativamente disminuido en comparación con el ensayo inicial (Figura 2], la magnitud de las respuestas en el siguiente ensayo puede todavía ofrecer suficientes datos en el único epítopo nivel.

Ampliación de las células in vitro se han utilizado en una serie de estudios donde la disponibilidad de células ha sido el factor limitante [21, 22]. Sin embargo, ningún estudio ha comparado directamente, por ejemplo, la biopsia y PBMC derivados de las respuestas de manera sistemática y en un solo epítopo nivel, y no está claro si la expansión in vitro brinda datos idénticos. En el presente informe, hemos comparado los patrones de respuesta a EBV y el VIH-derivado directamente de los antígenos ex vivo e in vitro ampliado PBMC preparativos. No se observaron diferencias significativas, aunque algunas de las respuestas se pierden o adquirida a la expansión. Como ninguna diferencia en la concordancia entre EBV y el VIH-específica de las respuestas se observó que los datos indican que las respuestas de ambos virus son igualmente bien ampliable in vitro utilizando un antígeno de estímulos inespecíficos, a pesar de la continua replicación viral en la mayoría de los sujetos infectados por el VIH a prueba aquí .

Así pues, óptima epítopo matrices, RecycleSpot y expansión in vitro de las células se pueden combinar para obtener la máxima información sobre un amplio conjunto de los antígenos, incluso si muestra la disponibilidad es limitada. Como un enfoque práctico, la ampliación de las células congeladas PBMC alícuotas puede utilizarse inicialmente para seleccionar a un gran número de antígenos para determinar la amplitud aproximada de las respuestas dentro de la serie de antígenos utilizados. Estudios posteriores usando unexpanded y antígeno de las células matrices en conjunto con RecycleSpot haría posible que la determinación de la verdadera amplitud y, más importante aún, la verdadera magnitud de estas respuestas, mientras exige que un mínimo número de células. Además, las células pueden ser recuperados con éxito de la RecycleSpot, una vez más, que se utilizarán para los análisis genéticos, como HLA a escribir. Este enfoque combinado debería facilitar la futura labor en la configuración de la celda en la que la disponibilidad es de preocupación constante.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza a FKB (SNF-PBSKB-102686) y por el trasplante de órganos sólidos en el VIH: Multi-Side de estudios (AI052748), financiado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas.