Cancer Cell International, 2005; 5: 15-15 (más artículos en esta revista)

Influencia de la RAR RAR α α gen MDR1 de expresión y de la P-glicoproteína humana en función de las células leucémicas

BioMed Central
Tatjana P Stromskaya (stromskaya@mail.ru) [1], Ekaterina Y Rybalkina (Kate_rybalkina@mail.ru) [1], Tatjana N Zabotina (tat-zabotina@yandex.ru) [1], Alexander A Shishkin (klounv @ Mail.ru) [1], Alla Un Stavrovskaya (astavrovskaya@yahoo.com) [1]
[1] Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Centre of the Russian Academy of Medical Sciences, Kashirskoye sh 24, Moscow 115478, Russia

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Resumen
Antecedentes

La multirresistencia (MDR) fenotipo de las células malignas es el principal problema en la quimioterapia de las neoplasias. El tratamiento de la leucemia con los retinoides se dirige en la inducción de la diferenciación de las células leucémicas. Sin embargo las interconexiones entre retinoides regula la diferenciación de las células leucémicas y la regulación de la MDR sigue siendo poco clara.

Métodos

Cuatro líneas de las células leucémicas en cultivo de diversos tipos de diferenciación fueron infectados con RAR RAR α gen α y estable transfectants fueron aislados. Hemos investigado la diferenciación de estas células, así como la expresión de RAR α RAR α y MDR1 genes y P-glicoproteína (Pgp, proteínas MDR) en la actividad funcional de estas células.

Resultados

Todos RAR RAR α α transfectadas sublines demostrado el aumento de la cantidad de RAR α RAR α mRNA. Todos estos sublines hizo más diferenciadas. Actividad intrínseca de gen MDR1 (pero no de Pgp actividad funcional) se incrementó en uno de los transfectants. All-trans-ácido retinoico (ATRA) inducida por la actividad de Pgp en dos de tres infectants en mayor medida que en las células de los padres.

Conclusión

Los datos muestran que regula RAR α MDR1 / Pgp actividad humana en las células leucémicas, en primer lugar, la actividad de Pgp inducida por ATRA. Estos resultados muestran que RAR α sobreexpresión en células leucémicas podría resultar en MDR.

Antecedentes

La multirresistencia (MDR) fenotipo de las células malignas es el principal problema en la quimioterapia de las neoplasias. P-glicoproteína (Pgp), la actividad es reconocida como uno de los principales mecanismos responsables de la MDR. Pgp transporta muchos compuestos estructuralmente diversa a través de la membrana celular y confiere el fenotipo MDR en las células del tumor [1]. Una serie de vías de señalización participar en la regulación de la expresión de genes MDR1 y la actividad de su producto, Pgp [2]. Algunas de estas vías de señalización podrían participar en la regulación coordinada de MDR1 / Pgp actividad, la proliferación celular y la diferenciación celular. Se demostró que el ácido retinoico (AR) pueden modular la expresión del gen MDR1 [3 - 5]. Retinoides se sabe que están implicados en la regulación del crecimiento celular, diferenciación y apoptosis. En la última década se convirtió en retinoides implicados en el tratamiento de la leucemia y algunos tumores sólidos [6]. Este enfoque cambió el enfoque del tratamiento de las enfermedades hematológicas de la citotoxicidad de los fármacos contra el cáncer a la inversión de detenidos maduración de las células leucémicas. Retinoides actuar a través de dos familias de los receptores (RARs - RAR α, β RAR, RAR γ) y RXRs (RXR α, RXR β, γ RXR). Hay pruebas de que la RAR α es fundamental la mediación del receptor de los efectos biológicos durante retinoide de señalización en algunas células [7]. La diferenciación celular causado por la sobreexpresión de los receptores estables RAR α ha demostrado en el resultado de la expresión constitutiva más de gen MDR1 en algunos cultivos celulares de tumores sólidos [4]. Sin embargo las interconexiones entre RA / RAR α regula la diferenciación de las células leucémicas y la regulación de MDR1 / Pgp actividad sigue siendo poco clara. En algunas células leucémicas RA no influyó MDR1 y / o la actividad de Pgp, mientras que en los otros, ya sea aumentadas o reducidas MDR1 / Pgp expresión [5, 8]. El objetivo de este estudio es investigar si los efectos de todos-trans-ácido retinoico (ATRA) en MDR1 / Pgp actividad en las células leucémicas están conectados con RAR RAR α α expresión y con la diferenciación celular leucémica. Estamos aislados sublines cultivadas de las células leucémicas se caracteriza por la estabilidad RAR RAR α α e investigó la sobreexpresión constitutiva y ATRA inducida MDR1 / Pgp actividad en estas células. Nuestros datos muestran que diversos RAR RAR α α transformado líneas de células leucémicas adquirido más diferenciado fenotipo. Constitutiva nivel de MDR1 aumento de la expresión de genes en una de RAR α RAR α overexpressing células sublines. RAR RAR α α sobreexpresión no influyó en la actividad de Pgp funcional mientras que la actividad de Pgp inducida por ATRA se elevó en todos los infectants estudiado. Esto demuestra que el principal efecto de RAR α RAR α en las células estudiadas es su influencia en la actividad funcional inducida de Pgp.

Métodos
Líneas celulares y de la cultura

Las líneas de células leucémicas en cultivo utilizados en el estudio: las células H9 (aguda de células T humanas leucemia) [9], KG-1 línea celular (células de leucemia mieloide aguda) [10], K562 línea celular (células obtenidas de los pacientes en Explosión de la crisis de la leucemia mieloide crónica) [11], NB4 (leucemia promielocítica aguda) [12].

Las células fueron cultivadas en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (Gibco, EE.UU.), 2 mM de L-glutamina, 50 μ g / ml de gentamicina a 37 ° C en una atmósfera plenamente humidificado de 95% de aire y 5% de CO 2 . Todas las líneas celulares derivadas descritos en el presente documento fueron obtenidos por la infección retroviral y de selección con el antibiótico apropiado. ATRA (all-trans-ácido retinoico, Sigma, EE.UU.) se añadió al medio de cultivo en siembra o 24 horas después de la siembra (ver Leyendas de las figuras).

Expresión de vectores y retrovilal infección

El vector retroviral PA317/LRARSN productores de línea celular se utilizó. Todo el procedimiento se ha descrito anteriormente [4]. En resumen, el vector utilizado contiene un fragmento de cDNA abrigo a los completar la secuencia de codificación de la RAR RAR α α presentado por el virus de la leucemia murina Moloney largo de la terminal de repetición, así como el promotor SV40 principios de la conducción de la neomicina fosfotransferasa gen (neo) como marcador seleccionable [13]. Las células (4 × 10 5 por 25 cm 2 frasco) Se sembró 24 h antes de la infección. Medio condicionado de un retrovirus que producen línea celular fue filtrada a través de un 0,45 μ m de membrana (Millipore, EE.UU.), diluido 1:1 con soporte, que contiene un 1% de suero y 8 μ g / ml Polybrene y añadió a las células durante 24 h a 37 ° C, 5% CO 2. Más de selección se llevaron a cabo por el cultivo de células en el medio suplementado con 400 μ g / ml G418 (Gibco, EE.UU.) durante al menos 21 días. El medio se cambió dos veces por semana. El grupo de células resistentes a G418 se resuspendió en medio de cultivo y progresivamente ampliado.

Determinación de crecimiento de las células, la apoptosis y la diferenciación

Las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos (1 × 10 4 células por pocillo) y el número de células se contaba en los días 1, 3, 5 y 8 después de la siembra. La apoptosis en las poblaciones de los padres y RAR α líneas de células infectadas se ha realizado mediante el procedimiento estándar [14]. Las células se recogieron 24 h después de la siembra, se lava con PBS, y fija en el 70% de etanol durante la noche a 4 ° C. Fijo células se suspendieron en buffer cítrico y teñidas con yoduro de propidio (5 mcg / ml) en PBS durante 1 hora a 4 ° C. ADN contenido posteriormente se mide por FACScan (Becton Dickinson, EE.UU.).

El inmunofenotipo de las células fue evaluado como ha sido descrito previamente [15]. Superficie expresión de los antígenos se determinó siguientes: CD3, CD5, CD7, CD8, CD11b, CD13, CD15, CD33, CD34, HAE3 y HAE9. En resumen, las células fueron incubadas con ficoeritrina que llevan la etiqueta de anticuerpos monoclonales de ratón durante 20 min a 4 ° C (Becton, Dickinson), lavada con medio RPMI 1640 y se analizaron con un flujo cytometer (Becton Dickinson).

Análisis de rodamina 123 (Rh123), el flujo de salida de las células

La técnica utilizada en el estudio se describen en [16]. Las células fueron cargadas con 5 μ g / ml Rh123 (Sigma) durante 10 minutos a 37 ° C, lavados dos veces con PBS frío, pH 7,2, y se incubaron durante 30 minutos en medio de tintes libres a 37 ° C. Después de la finalización de la incubación, las células fueron lavadas dos veces con PBS frío. Célula de fluorescencia se midió en un flujo cytometer FACScan (Becton Dickinson, EE.UU.). Cada medición contados eventos 5000. No son células viables con acceso de los análisis sobre la base de lado ambulantes.

ARN aislamiento y la transcriptasa inversa reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), análisis de RAR α y la expresión de genes MDR1

Las células fueron disueltos en el TRI reactivo (Sigma, EE.UU.). Total RNA fue aislado como se describe en el manual del fabricante. Para el análisis, alícuotas de ARN aisladas fueron desnaturalizados con formamida y sometidas a electroforesis en geles de agarosa 1,8%. Las muestras con visualizan claramente 18S y 28S del RNA bandas se utilizaron para otros procedimientos. Primera línea de cDNA fue sintetizado usando la transcriptasa inversa M-MuLV (MBI Fermentas, Rusia) con 4 μ g RNA como plantilla, el 2,5 ng hexámeros al azar, 0,25 mM de cada deoxynucleotide trifosfato (SibEnzyme, Rusia), dithiothreitol, 4 Unidades de inhibidor de RNAase (MBI Fermentas, Rusia) y 100 unidades de M-MuLV RT. La reacción se realizó a los 42 ° C durante 50 min, y 1 / 60 de volumen de mezcla de reacción se utilizó para la amplificación. PCR se realizó en un volumen total de 25 μ l utilizando el termociclizador "Tercyc" (tecnología de ADN, Rusia). La mezcla de PCR consistió de (NH 4) 2 SO 4 que contienen PCR buffer ( "MBI Fermentas"), 0,160 mM dNTPs mezcla ( "MBI Fermentas"), 2 mM MgCl2, 20 pmoles de cada primer y 0,8 Unidad de - Taq polimerasa ( "MBI Fermentas"). PCR se realizó de la siguiente manera: 94 ° C durante 2 segundos, Tm (diferentes para cada gen) durante 10 segundos, 72 ° C durante 5 segundos. Semi-PCR cuantitativa RARa y análisis de expresión de genes MDR1 se realizaron con oligómeros amplificar a 333 pb y 167 pb productos, respectivamente. Primers específicos de los genes utilizados para la RT-PCR se muestran en la Tabla 1. Los importes de plantilla de ADNc se normalizaron mediante amplificación por PCR de cDNA β2-microglobulina (control interno). El número óptimo de ciclos de PCR fueron 24 para la b2-microglobulina, 26 de RAR α-producto específico, el 33 de MDR1 (para todas las líneas excepto las células KG1 y KG1/RAR, estas células para el número de ciclos de PCR MDR1-26 fueron producto específico ). Estos números de los ciclos dado claramente detectable PCR productos dentro de un rango exponencial. Productos de amplificación de PCR fueron separados en tubos, resolvieron por electroforesis en gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio y visualizados en luz ultravioleta.

Resultados
Influencia de la RAR α sobreexpresión de genes en la diferenciación celular, la proliferación y la apoptosis espontánea

RAR α gen se introdujo en las células leucémicas en cultivo de diversos tipos de diferenciación, tal como se describe en Métodos. El sublines de H9, KG-1, K562 y NB4 células se caracteriza por la capacidad de crecer en el medio suplementado con G418 se aislaron (H9/RAR, KG-1/RAR, K562/RAR y NB4/RAR). Semi-RT-PCR cuantitativa reveló más pronunciada expresión de RAR α mRNA en todas las líneas celulares transfectadas en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. 1]. ATRA (5 μ M aplicado durante 48 h) el aumento de RAR α mRNA en algunas células transformadas RAR α (H9/RAR, KG-1/RAR, K562/RAR) en mayor medida que en células de los padres (Fig. 1].

La investigación de la situación de la diferenciación de estas células muestra que todos RAR α transfectadas sublines difieren de la de sus padres poblaciones de células (Fig. 2]. RAR α transfectadas H9 cultura contiene más variantes de células que expresan antígenos CD5 y CD8 que los padres línea celular (Figura 2A]. Así, el número de células con antígenos de diferenciación linfoide más tarde en el aumento de los marcadores RAR α overexpressing H9 células. Existe evidencia fenotípica de la diferenciación granulocítica en KG-1/RAR células subline según lo indicado por una reducción de la expresión CD13 y el aumento de la expresión de CD11b antígeno en comparación con las células de sus padres (Figura 2B]. En KG-1/RAR la población de células CD34 parte de las células y la disminución de la porción del aumento de las células CD33 (Figura 2B]. Esto también pone de manifiesto el aumento de la diferenciación de estas células overexpressing RAR α. K562/RAR población en el número de la erythroid diferenciación de las células (que expresan antígenos HAE9 y HAE3) es mayor que en el K562 población (Fig. 2C]. Síntesis de hemoglobina se incrementa en K562/RAR cultura más de 5 veces en comparación con las células de los padres (no se muestra). NB4/RAR población en el número de las células de diferenciación mieloide (expresión de los antígenos CD15 y CD11b) es mayor que en la población NB4 (Fig. 2D].

El porcentaje de células de la apoptosis espontánea en el aumento de 2 a 3 veces en todos los RAR α transfectadas poblaciones de células (Fig. 3]. Esto podría estar conectado con más diferenciado fenotipo de las células transformadas RAR α. Parece que en la población de células H9/RAR el aumento del número de células apoptóticas podría ser al menos en parte relacionado con el aumento de expresión de CD95 (Fas/APO1): en este RAR α transformado subline CD95 aumentó casi 10 veces en comparación con los padres Población de células (del 2,6% en H9 a 21,4% en H9/RAR cultura). Sin embargo en el KG-1 y K562 poblaciones de células el número de células que expresan CD95 no aumentó después de RAR α transformación.

Como Fig. 4 muestra, RAR α transfectadas KG-1, K562 y NB4 células proliferan más lentamente que las células de sus padres. Sin embargo H9/RAR células no demostró más lenta tasa de proliferación. Así, más diferenciado situación de la RAR α transformarse poblaciones de células no era necesaria relacionada con la disminución de las tasas de proliferación. Todos RAR α transformado células parecen ser más sensibles que las células de tipo salvaje a la acción inhibitoria de ATRA en la proliferación celular (Fig. 5].

Influencia de la RAR α sobreexpresión de la actividad de los genes MDR1

Se estudiaron intrínseca y de la expresión inducida por ATRA gen MDR1 en todas las líneas celulares por semi-cuantitativos técnica de RT-PCR. Los niveles basales de mRNA MDR1 variado en diferentes células de tipo salvaje: en H9 y NB4 células constitutivas MDR1 la expresión de los genes no fue revelado, en las células de tipo salvaje K562 algunos MDR1 ARNm se encontró, KG-1 en células de la cantidad de mRNA MDR1 fue grande ( Fig. 6]. Es de notar que el número óptimo de ciclos de PCR fueron 33 para MDR1-producto específico en todas las células, mientras que para los estudios de células KG1 y KG1/RAR hemos utilizado 26 ciclos de PCR. En RAR α H9 células transfectadas la expresión constitutiva del gen MDR1 aumentaron ligeramente, mientras que en KG-1/RAR y NB4/RAR las células constitutivas MDR1 mRNA cantidad no era elevada en comparación con las células de tipo salvaje, que parece ser incluso disminuyó ligeramente en K562/RAR (Fig. 6]. Así, la alteración de los niveles basales de expresión de MDR1 en RAR α transformado células parecen variar en diferentes líneas celulares.

ATRA (5 μ M aplicado durante 48 h) el aumento de la expresión del gen MDR1 en todas las líneas celulares examinadas, ya sea en los padres o RAR α transfectadas las células (Fig. 6]. En H9/RAR células efecto del ATRA sobre la expresión MDR1 fue significativamente mayor en comparación con las células de sus padres. En otros tratados ATRA RAR α transformado células sublines MDR1 expresión es ATRA indistinguibles de las células tratadas parental (Fig. 6].

Influencia de la RAR α gen en la transformación de las células Rh123efflux

La retención de Rh123 por las células se considera como una prueba para la actividad de Pgp funcionales [16, 17]. Rh123 flujo de salida de las células se incrementó en K562/RAR células en comparación con la celda de la población parental (Fig. 7B, Cuadro 2]. En H9 y KG-1 RAR α transformado células hubo alteraciones en la retención Rh123 (Fig. 7A y 7C): en las poblaciones de H9/RAR y culturas KG-1/RAR la fracción de las células más aburridas disminuido en comparación con las culturas de sus padres (Media de la intensidad de fluorescencia de células sublines estudiados se muestran en la tabla 2]. Esto muestra que la actividad de Pgp no fue elevada en estos RAR α transformarse poblaciones de células y sugiere que existe una cierta disminución de la actividad funcional de Pgp.

Hubo aumento de la parte de las células Rh123 aburrida después de ATRA en el tratamiento tanto K562 y K562/RAR poblaciones de células (media de intensidad de fluorescencia de ambas poblaciones disminuyeron aproximadamente el 17%) (Fig. 8C, D, el cuadro 2]. ATRA Rh123 inducida H9/RAR flujo de salida de las células, mientras que en la población parental H9 este medicamento no tuvo efecto (Fig. 8A, B, el cuadro 2]. En KG-1/RAR células inducida por ATRA muy destacado aumento en el número de células Rh123 aburrida (más de 70% de disminución de la intensidad media de fluorescencia), mientras que en la celda de la población parental ATRA media disminuyó la intensidad de fluorescencia en menor medida (Fig. 8E , M, Cuadro 2].

Discusión

El tratamiento de la leucemia con los retinoides se dirige en la inducción de la diferenciación de las células leucémicas. La pregunta es: ¿existen interconexiones entre RA / RAR α regula la diferenciación de las células leucémicas y MDR1 / Pgp actividad? En este estudio hemos aislado más diferenciado de las variantes cultivadas de las células leucémicas por la introducción en las células de RAR α gen que codifica uno de los receptores de la AR. Todos RAR α transformarse poblaciones de células leucémicas se caracterizaron por el mayor RAR α la expresión de genes en comparación con las células de los padres. Todos RAR α transformarse poblaciones de células leucémicas se hicieron más diferenciadas. Esto fue demostrado por los estudios de los marcadores de diferenciación, por el aumento en el número de células que mueren por apoptosis espontánea y por la disminución de la proliferación de las tasas de la mayoría de las células transfectadas RAR α sublines. Así, RAR α sobreexpresión podría resultar en el aumento de la diferenciación de las distintas poblaciones de células leucémicas.

Se comparó la expresión del gen MDR1 y funcional de la actividad de Pgp Rh123 a prueba por la retención en los padres y RAR α transformado células. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Mayor constitutiva (uninduced) expresión del gen MDR1 se encontró en una de las cuatro líneas de células después de la transformación RAR α (H9/RAR, Tabla 2, Fig. 6]. En los experimentos anteriores con melanoma y hepatoblastoma células humanas hemos demostrado que la expresión constitutiva del gen MDR1 se incrementó después de RAR α transfección en ambos RAR α transformado células sublines [4]. Así, la regulación de las interconexiones entre la basal MDR1 y RAR α actividades podrían existir tanto en las células de los tumores sólidos, y en las células leucémicas. Nuestros datos sugieren, en la que las poblaciones de células de los tumores sólidos, RAR α sobreexpresión podría ir acompañada de MDR1 constitutiva de expresión de la mayoría de las veces en las células de tumores malignos hematopoyéticos.

Nuestro estudio no revelaron la aparición de la Pgp funcionales en las células leucémicas estudiado después de RAR α transformación. En H9/RAR células elevación de la expresión constitutiva MDR1 no se ha traducido en el aumento de flujo de salida Rh123 (Fig. 7A, el Cuadro 2]. Algunos estudios también han descrito las discrepancias entre Pgp (proteína) o MDR1 Pgp mRNA expresión y función en las células leucémicas [18, 19]. Estas discrepancias pueden producirse por una variedad de razones. En cualquier caso, nuestros datos muestran que el aumento de la diferenciación de poblaciones de células leucémicas inducida por la sobreexpresión RAR α no se han traducido en la elevación de la actividad funcional constitutiva de Pgp. En nuestro estudio anterior, encontramos que RAR α sobreexpresión no cambió Pgp actividad funcional en dos RAR α transformado sublines de células humanas (melanoma y hepatoblastoma), pero el cambio se hizo en ratas células [4]. Parece que exogeneous RAR α en las células de tumores malignos humanos no influye en la actividad funcional basal de Pgp.

En KG-1/RAR caracteriza por el aumento de differentiaion (Tabla 1] que no habían encontrado aumento en la expresión constitutiva MDR1 y disminución de la actividad funcional de Pgp (Fig. 7C, Cuadro 2]. Se sabe que las células madre sanguíneas y principios de progenitores que expresan el antígeno CD34 también expresan altos niveles de Pgp funcionalmente activa [20]. Maduración de estas células se acompaña de la disminución de la expresión de Pgp y aún más rápida disminución de la actividad funcional de Pgp [21]. Puede ser sugerido que las alteraciones en la función de Pgp KG-1/RAR están relacionados con la diferenciación de estas células.

La situación con Pgp actividad funcional inducida por ATRA en las células estudiadas se diferencia de la situación con la actividad constitutiva de esta proteína. En los tres RAR α células transfectadas ATRA habían inducido a la actividad de Pgp fuctional (Fig. 8. Cuadro 2]. Además, en dos RAR α transformado sublines (H9/RAR y KG-1/RAR) ATRA activado Pgp, mientras que en las células de los padres que habían ningún efecto (H9) o activado Pgp en menor medida (KG-1) (Tabla 2 ). Estos datos sugieren que RAR α participar en el control de los inducidos, pero no constitutiva de Pgp actividad funcional en las células leucémicas.

El gen MDR1 regulación de la transcripción y Pgp actividades funcionales son los complejos procesos [1, 2]. Los estudios de estos procesos están en marcha. Nuestros datos muestran que RAR α sobreexpresión de genes podrían influir en la actividad funcional de Pgp inducida en las células leucémicas, es decir, podrían participar en la aparición de la multirresistencia en las poblaciones de estas células malignas. Parece que esta influencia podría depender del contexto celular.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones 04-04-48613a y 02-04-48200 ruso de la Fundación para la Investigación Básica.