Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 20-20 (más artículos en esta revista)

TGF-beta expresión rata durante el embarazo y la decidua actividad en la supervivencia celular

BioMed Central
Carl Shooner (SHOONECA@CollegeSherbrooke.qc.ca) [1], Pierre-Luc Caron (Pierre-Luc_Caron@UQTR.CA) [1], Guylaine Fréchette-Frigon (Guylaine_Frechette-Frigon@UQTR.CA) [1], Valérie Leblanc (Valerie_Leblanc@uqtr.ca) [1], Marie-Claude Déry (Marie-Claude_Dery@UQTR.CA) [1], Eric Asselin (Eric_Asselin@UQTR.CA) [1]
[1] Département de Chimie de Biologie, Groupe de Recherche en Biopathologies Cellulaires et Moléculaires, Université du Québec à Trois-Rivières, CP 500, Trois-Rivières, Québec, G9A 5H7, Canadá

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Resumen
Antecedentes

Durante el embarazo temprano en ratas, trofoblasto del embrión diminuto se une con el endometrio y las células epiteliales se someten a la apoptosis. Cerca del final del embarazo, la regresión de la decidua basal (DB) se observa también (desde el día 14 al 20). Sin embargo, poco se sabe sobre la intra-mecanismos celulares y moleculares implicados en la regulación de apoptosis en el útero durante el embarazo. El objetivo del presente estudio fue investigar la presencia y la expresión del desarrollo del factor de crecimiento transformante-beta isoformas (TGF-beta bien conocido factor de diferenciación) en el endometrio de rata durante el embarazo y su acción cultivadas in vitro utilizando células del estroma endometrial.

Métodos

En vivo: Las ratas fueron asesinados en diferentes días de gestación (días 2-20) y uterino eliminado para recoger extractos de proteínas de endometrio o uterino fueron el fijo, incrustado y seccionaron para inmunohistoquímica (IHC) e in situ la muerte de la célula de análisis utilizando TdT-mediada dUTP Nick fines de etiquetado (TUNEL). In vitro: Las ratas fueron ovariectomizadas y decidualization fue inducida utilizando esteroides sexuales. Decidua células del estroma endometrial fueron recogidas y cultivadas.

Resultados

Un aumento de la apoptosis en el PP en los días 14, 16 y 18 se observó. Cleaved caspasa-3 se detectó claramente durante la regresión del PP por Occidental y análisis de inmunofluorescencia. Occidental endometrial utilizando análisis demostró que los extractos de proteínas TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3 fueron altamente expresado en el momento de la base de datos de regresión (día 14). Durante el embarazo precoz, el TGF-beta1 y beta2-expresiones planteadas en 5,5 a 6,5 días. TGF-beta3 proteína no se detectó en los primeros meses de embarazo. IHC análisis reveló que el TGF-beta1 y -2 se encontraron en torno a las dos epitelio (luminal y glandular) en el estroma compartimiento en lugar de implantación, y TGF-beta3 se encuentra principalmente en torno a epitelio endometrial en el estroma compartimento. Smad2 fosforilación se incrementó en el momento de la base de datos de regresión. Los estudios in vitro utilizando células del estroma endometrial decidua reveló que el TGF-beta1 y la apoptosis inducida por Smad2 fosforilación. Además, el TGF-beta1 reducido tanto Akt (reconocida como factor de supervivencia) fosforilación y XIAP (ligada al X inhibidor de la apoptosis de proteínas) de expresión en las células del estroma endometrial decidua in vitro.

Conclusión

En conjunto, estos resultados sugieren que el TGF-beta isoformas son regulados de manera diferente durante el embarazo y puede tener un papel importante en el control de la supervivencia celular y la apoptosis en etapas específicas durante el embarazo.

Antecedentes

La apoptosis es un tipo de muerte celular programada y es un fenómeno natural que ocurre cuando las células son sometidas a estrés, como daño en el DNA, la muerte o la falta de señales del factor de crecimiento. Estímulos de apoptosis permitir una cascada de señales intracelulares como las caspasas, una familia de cisteína proteasas implicadas en la división de un número importante de proteínas de la célula, que resulta en el desmontaje y la muerte celular, la fagocitosis de las células y la eliminación de desechos por las células inmunitarias. La apoptosis juega un papel importante durante la implantación del embrión en roedores donde características morfológicas de la apoptosis se observan en las células del epitelio endometrial en el sitio de implantación del embrión [1 - 3]. Además, este fenómeno también se produce durante la última etapa del embarazo, sobre todo durante la regresión de la decidua basal (PP) en el endometrio de rata [4, 5]. Dos decidua zonas se forman durante el embarazo: la principal zona de la decidua antimesometrial lado del útero y la decidua zona secundaria (o antimesometrial decidua) que se forma después ampliación de la zona primaria decidua [5, 6]. La zona secundaria decidua eventualmente transforma las células del estroma en la región mesometrial para formar el PP que regresa después de los 14 días de gestación [7]. Si el fenómeno de la creciente tamaño de embrión es una causa o correlación con el aumento de la apoptosis aún no se ha dilucidado.

Los primeros miembros del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β) superfamilia se identificaron sobre la base de su capacidad para inducir un fenotipo transformado de ciertas células en cultivo [8]. Ahora son conocidos como multifuncional polipéptidos implicados en la regulación de la proliferación celular y la diferenciación, immunoregulation, la angiogénesis y la regulación de la matriz extracelular [9, 10]. Actúan a través de la señalización celular a través de Smads y Phosphorylated-Smads (P-Smads), la forma activa de Smads. Estas proteínas son trasladadas al núcleo y activar factores de transcripción que a su vez activan las caspasas y la regulación de otras proteínas [11, 12]. Otra característica de TGF-β es su capacidad para inducir la apoptosis en varios tipos de células [7, 13], de hecho, el TGF-β se mostró a favor de tener una función de apoptosis mediada por caspasas [14 - 16]. Genes que codifican las tres isoformas están localizadas en diferentes cromosomas y las isoformas pesos moleculares son ligeramente diferentes: 15, 12,5 y 12 KDa de TGF-β1, β2 y β3 respectivamente, que comparten el 80% de identidad de secuencia y se producen en forma latente que se activan 112-en un aminoácido péptido maduro [17]. Multiplicidad de TGF-β isoformas y secuencia de conservación dentro de cada formulario a través de la evolución sugiere importantes funciones específicas. Además, se ha demostrado que el TGF-β1, - y β2 - β3 diferente se expresa en el útero de ratón [18] y porcina concepto de la maternidad interfaz [19, 20].

El útero es un órgano dependiente de la hormona y es objeto de una abundante cantidad de proliferación celular y la muerte celular. Los estudios han demostrado que la apoptosis se incrementa en la rata y el endometrio durante la implantación de regresión de la decidua basal en la rata [1, 2, 21]. El ARNm del TGF-β1, se ha demostrado que estar presente en el útero durante el embarazo y la rata fue localizado en el luminal y glandular células epiteliales durante la primera y la última etapa del embarazo [22]. TGF-β1, y - β2 mRNAs también se encuentran en el útero durante el embarazo ratón [23 - 25]. Expresión de TGF-β2 y TGF-β3 mRNAs también se indica que se expresa en el ratón periimplantation útero [18]. Un estudio ha demostrado que el TGF-β1 y - β2 tratamientos de endometrio de rata cultivadas sobre las células del estroma apoptosis inducida [7]. Estos estudios sugieren que el TGF-β isoformas podrían participar específicamente en el control de la apoptosis en el útero durante el embarazo. Sin embargo, los mecanismos implicados en el control de la apoptosis en el endometrio durante el embarazo son poco documentadas. Estudios sugieren la importancia del TGF-β isoformas específicas en el tiempo del embarazo se realiza en el nivel de mRNA y es importante para determinar su presencia a nivel de proteínas. Así, el objetivo de este estudio fue determinar la expresión y la expresión del desarrollo del TGF-β1, β2 y β3 proteínas en la rata útero durante el embarazo y seguir determinar in vitro, el efecto de TGF-β en la determinación de decidua destino celular. Se encontró que los tres isoformas de TGF-β se expresaron y regulados de manera diferente en el epitelio y estroma endometrial células de rata durante el embarazo y la decidua mostró con la ayuda de cultivos de células a la participación de TGF-β en la regulación de la muerte celular programada. Por otra parte, el presente estudio muestra que las señales de TGF-β a través de Smad2, que coinciden con XIAP y Akt en la reglamentación y la inducción de la apoptosis.

Métodos
Reactivos

TGF-β1 (sc-146, lote # F262, 200 μ g / ml), TGF-β2 (sc-90, lote # B202, 200 μ g / ml) y TGF-β3 (sc-82, lote # A222, 200 μ g / Ml) de anticuerpos policlonales se compraron desde Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.). CDC47/MCM7 de anticuerpos se obtuvo de Medicorp (Montréal, QC, Canadá). Fosfatado Akt (Ser 473), Akt, XIAP, Cleaved caspasa-3, y Phospho-Smad2 (Ser 465 / 467) se obtuvieron a partir de anticuerpos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). La queratina 8 / 18 de anticuerpos utilizados para determinar la pureza de cultivo celular fue donado por el Dr Monique Cadrin (Univ. de Québec en Trois-Rivières, QC, Canadá). Anti-Smad2 / 3 de anticuerpos se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.). Vectastain ABC Kit de IgG de conejo se adquirió de Vector Laboratories Inc (Burlingame, CA, EE.UU.). In Situ Cell Death kit de detección (TUNEL), POD y DAB sustrato se obtuvo de Roche (Laval, Quebec, Canadá). TGF-β1 proteína recombinante se adquirió de Biosource (Cat # PHG9104, lote # 16865-01S, 5 μ g, diluido en 50 μ g / ml, QC, Canadá).

Animales

Sprague-Dawley, las ratas hembras, 200-225 g, se obtuvieron a partir de Charles River Laboratories Canadá. Los animales se mantuvieron en la norma chow y el agua, que se disponía ad libitum, en las instalaciones de iluminación de animales entre las 6:00 h y 20:00 h. Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales para la manipulación y la formación de los animales de laboratorio y de la Buena Salud y Cuidado de Animales Comité de la Université du Québec à Trois-Rivières. Ratones machos y hembras fueron acoplado noche a la mañana y la confirmación del embarazo fue determinado por frotis vaginal y / o la presencia de un tapón vaginal (día 1). Las ratas fueron muertos el día 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20 de embarazo a las 10:00 h de la mañana y a las 18:00 h para los días 5,5 y 6,5. Seis a 8 se utilizaron ratas diferentes para cada momento del embarazo. Uterino fueron recogidos y fijo para tinción inmunohistoquímica (IHC) y la detección de la muerte de las células apoptóticas por [TdT] mediada deoxyuridinetriphosphate nick de fin de etiquetado (TUNEL) o extractos de proteínas endometriales recogidas por Western blot.

Rat pretreatments decidua y cultivo de células del estroma endometrial

Un total de 10 ratas fueron ovariectomizadas y luego permitió recuperarse de la cirugía por un mínimo de 10 días. Ellos fueron pre-tratados con dosis fisiológicas de estradiol (1,3,5 (10)-Estratriene-3, 17 β-diol, Sigma-aldrich) y progesterona (Laboratoire Mat, PQ) para inducir decidualization como se describe anteriormente [26]: 1) 0,2 ug de inyección de estradiol por día durante tres días (por la mañana, día -2, -1 y 0), 2) En el tercer día (día 0 de pseudogestación), otro en la tarde de la inyección de estradiol (0,2 μ g) Y progesterona (1 mg) se ha realizado; 3) No tratamiento para 2 días (días 1 y 2 de pseudogestación), 4) Las inyecciones de estradiol (0,1 μ g) y progesterona (4 mg) durante tres días (días 3, 4 y 5 De pseudogestación); 5) Otra inyección de estradiol (0,1 μ g) en la tarde del día 7 (día 4 de pseudogestación); 6) Las ratas fueron muertos el día 8 (día 5 de pseudogestación). Todas las células del estroma endometrial recogidos para que las culturas se recuperaron a partir de las ratas tratadas con el protocolo descrito anteriormente.

Uterino fueron retirados y cuernos adoptadas y sumergido en HBSS solución que contenga HEPES (20 mM), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 μ g / ml) y fungizone (1,25 μ l / ml) (Invitrogen, ON, Canada) . Más manipulaciones se realizaron en un medio estéril. Los cuernos uterinos fueron trasladados en un estéril de Petri que contiene HBSS, hendidura longitudinal y sumergido en la solución de tripsina tipo I (0,3%) (Roche Diagnostics, QC, Canadá) en HBSS y agitada durante 60 minutos a temperatura ambiente. Cuernos uterinos fueron entonces a la máxima vortex por 5 segundos y contiene células epiteliales sobrenadante fue descartado. Cuernos uterinos fueron lavados tres veces con 2,5 ml de HBSS y sumergidos en una solución que contenga tripsina HBSS tipo I (0,03%), DNAse I (0,016%) y de la colagenasa tipo II (0,064%) durante 15 minutos a 37 ° C en un agua Bath. Cuernos uterinos fueron vortex en el máximo de 5 segundos. El sobrenadante que contiene las células del estroma fue trasladado en un tubo estéril halcón con 150 μ l de FBS DC (Dextran-Carbón vegetal extraído). Cuernos uterinos se lavaron dos veces con 2,5 ml de HBSS el sobrenadante y se mezclan con las células del estroma. Cuernos uterinos se descartan las células del estroma y se centrifuga a 1000 g durante 5 minutos. Las células fueron lavadas dos veces con HBSS y centrifugada. El sobrenadante fue descartado y se diluye con células MEDM-F12 (pH 7.1) (Invitrogen, ON, Canada), que contiene 2,438 g / L NaHCO 3, el 10% de SFB y DC gentamycine 50 μ g / ml. Las células fueron incubadas a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO 2. Las células se chapada en 6-así placas (placas Corning) a una densidad de 50% (4 × 10 5 células por así). El medio se cambió dos horas después de la primera incubación con el fin de eliminar la contaminación de células epiteliales de cultivos de células del estroma. La pureza de las células del estroma era más del 97%: cultivo de células de la contaminación con las células epiteliales se evaluó la morfología celular y por inmunofluorescencia utilizando un queratina 8 / 18 de anticuerpos. Tres a 5 días después de galvanoplastia (más del 90% de confluency cumplidos), las células fueron tratadas durante 24 horas en la presencia o ausencia de dosis crecientes de TGF-β proteína recombinante. Total de proteínas de cultivos de células tratadas fueron extraídas con TRIZOL (Invitrogen, ON, Canada). Para los análisis de Western blot, 15 μ g de proteína total se utilizó para cada análisis.

Tinción inmunohistoquímica

El útero se fijó en solución de paraformaldehído al 4% e incluidos en parafina. Muestras de tejido 7 μ m de espesor fueron montados en polylysine revestida de diapositivas, deparaffinized, rehidratada y, a continuación, se calienta en 10 mM citrato buffer (pH 6) en el tritón X-100 (Sigma-Aldrich) 0,1% (v / v). Después de dos lavados con PBS, diapositivas fueron incubadas con el 0,3% de peróxido de hidrógeno en metanol durante 30 min a la amortiguación por actividad peroxidasa endógena. Después de un lavado con PBS, los tejidos se incubaron con suero de bloqueo (Vectastain ABC Kit) a temperatura ambiente durante 1 h. Entonces, uno de los principales anticuerpos de bloqueo diluido en suero (TGF-β1, β2 o β3; dilución 1:50 o CDC47/MCM7; dilución 1:100) se agregó a las diapositivas y se incubaron a 4 ° C durante la noche en una cámara de humidificado. Tras el lavado de 5 min. En PBS, las secciones de tejido se incubaron durante 30 min. Con 3 μ g / ml con biotina de anticuerpos (anti-conejo o anti-ratón). Posteriormente, las diapositivas se lavaron con PBS y se incubaron con complejo avidina-biotina peroxidasa de rábano contiene reactivo para 30 min. Las láminas fueron lavadas con PBS durante 5 min y se logre el desarrollo de color usando sustrato DAB. Las secciones de tejido fueron counterstained con hematoxilina. Negativas de los controles se realizaron con el mismo protocolo, pero la sustitución de la primaria con anticuerpos IgG de conejo normal (Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, EE.UU.).

Inmunofluorescencia

Los tejidos se prepararon tal como se describe en la sección de inmunohistoquímica. Cleaved caspasa-3 fue diluido 1:100 de anticuerpos en el suero y el bloqueo de las diapositivas se incubaron a 4 ° C durante la noche. Después de lavar dos veces por 5 min. En PBS, las secciones de tejido se incubaron durante 30 min. A temperatura ambiente con 2 mg / ml burro Alexa Fluor 488 anti-conejo (1:50). Posteriormente, las diapositivas se lavaron con PBS y montadas. Negativas de los controles se realizaron con el mismo protocolo, pero la sustitución de la primaria con anticuerpos IgG de conejo normal. Las secciones fueron examinadas utilizando un microscopio OlympusBX60 equipado con un Coolsnap-pro CF cámara digital (Carsen Group, ON, Canada).

TdT-mediada deoxyuridinetriphosphate nick de fin de etiquetado (TUNEL)

Muestras de tejido fueron deparaffinized, rehidratada y enjuagarse con PBS. Ellos fueron incubadas con proteinasa K (20 μ g / ml) durante 30 min. A temperatura ambiente. Las láminas fueron lavadas dos veces con PBS, la peroxidasa endógena se apagará con el 0,3% de peróxido de hidrógeno en metanol durante 30 min. Las láminas fueron lavadas e incubadas con 10 mM solución de citrato de dos minutos sobre el hielo. A continuación, las secciones de tejidos fueron lavadas con PBS y se incubaron con TdT etiquetado reacción (In Situ Cell Death detección, POD) durante 30 min a 37 ° C en ambiente humidificado. Las láminas fueron lavadas tres veces en PBS y de las secciones de tejidos fueron bloqueadas con 3% BSA durante 20 min. A temperatura ambiente. Converter-POD solución se añadió a las diapositivas y se incubaron durante 30 min. A 37 ° C en ambiente humidificado. Las láminas fueron lavadas por 5 min. En PBS, el color se logre el desarrollo y el uso de sustrato DAB counterstained con hematoxilina. Negativas de los controles se realizaron con el mismo protocolo sin enzima TdT.

La extracción de proteínas y análisis Occidental

Proteína homogeneizado de embarazadas endometrio fueron aisladas de acuerdo con un protocolo previamente descrito [27]. En resumen, desde uterino Día 2 Día 20 a ratas preñadas fueron rápidamente colocados en excisedand helado salina hasta disecados. Uterino fueron cuidadosamente establecidos sobre una placa de cristal y se colocan en el escenario de un microscopio de disección. En el embarazo temprano (Día 2 a 5.5), el total de endometrio se raspó usando un microscopio de vidrio y recogidos. Uterino de Día 6 al 10 de la placenta y decidua estaban en una fase temprana de la diferenciación y confiable no se puede separar. Por esta razón, el PP dissectedfrom animales entre estos días de embarazo chorioallantoic contienen algunas células, pero antimesometrial decidua, choriovitelline tejidos, feto, y se eliminaron miometrio. A pesar de que el PP cuidadosamente disecados de estos tejidos, es una posibilidad de que una contaminación con algunos antimesometrial decidua retroceso de las células que forman la deciduas caspularis (DC) se produciría. Este es un hecho importante que debemos tener en cuenta. En uterino recogidos de Día de 12 a 20 ratas gestantes, el PP se aislaron suavemente por la separación de la placenta y miometriales regiones con 23 agujas de calibre. Además, el PP comenzó a retroceso en el Día 14 y se convirtió en demasiado delgada para después reliablydissect Día 17. El protocolo de aislamiento PP se describió anteriormente por Ogle y George [28].

De las células endometriales embarazadas animales fueron homogeneizadas utilizando una pipeta en RIPA buffer de lisis (1 × PBS pH 7,4, 1% Nonidet P-40; deoxycholate de sodio al 0,5%, 0,1% SDS; inhibidor de la proteasa Cocktail comprimidos (Roche Diagnostics Canadá, PQ)). Homogeneizado se centrifuga (12000 × g por 20 min a 4 ° C) para eliminar el material insoluble. El sobrenadante fue recuperado y almacenado a -20 ° C en espera de análisis. El contenido de proteína se determinó con el Bio-Rad DC Proteína de ensayo. Extractos de proteínas (50 μ g) fueron calentadas a 94 º C durante 3 min, resuelto en un 10% SDS-PAGE y electrotransferred a membranas de nitrocelulosa utilizando un semisecos de transferencia (Bio-Rad, Mississauga, ON). Las membranas fueron bloqueadas 2 h a temperatura ambiente con PBS que contenía 5% de leche en polvo, y luego incubadas con anticuerpos anti TGF-β 1-2-3 1:1000; P-Smad2 (Ser 465 / 467) 1:1000 y Smad 2 / 3 1:1000 y posteriormente con peroxidasa de rábano-conjugadas anti-conejo o anti-anticuerpo secundario del ratón (1:3000; temperatura ambiente durante 45 min). Todas las membranas fueron despojados con Restaurar la mancha occidental stripping buffer (Pierce, # 21059, lote # FH71541), reprobed con un anticuerpo específico para β-actina que se utilizó como patrón interno. Actividad peroxidasa se visualiza con la señal de Super ® West Femto máxima sensibilidad sustrato (Pierce, Arlington Heights, IL, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Señal fue visualizada utilizando el Biochemi Imaging System (OAR, CA, EE.UU.). Densitometrical Se realizaron análisis (la proteína de interés y β-actina) utilizando el GelDoc 2000, y la cantidad de software Uno (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). Los resultados se expresan como una proporción (proteína de interés / β-actina) para corregir la carga para cada muestra de endometrio.

Hoechst y la tinción de azul de tripan exclusión

Después de TGF-β tratamiento, tanto flotante y adjunta células fueron resuspendidos en PBS que contenía Hoechst 33258 durante 24 horas a 4 º C o resuspendido en solución de azul de tripan (0,4%) durante 5 minutos. Hoechst tinción nuclear fue visto y fotografiado usando un microscopio de fluorescencia Olympus BX60 y un Coolsnap-Pro CF Cámara digital (Carsen Group, ON, Canada). Las células con morfología típica de apoptosis nuclear (nuclear encogimiento, la condensación y la fragmentación) fueron identificados y contados seleccionados al azar utilizando los campos de diapositivas de fotografías numeradas, de los que el "contador" no tenía conocimiento de los tratamientos, a fin de evitar el sesgo experimental. Un mínimo de 200 células por grupo de tratamiento fueron contados en cada experimento. Para azul de tripan exclusión de prueba, azul células fueron contados bajo un microscopio ordinario y se cuentan como no vivos células.

Análisis estadístico

Occidental análisis de las hembras preñadas se repitieron seis a ocho veces (6 a 8 diferentes endometrial extracto de embarazo por día de 6 a 8 diferentes ratas). Endometrial extractos de cada rata se evaluaron individualmente. Occidental análisis de las células cultivadas decidua se repitieron 5 veces para cada TGF-β dosis (para cada cultura experimento, decidua células se recuperaron a partir de un grupo de diez ovariectomizadas / ratas tratadas). Resultados sometido a los análisis estadísticos se expresaron como media ± SEM. Los datos fueron sometidos a un solo sentido ANOVA (PRISM versión de software 4,0; GraphPad, San Diego, CA). Las diferencias entre los grupos experimentales se determinaron por el test de Tukey.

Resultados
Apoptosis expresión durante el embarazo

Con el fin de confirmar la presencia de apoptosis en el PP, la presencia de la forma activada de la caspasa-3 se determinó mediante Western análisis (Figura 1A] y la inmunofluorescencia (Figura 1B] utilizando un día 14 embarazadas uterino sección. TUNEL medición también se realizó con un día 14 embarazadas uterino sección (Fig. 1C]. Como lo demuestra el análisis occidental, Fig. 1A demuestra claramente que se presente la apoptosis en el endometrio a los 14 días: los 17 KDa cleaved caspasa-3 fragmento fue significativamente y aumentó gradualmente desde el día 8 y fue máximo a los 14 días. Cleaved fragmento caspasa-3 se observó en el citoplasma de las células apoptóticas como se ha demostrado por inmunofluorescencia (Figura 1B] y células TUNEL positivas también se encuentra en el en el endometrio a los 14 días (Fig. 1C].

Expresión de TGF-β1, β2 y β3 en la rata útero durante el embarazo

Para documentar la presencia y la expresión de TGF-β proteínas en el útero durante el embarazo, IHC y Western se realizaron análisis de las secciones sobre uterino y lisado de ratas gestantes respectivamente. Es importante documentar la presencia de TGF-β proteínas ya que la información que se encuentra en la literatura muestra principalmente mRNA expresión de las diferentes isoformas de TGF-β en determinados períodos del embarazo más que en todo el período de gestación. Western blot análisis se muestra en la figura 2 demuestran que el TGF-β1 y β2 son a la vez se expresa en un patrón similar. Su expresión se incrementa después de la implantación (días 5,5 a 6,5) y es máxima durante la regresión del PP (día 14, p <0.01). Sin embargo, la localización de la expresión de esos dos isoformas durante el embarazo es ligeramente diferente (Fig. 3 y 4, respectivamente): immunohistochemicals análisis confirma que en los primeros meses de embarazo, la señal se encuentra en las células epiteliales y del estroma, pero durante la última etapa del embarazo TGF-β1 Se expresa principalmente en las células del estroma TGF-β2 mientras que se encuentra en las células epiteliales. Es interesante ver que tanto TGF-β1 y β2 isoformas están claramente presentes en las células epiteliales y en el estroma en el momento de la implantación (día 5,5) alrededor de todo el lumen uterino en torno a la implantación de conceptus. Por el contrario, el TGF-β3 no se ha encontrado en los primeros meses de embarazo (Fig. 2 y 5]. Sin embargo, el TGF-β3 se incrementó y los presentes en el momento de la base de datos de regresión (días 12 a 16, p <0,001), lo que sugiere que su acción puede estar limitada a decidua regresión durante el embarazo.

Expresión de Smad2 y Phospho-Smad2 durante el embarazo

TGF-β transducción de señales intracelularmente está mediada por proteínas Smad, incluido el R-Smads (receptor regulado Smads incluidos Smad2), el I-Smads (inhibidor de Smads), y la Co-Smad (Smad común). El evento desencadenante en Smad es la activación del receptor de tipo I, dependiente de la fosforilación secuencial de los dos C-terminal de residuos de serina en Smads [29]. Por lo tanto, la fosforilación de la C-terminal de los receptores activados por Smads, especialmente Smad2, es fundamental para la iniciación de la señalización de TGF-β. Western blot análisis de Smad2 y fosfato Smad2 en lisado de células endometriales de ratas gestantes se llevaron a cabo para confirmar que el TGF-β isoformas presentes en el endometrio durante el embarazo tienen una actividad de las células. Los resultados demuestran que Smad2 expresión está regulada en todo el embarazo (Figura 6]. Su expresión es de alta desde el día 5 al 10 y se ha reducido drásticamente desde el día 12 hasta el final del embarazo (p <0,05). Sin embargo los niveles de fosfato Smad2, la forma activada, son altos en los días 12 y 14 y se reducirá gradualmente hasta el final del embarazo. La presencia de altos niveles de fosfato Smad2 se correlaciona con la alta expresión de las tres isoformas de TGF-β y la presencia de apoptosis, con una excepción el día 2 de embarazo (Figura 6]. A pesar de los altos niveles de fosfato Smad2 se observan, los niveles de TGF-β1 y -2 isoformas son más altos en comparación a los días 4 y 5 y la caspasa-3 cleaved fragmento también está presente.

TGF-β acción in vitro de las células del estroma endometrial decidua suerte

Como se ha demostrado previamente por Moulton en 1994 [7], TGF-β1 induce la división del ADN en las células de rata decidua. Para confirmar que el TGF-β1 es responsable de la inducción de la apoptosis, tres diferentes técnicas se utilizan para medir la apoptosis (Figura 7]. Hoechst tinción nuclear (Figura 7A] y TUNEL análisis (Figura 7C] demostró claramente que el TGF-β1 induce la apoptosis en una manera dosis-dependiente (p <0,0001). La apoptosis se aumentó a 20% en 1 ng / ml de TGF-β1, y hasta un 30% a los 10 ng / ml. Tinción de azul de tripan exclusión de ensayo se utilizó para la prueba de viabilidad y de la muerte de la célula, aunque esta prueba no es una prueba específica de apoptosis, que muestra un efecto directo del TGF-β1 sobre la viabilidad y la supervivencia celular. Un aumento dosis dependiente de la muerte de las células se observó en respuesta a TGF-β1 tratamiento (Figura 7B].

Efecto de la TFG-β sobre Akt, P-Akt, CDC-47 y XIAP expresión in vitro de las células del estroma endometrial decidua

Para determinar la forma más TGF-β podría actuar a nivel intra-celular para inducir la apoptosis en células decidua, los experimentos se llevaron a cabo para determinar la posible interacción del TGF-β y de la vía de supervivencia PI3K/Akt. Estudios recientes han demostrado que sugiere y TGF-β directamente con actos Smad3 para regular la sensibilidad a TGF-β indujo apoptosis [30, 31] y otro estudio mostró que el TGF-β ejerce un gran efecto inhibidor de la proliferación basal meningioma posiblemente a través de Smad 2 / 3 [32]. Desde Smad3 participa directamente en la señalización de TGF-β, un mecanismo similar podría ser involucrado en el control del destino celular decidua. Otro estudio ha demostrado que Akt, a su vez, la actividad podría verse afectada por la presencia o ausencia de inhibidor de la apoptosis, tales como las proteínas XIAP [33, 34]. La figura 8 muestra que Phospho-Smad2, la forma activada, han aumentado de manera significativa en respuesta a TGF-β1. Sin embargo, la relación concentración-respuesta en el plazo de Smad fosforilación parece ser bifásica, con 1 ng / ml estimulante, mientras que el 10 ng / ml tener un efecto significativo en comparación con el control (p <0,05), pero inferior al 1 ng / ml Dosis. No hubo diferencias significativas observadas en el plazo de Smad2 la expresión de la proteína en respuesta a TGF-β1. Como se ha demostrado en la Figura 8, el marcador de proliferación CDC-47 fue significativamente menor en respuesta a TGF-β1 tratamiento. Figura 9 demuestra que Phospho-Akt, la forma activa de Akt, fue altamente expresado en células de control, lo que indica que esta vía es activo e importante en la proliferación celular y la supervivencia celular. Sin embargo, en presencia del TGF-β1, Phospho-Akt fue significativamente menor que sugiere una interacción de TGF-β y de la vía de supervivencia PI3K/Akt. Total de la expresión de la proteína Akt no fue influenciado por TGF-β1 tratamiento. Además, la expresión de la proteína XIAP, un conocido inhibidor de la apoptosis de proteínas, se redujo significativamente en respuesta a dosis crecientes de TGF-β.

Discusión

Factor de crecimiento transformante-β isoformas han sido las que se sabe están expresadas y regulados de manera diferente en varios tipos de tejidos, tales como las especies ovina útero [35], carcinoma de colon humano [36] y en el concepto de la maternidad porcina interfaz [19]. También son reconocidas como factores pro-apoptóticos en muchos tipos de células fetales incluyendo hepatocitos de rata [14] y humanos leiomioma células musculares lisas [37]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de las isoformas de TGF-β en la rata útero durante el embarazo. El objetivo del presente estudio fue investigar los pro-apoptóticos funciones de TGF-β isoformas, en la rata útero durante el embarazo y también para determinar con más precisión los diferentes patrones de expresión de los isoformas en embarazadas endometrio. Los resultados presentados en este estudio demuestran que, como se observa en otros tejidos, TGF-β isoformas (β1, β2 y β3) son regulados en forma distinta rata útero durante todo el embarazo.

Es ya conocido que la apoptosis es inducida durante la implantación del embrión y decidualization en roedores [1, 2, 7]. Nuestros resultados confirman que la apoptosis es inducida en el útero de ratas embarazadas especialmente durante la regresión de la decidua basal. Las caspasas son bien conocidos verdugos de la apoptosis [15, 38]. La mayor concentración de cleaved proteína caspasa-3, la forma activada de la caspasa-3, fue encontrado el día 14 de embarazo, en el momento de la base de datos de regresión. La presencia activa de caspasa-3 demuestra que esta vía podría ser importante para inducir la división fundamental de la supervivencia y las proteínas para estimular aún más la apoptosis durante la regresión del PP. Sin embargo, la activación de la caspasa-3 se observó débilmente en el momento de su implantación y esto se podría explicar por el hecho de que, aunque sometido a la degeneración del epitelio uterino en la presencia de embrión [4 - 6], sólo algunas células epiteliales someterse a la apoptosis durante este proceso a Lugar de implantación. IHC y Western blot análisis podría no ser lo suficientemente sensibles como las técnicas para detectar la presencia de pequeños grados de cleaved caspasa-3 en células epiteliales en la implantación. Es también la posibilidad de que la degeneración del epitelio pueden requerir que las vías no-apoptóticos.

La búsqueda de la lógica de este estudio fue determinar la expresión de TGF-β isoformas durante esas etapas críticas del embarazo. Los resultados son consistentes con el trabajo previo publicado en relación a TGF-β isoformas en otros sistemas y en el útero de ratón [18, 22, 39], donde la expresión y la regulación es diferente para cada isoforma. TGF-β1, ya era conocido para inducir la apoptosis en humanos [40] y [7] rata de endometrio las células del estroma. En el presente estudio, el TGF-β1 y TGF-β2 se encontraron durante todo el embarazo y son especialmente fuerte durante las fases de apoptosis como la regresión de los PP. Por otra parte, utilizando los dos IHC y Western análisis, TGF-β3 proteína detectables en las primeras etapas de la gestación, lo que sugiere que TGF-β3 no se podrá exigir en la regulación de la muerte celular durante la implantación del embrión y el embarazo precoz. Este resultado apoya un estudio realizado por Das et al. [18] muestran que el TGF-β3 mRNA estuvo ausente durante las primeras etapas del embarazo. No obstante, los tres mamíferos formas de TGF-β se expresó enérgicamente durante la regresión del PP que sugiere que podrían jugar un papel importante en la regulación de la muerte celular programada a la regresión inducida de PP. Esos tres isoformas se expresan también diferente en distintas células de los tejidos de la misma; similitudes se han observado en humanos normales y malignas de las células epiteliales de próstata [39] como TGF-β2 y TGF-β3 son más expresados en las células epiteliales que en las células del estroma durante la tarde Embarazo. La fuerte expresión de TGF-β1 rata durante el embarazo precoz (día 5.5 a 6.5) puede explicarse por el hecho de que esta isoforma podría ser necesaria para iniciar los procesos de implantación del embrión durante el período periimplantation, una situación similar que se observa durante la invasión en el trofoblasto Momento de la implantación del embrión humano [41].

El siguiente paso lógico de este estudio fue determinar si el TGF-β isoformas presentes durante el embarazo se activa. Una gran cantidad de información en muchos sistemas fisiológicos en relación con TGF-β y sus receptores celulares [8, 10] y Smad las proteínas responsables de su señal de transducción intracelular [42 - 44]. Estudios recientes han demostrado que sugiere y TGF-β directamente con actos Smad3 para regular la sensibilidad a TGF-β indujo apoptosis [30, 31] y otro estudio mostró que el TGF-β ejerce un gran efecto inhibidor de la proliferación basal meningioma posiblemente a través de Smad 2 / 3 [32]. Desde Smad3 participa directamente en la señalización de TGF-β, un mecanismo similar podría ser involucrado en el control del destino celular decidua. Ya que es bien sabido que el TGF-β a través de las señales de las proteínas Smads, IHC y Western blot se realizaron análisis en embarazadas lisados de células endometriales a medida Smad2 y Smad2 fosfato (la forma activada) para poner a prueba esta hipótesis. Los resultados indicaron que la proteína aumentó Smad2 y más fuerte en el momento de la implantación del embrión y que Smad2 fosforilación fue aumentado gradualmente durante la regresión del PP, que se correlaciona con la presencia de TGF-β isoformas. Estos resultados sugieren que el TGF-β isoformas presentes durante estas dos etapas críticas del embarazo podría actuar a través de las proteínas Smads para inducir la apoptosis o inducir a otros genes que se sabe están regulados por TGF-β s. Smad2 proteína es relativamente baja durante la regresión del PP en comparación con las primeras etapas del embarazo. Este resultado es apoyado por un estudio reciente que muestra que el aumento de Smad2 expresión es probablemente causado por la invasión del trofoblasto resulta en la formación de la primera decidua zona [45]. Sin embargo, la fosforilación Smad2 no es tanto el aumento en los primeros meses de embarazo, en comparación con la última etapa del embarazo. Es de nuevo la posibilidad de que, dado que sólo se someten a apoptosis de las células epiteliales en el momento de la implantación del embrión, el posible aumento de la fosforilación de Smad2 inducida por TGF-β sólo puede ser observado en un pequeño número de células que es indetectable con las técnicas utilizadas.

Para entender mejor el efecto de TGF-β en el nivel celular, decidua cultivos celulares se utilizaron para investigar más a fondo la interacción de TGF-β y el PI 3-K/Akt vía de la supervivencia. Aunque un estudio reciente, la posibilidad de que las células obtenidas a raíz de decidualization artificiales podrían ser diferentes de los obtenidos de animales embarazadas [46], este modelo es una excelente alternativa para obtener material suficiente para poner a prueba el papel de TGF-β y que se correlaciona con los datos La situación fisiológica. Se ha demostrado recientemente que la fosforilación de Akt es directamente inducida por 17 β-estradiol en el útero de ratas ovariectomizadas los esteroides sexuales, lo que indica que tienen una importante influencia en el destino de células de endometrio [47]. Muy recientes estudios han demostrado que el TGF-β puede bloquear directamente la actividad a través de Akt Smad activación [30]. Así, las células del estroma decidua fueron tratados con diferentes dosis de TGF-β1, para determinar si Smad de activación, a su vez, podría bloquear Akt supervivencia vía para inducir la muerte celular. TGF-β1 induce la fosforilación de Smad2 del estroma endometrial de células cultivadas in vitro y desencadenó la apoptosis en una forma dependiente de la dosis, que fue acompañado de una reducción de la proliferación celular, lo que confirma TGF-β como un factor de apoptosis, en la rata decidua células del estroma endometrial. En respuesta a TGF-β1, la fosforilación de Akt fue significativamente menor que indica que la actividad de inhibición de Akt podría ser un importante mecanismo de TGF-β en la apoptosis inducida por este modelo. Otros estudios han demostrado que la actividad de Akt, a su vez, podría verse afectado por la presencia o ausencia de inhibidor de la apoptosis, tales como las proteínas XIAP [33, 34] y cIAP-1 [48]. Los resultados apoyan la hipótesis de que el TGF-β Smads acción a través de actos no sólo en el nivel transcripcional de inducir la producción de factores de apoptosis en las células decidua, sino también a nivel de proteínas para bloquear la activación de factores de supervivencia.

Fosforilación de Akt acaba de poner de manifiesto que se rige por XIAP, un conocido inhibidor de la apoptosis de proteínas, en el ovario humano superficie de las células epiteliales y células de la granulosa, en la rata [33, 34]. Los presentes resultados muestran una posible interacción (directa o indirecta) entre el TGF-β1, y la expresión de la proteína XIAP. TGF-β1 reducido XIAP expresión in vitro en una forma dependiente de dosis. Estudios recientes han demostrado que XIAP puede actuar como un cofactor en la regulación de la expresión génica inducida por el TGF-β y es independiente de Smad4 [14, 49]. Debido a la reducción de TGF-β1 Akt fosforilación XIAP y que se muestra para inducir la fosforilación de Akt [34], es posible que la acción de TGF-β, en este caso, podría ser a través de la activación Smad2 y XIAP la expresión de genes que, a su vez, actuar en la fosforilación Akt. Más experimentos será necesario tener una mejor comprensión de las interacciones entre el TGF-β y Akt vía de supervivencia. En particular, ¿cómo actuar en Smads específicamente XIAP expresión XIAP y cómo actúa en la vía de supervivencia PI 3-K/Akt actividad. Otros factores, como Smac / Diablo, un inhibidor de XIAP intracelular, que se demostró como se regula en un 17 β-estradiol en la rata durante el ciclo estral [50], también podría ser un candidato putativo de regulación de la actividad TGF-β en la decidua células.

Conclusión

En conclusión, este estudio demuestra que las tres isoformas de TGF-β son localizados diferente y regulado en las células del endometrio de las mujeres embarazadas, las ratas, sobre todo en el momento de la implantación y de regresión de los PP. El presente estudio también mostró que el TGF-β juega un papel importante en el control de la supervivencia celular y la muerte celular y que puede interactuar con el PI 3-K/Akt vía de la supervivencia a través de la activación Smad para permitir la inducción de la apoptosis. Más estudios serán necesarios para entender con mayor precisión el efecto de otros Smads y / o co-Smads durante las proteínas TGF-β inducida por apoptosis. Otras investigaciones también será necesaria para comprender mejor las funciones específicas de TGF-β2 y TGF-β3 intracelular y en el nivel molecular in vitro para determinar la forma y si estas isoformas de control de la supervivencia celular a través de la señal Smad transductores.

Contribuciones de los autores

CS redactado el documento. CS, PLC, GFF, VL y MCD realizaron los experimentos. EA concibe el estudio, participaron en su diseño y coordinación, y escribió la versión final del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido apoyado por una beca de NSERC (238501-01). Eric Asselin es un chercheur-boursier de la Fond de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) y Nueva Investigador del Instituto Canadiense de Investigación en Salud de Canadá (CIHR). Marie-Claude Déry es destinatario de un FRSQ y NSERC becas. Agradecemos a la Sra Rollande Caron por la contribución de su valioso tiempo y experiencia a nuestros proyectos. Damos las gracias también a la Sra Sophie Parent y la Sra Daphne esfuerzo de revisar el manuscrito.