Filaria Journal, 2005; 4: 4-4 (más artículos en esta revista)

Dietilcarbamazina actividad contra Brugia malayi microfilarias depende de inducible de la sintetasa del óxido nítrico y de la vía de la ciclooxigenasa

BioMed Central
Helen F McGarry (hfcross@liverpool.ac.uk) [1], Leigh D Vegetales (ldplant@uchicago.edu) [1], Mark Taylor J (mark.taylor @ liverpool.ac.uk) [1]
[1] Filariasis Laboratorio de Investigaciones, Bioquímicas y Parasitología Molecular, Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, Liverpool L3 5QA, UK

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Resumen
Antecedentes

Dietilcarbamazina (DEC) ha sido utilizada durante muchos años en el tratamiento de la filariasis linfática. Su modo de acción no es bien conocida, pero se sabe que interactúan con el ácido araquidónico vía. Aquí hemos investigado la contribución del óxido nítrico y la ciclooxigenasa (COX) itinerarios de la actividad de DEC contra B. Malayi microfilarias en ratones.

Métodos

B. malayi microfilarias fueron inyectados por vía intravenosa en ratones y parasitemia fue medida 24 horas después. DEC fue administrado a ratones BALB / c con y sin tratamiento previo con dexametasona o indometacina y la parasitemia vigilancia. Para investigar el papel de óxido nítrico inducible en la actividad de DEC, DEC e ivermectina se administró a microfilaremia iNOS - / - ratones y sus antecedentes cepa (129/SV). Western blot se utilizó para determinar cualquier efecto de DEC de la producción de la COX-y inducible de óxido nítrico sintasa (iNOS) proteínas.

Resultados

DEC es administrada a ratones BALB / c dio lugar a una rápida y profunda reducción de microfilarias que circulan dentro de los cinco minutos de tratamiento. Microfilarial niveles comenzaron a recuperarse después de 24 horas y regresó a cerca de los niveles pre-tratamiento dos semanas más tarde, lo que sugiere que el secuestro de microfilarias parásito se produce independientemente de asesinato. Pre-tratamiento de los animales con dexametasona o indometacina DEC reducido la eficacia en casi un 90% o 56%, respectivamente, en apoyo de una función para el ácido araquidónico y de las vías de la ciclooxigenasa in vivo. Además, los experimentos mostraron que el tratamiento con DEC resultados en la reducción de la cantidad de la proteína COX-1 en células de exudado peritoneal. Además, en iNOS - / - ratones infectados con B. Malayi microfilarias, DEC no mostró actividad, mientras que la eficacia de otro fármaco antifilárico, la ivermectina, no fue afectado.

Conclusión

Estos resultados confirman el importante papel de la vía metabólica del ácido araquidónico en DEC del mecanismo de acción en vivo y demostrar que, además de sus efectos sobre el 5-lipoxygenase pathway, metas y la vía de la ciclooxigenasa COX-1. Además, se muestra por primera vez que el óxido nítrico inducible es esencial para el rápido secuestro de microfilarias por DEC.

Antecedentes

Citrato de dietilcarbamazina (DEC), ha sido utilizado en el tratamiento y control de la filariasis linfática (causada por la nematodos Wuchereria bancrofti, Brugia malayi y B. timori) desde 1947 y sigue desempeñando un papel importante, siendo uno de los fármacos utilizados en la Programa Mundial de la Eliminación de la Filariasis Linfática [1]. Sin embargo, a pesar de este largo período de uso, la DEC del modo de acción aún es poco conocido. Especialmente intrigante es el marcado contraste entre su rápida acción en vivo y la falta de actividad significativa in vitro. In vivo, la respuesta es rápida: a los pocos minutos de tratamiento, la sangre periférica microfilarias cuenta de manera espectacular caída [2]. Los pobres actividad in vitro indica que probablemente requiere DEC algunos de acogida factor para su actividad, y el trabajo previo ha puesto de relieve el papel del sistema inmune innato y leucocitos independiente de las células T y complemento en la actividad de DEC [3, 4].

DEC también tiene propiedades anti-inflamatorias, como resultado de su interferencia con el metabolismo del ácido araquidónico [4]. Los productos de la vía metabólica del ácido araquidónico, eicosanoids, tienen una serie de efectos biológicos, incluida la inhibición de la agregación plaquetaria; regulación de la activación y la adhesión leucocitaria; mediación de los granulocitos quimiotaxis y degranulación, y la promoción de la vasodilatación [5]. Es bien sabido que DEC inhibe las enzimas de la ruta 5-lipoxygenase, leucotrienos synthases [6, 7]. Además, in vitro, DEC bloquea la producción de células endoteliales de la ciclooxigenasa (COX) vía productos prostaglandina (PG) E 2, la prostaciclina (PGI 2) y el tromboxano A 2, pero no tiene ningún efecto en la producción de plaquetas prostanoid [8]. Además, el fármaco aumenta la tasa y el grado de adhesión a microfilarias granulocitos, con la adhesión de eosinófilos está aumentada en particular [9 - 11]. Sin embargo, el papel de algunas de estas actividades aún no se ha demostrado in vivo y por lo que hemos utilizado un modelo de ratón para identificar la máquina factores responsables de la rápida eficacia de la DEC.

El itinerario incluye el ácido araquidónico y lipoxygenase enzimas ciclooxigenasa. La vía de la COX tiene similitudes con el óxido nítrico (NO) vía, ya que ambos han isoformas inducibles y constitutivas de sus enzimas y son reguladores clave de respuestas inflamatorias [12, 13]. Las vías de la COX y NO se sabe que interactúan entre sí, con la existencia de 'cruzada hablar' entre NO / PGE 2 y iNOS / COX, que es generalmente estimulante, pero también puede ser inhibitoria [14, 15]. Por lo tanto, hemos utilizado una combinación de inhibidores farmacológicos y knockout de la tecnología de genes, para aclarar el papel de estas dos vías de DEC en la actividad in vivo.

Materiales y métodos
Parásitos y ratones

Microfilarias de Brugia malayi TRS se obtuvieron de los laboratorios (Georgia, EE.UU.), suspendido en RPMI 1640 con 5% FCS, y 300000 parásitos en un volumen de 200 μ l se inyecta por vía intravenosa en ratones. Sistémico parasitemia se permitió a equilibrar durante 24 horas, luego heparinizado muestras de sangre fueron tomadas por la cola y el sangrado se midió la parasitemia. Los animales fueron asignados a la edad y el tamaño de los grupos acompañados y tratados como se describe a continuación. Todos los animales se mantuvieron en la Unidad de Servicios de Biológicas de la Universidad de Liverpool, de conformidad con los reglamentos y la Oficina central y regado fueron alimentados ad libitum. Ratones BALB / c fueron mantenidas bajo condiciones estándar, y el knockout 129/SV y con objetivos de la gen iNOS (iNOS - / -, proporcionado amablemente por el Prof FY Liew, de la Universidad de Glasgow) en el filtro de las cepas-top jaulas.

Acción de DEC en contra de microfilarias in vivo en ratones

Tres ratones BALB / c infectados con B. Malayi microfilaremia fueron tratados con una única dosis oral de DEC 100 mg / kg [3] (Sigma, Reino Unido) en agua destilada y la parasitemia supervisado de cinco minutos a dos semanas después del tratamiento. Para investigar el papel de la vía metabólica del ácido araquidónico en el modo de acción de DEC, indometacina (10 mg / kg en el 1% de etanol), soluble en agua dexametasona (3 mg / kg en el agua, ambos obtenidos de Sigma, Reino Unido), O vehículo fue dada por intra-peritoneal (ip) a la inyección de microfilaremia masculino ratones BALB / c 30 minutos antes de la administración oral DEC (100 mg / kg, tres ratones por grupo de tratamiento). Un animal se mantuvo como un control sin tratar. Heparinizado se tomaron muestras de sangre a intervalos después del tratamiento para la medición de la parasitemia. Los experimentos se repitieron tres veces.

El requisito de inducible NO DEC en la eficacia se determinó en iNOS - / - ratones. DEC (100 mg / kg) o vehículo se administra por vía oral a tres mujeres iNOS - / - ratones o sus antecedentes cepa, 129/SV. Los ratones fueron cola-desangrado a intervalos regulares después de los tratamientos para la evaluación de la parasitemia. Para probar la eficacia de otro filarial anti-drogas, la ivermectina, en estos ratones, la ivermectina fosfato (1 mg / kg en 1% DMSO) fue administrada por inyección ip. Este experimento se repitió tres veces.

Expresión de la COX-1, COX-2 y iNOS en DEC-peritoneal expuesto células de exudado

Hombres y 129/SV iNOS - / - Los animales fueron inoculados ip con 10 mg / kg en DEC endotoxina libre de agua o 100 μ l de agua libre de endotoxinas (tres ratones en cada grupo). Después de 30 minutos, exudado peritoneal células fueron recogidas en PBS estéril con 1 g / L de glucosa, 1% de albúmina sérica bovina y 1 U / ml de heparina. Las células fueron lisadas pildoradas y en 1 ml de reactivo TRI (Sigma, Reino Unido), proteína extraída según el protocolo suministrado.

Por Western blot, 10 μ g de cada proteína se separaron en un 7,5% desnaturalización SDS gel de poliacrilamida y borró a 0,45 μ M tamaño de poro de membrana PVDF (Immobilon P, Micropore, Reino Unido). Tras el bloqueo de la noche a 4 ° C en el bloque de amortiguación (1% caseína en PBS/0.1% Tween) y en el lavado de PBS/0.1% Tween, las membranas fueron incubadas durante 1 hora en conejo anti-ratón COX-1, COX-2 o iNOS IgG policlonal (Cayman Chemical Co, Alexis Corporation, UK) diluido a 1 en 5000 en el bloque de amortiguación. Los anticuerpos anti-COX no mostró reactividad cruzada con la isoforma contrario, mientras que el anticuerpo anti-iNOS mostraron sólo el 5% de reactividad cruzada contra la nNOS y ninguno en contra eNOS. Membranas fueron lavadas e incubadas durante 1 hora en cabra anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa caballo rábano (nórdicos, Países Bajos) a diluirse entre 1 en 20000 y 1 en 100000, en función del anticuerpo primario, seguido por el lavado de más. El electrochemiluminescent reactivo SuperSignal West (Pierce Perbio, Reino Unido) se utiliza para visualizar las bandas de rayos X en las películas.

Análisis estadístico

Parasitemia datos se expresaron como porcentaje de pretratamiento microfilarias o como un porcentaje de control sin tratar microfilaraemias por 100 μ l de sangre y se analizaron por los dos colas la prueba t de Student. Valores de P <0,05 se consideraron significativas.

Resultados
Acción de DEC en contra de microfilarias in vivo en ratones

En ratones BALB / c tratados con DEC solo, microfilaremia niveles se redujeron en cinco minutos con una reducción sostenida durante al menos 60 minutos después del tratamiento (Fig. 1]. Sin embargo, 24 horas después del tratamiento, los niveles microfilarial ha recuperado parcialmente y dos semanas más tarde que habían regresado a niveles cercanos a los pre-tratamiento (Fig. 1]. Experimentos posteriores se centró en la rápida actividad de DEC más de la primera a segunda hora. Ni vehículo, la indometacina ni por sí mismo dexametasona tenido ningún efecto en la microfilaremia en ratones BALB / c (datos no presentados). Sin embargo, en ratones previamente tratados con indometacina o dexametasona, microfilaraemias se redujeron sólo en un 11% (dexametasona) o 44% (indometacina), de los controles no tratados a los 60 minutos después DEC administración (Fig. 2]. Las diferencias con respecto a la DEC-grupo sólo fueron estadísticamente significativas para todos los puntos temporales de indometacina (P <0,004) y de 15 y 30 minutos después de la dexametasona para el tratamiento (P <0,017) la validez de los tratamientos.

DEC administración también rápidamente reducido microfilaraemias en 129/SV ratones, pero, en cambio, no tuvo ningún efecto sobre los niveles de microfilarias en iNOS - / - ratones, en la que microfilaremia se mantuvo en los niveles pre-tratamiento durante al menos 2 horas (Fig. 3a], Sin diferencia significativa sin tratar de iNOS - / - controles (P> 0,887 para todos los puntos de tiempo). En contraste, la ivermectina es eficaz en ambos 129/SV y iNOS - / - ratones (Figura 3b], a pesar de que tuvo un lento inicio de la acción de DEC. Sin embargo, 24 horas más microfilarias no se detectó en ninguno de los dos cepas de ratón dado la ivermectina.

Expresión de la COX-1, COX-2 y iNOS en DEC-peritoneal expuesto células de exudado

Treinta minutos después de la administración de endotoxina libre de agua a 129/SV y iNOS - / - ratones, exudado peritoneal células expresaban la proteína COX-1, mientras que los de los animales expuestos DEC-figura notablemente menos la COX-1 (Fig. 4]. Curiosamente, parece haber un nivel más alto de la COX-1 que permanecen en la iNOS - / - que después de la 129/SV macrófagos DEC tratamiento. Ni la COX-2, ni iNOS proteína se detectó en ninguno de los 129/SV o iNOS - / - grupos (no se muestra).

Discusión

Aquí hemos utilizado un modelo murino para dilucidar los procesos en el mamífero hospedador, que contribuyen a la rápida DEC in vivo la acción. La participación de la interacción de dos vías, la ciclooxigenasa y óxido nítrico inducible vías, se muestra la actividad de mediación de DEC in vivo.

El tratamiento de ratones con DEC dio lugar a una rápida reducción de la microfilaremia. Esta reducción, sin embargo, fue transitoria y microfilaremia comenzó a recuperarse 24 horas después del tratamiento, con casi plena restauración a los niveles pre-tratamiento dos semanas después del tratamiento. Esto ha sido observado con anterioridad en otros modelos [16, 17], y sugiere que la desaparición de las microfilarias de la circulación periférica y su secuestro en el sistema vascular central ocurrir independientemente de parásito asesinato. Un curso de la prolongada DEC tratamiento de la B. Malayi ratones infectados llevado a la reducción sostenida de microfilarias que circulan por lo menos 30 días [18].

Los resultados confirman hallazgos anteriores que muestran que un importante objetivo de la DIC es la vía metabólica del ácido araquidónico. La inhibición en la primera etapa en el camino por la dexametasona, que inhibe la fosfolipasa A2, suprimió casi por completo la actividad de DEC, mientras que la inhibición de la ciclooxigenasa las enzimas COX-1 y COX-2 por la indometacina redujo su eficacia en un 56%, lo que indica que además A su bien documentada la inhibición de la 5-lipoxygenase pathway [6, 7], DEC actúa en la vía de la ciclooxigenasa. Hemos demostrado que por lo menos una forma en que lo hace en vivo es por la pérdida de la COX-1 de proteína dentro de los 30 minutos de su administración.

La falta de actividad de DEC en ratones deficientes en iNOS identifica un novedoso sistema enzimático que participan en la actividad in vivo de DEC. Previamente hemos demostrado que B. Malayi microfilarias son susceptibles de óxido nítrico in vitro [19]. Sin embargo, no se encontraron pruebas de que hasta la propia DEC-iNOS actividad regulada, ya sea in vitro (no se muestra) o in vivo, de acuerdo con Rajan et al. [20], quien no encontró ninguna inducción de la liberación de NO murino macrófagos o células endoteliales ratas tratadas con DEC. Por lo tanto, parece probable que iNOS ejerce un efecto sobre la actividad DEC a través de su interacción con cyclooxygenases, una idea apoyada por la reducción de la pérdida de la proteína COX-1 en exudado peritoneal células derivadas de iNOS - / - ratones. Varios estudios han demostrado que el NO y iNOS interactuar con las enzimas COX a causar un aumento de la actividad enzimática [21] y, por consiguiente, el aumento de la síntesis de prostaglandinas [22 - 25], a pesar de grandes cantidades de NO endógeno inhibe la COX expresión y actividad en macrófagos murinos [26] . Una explicación de los efectos diferenciales de NO sobre la actividad de la COX puede referirse a los efectos en diferentes isoformas de la COX. Por ejemplo, NO puede activar la COX-1 en fibroblastos, sino inhibir la COX-2 en la misma celda [15]. Aunque nuestros estudios, no se distingue entre la función de la COX-1 y COX-2 en la actividad de DEC, la rápida actividad de DEC secuestro y el agotamiento de la proteína COX-1 sugieren un papel para la COX-1. COX-1, pero no la COX-2 es esencial para la pronta producción de prostaglandinas de macrófagos y mastocitos [27, 28]. Otros estudios sobre ratones deficientes en isoformas COX o el uso de la isoforma específica de los inhibidores farmacológicos podría abordar esta cuestión. Varios polimorfismos en el gen iNOS humanos se han descrito y que están asociados con una variedad de enfermedades, como el paludismo [29 - 31] y la hipertensión [32], sino que sería interesante saber si estos u otros polimorfismos afectados DEC respuesta a la terapia.

Nuestros hallazgos podrían ayudar a ampliar nuestra comprensión de los mecanismos celulares implicados en los procesos que conducen a secuestro y la posterior muerte de los parásitos. Además de la elevación de la adhesión de granulocitos, plaquetas también se han mostrado a obligar a matar y microfilarias [33]. En vista de la famosa efectos de NO y prostaglandinas sobre la función plaquetaria y pruebas que sugieren la presencia de NO inducible en las plaquetas humanas [34, 35], el papel de las plaquetas en el secuestro y asesinato de parásitos debe ser re-evaluado in vivo.

Filarial parásitos también producen y liberan prostanoides, incluida la PGE 2, PGI 2 y PGD 2 [36 - 41], que den lugar a la inhibición de la agregación plaquetaria [40], vasodilatación de los vasos sanguíneos y supresión inmunológica, y puede contribuir a la persistencia a largo De estos parásitos en sus huéspedes naturales [41]. Este prostanoid producción también es inhibida por DEC [8]. Significativamente, no producen tromboxano A 2 [36]. En contraste con los sistemas de mamíferos, en la que eicosanoid formación es a menudo en respuesta a la estimulación inducida por agonista, microfilarias producir prostanoides constitutivamente [36], pero los mecanismos por los que lo hacen aún no han sido descritas en detalle, aunque una glutatión S-transferasa De la O. Vólvulo sintetiza PGD 2 de PGH 2 [39]. No está claro si los actos DEC predominantemente contra los prostanoides del gusano o de la acogida. La falta de efecto directo de la dexametasona y la indometacina en la microfilaremia sugiere que estos fármacos o no influencia prostaglandinas parásito in vivo o que si lo hacen, no están implicados en el secuestro de mediado-DEC. Nuevos estudios que involucran la inhibición de las enzimas clave del parásito se debe determinar el papel de los parásitos en prostanoides derivados de la actividad DEC. Estudios recientes han informado de una actividad directa de DEC contra Wuchereria bancrofti microfilarias que se traduce en exsheathment, orgánulos daños y cytolysis [42], que se producen tanto in vitro como in vivo sugieren que la DEC y pueden tener un efecto directo sobre los gusanos, además de su interacción Acogida con derivados de las vías como se informó aquí.

Queda mucho por descubrir del modo de acción de la DEC. ¿Qué mecanismos llevan a matar tras el secuestro del parásito en la vasculatura central, y ¿cómo se relaciona esto con la paradójica apariencia de microfilarias en la circulación periférica que sigue a la 'DEC prueba de provocación'? ¿Cuál es el papel de anfitrión de la inmunidad y los efectos sobre los gusanos adultos en la eficacia a largo plazo de DEC? Este modelo debe ser una herramienta de gran alcance para hacer frente a estas y otras preguntas más sobre los misterios de esta droga esquiva.

Conclusión

Óxido nítrico sintasa inducible y de la vía de la ciclooxigenasa se consideran esenciales para la actividad de DEC in vivo. Junto con su bien documentada la actividad en la vía lipoxygenase, DEC administrado in vivo reducción de la cuantía de la acogida de la COX-1. Además de la aclaración de DEC mecanismo de acción de este modelo murino podría proporcionar una comprensión más clara de la interacción entre el óxido nítrico y la ciclooxigenasa y las vías celulares y moleculares acontecimientos en el lugar del secuestro.

Lista de abreviaturas

DEC, citrato de dietilcarbamazina; COX, ciclooxigenasa; ip, intra-peritoneal; PG, prostaglandinas; IGP 2, prostaciclina; NO, óxido nítrico; iNOS, inducible de la sintetasa del óxido nítrico.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

HFM asistencia en la experimentación in vivo, realizó la detección de Western blot, analizado e interpretado los resultados, llevado a cabo el análisis estadístico y escribió el manuscrito. LDP la parasitemia datos recogidos y asistidos con los experimentos in vivo. MJT concibe el estudio, realizado los experimentos in vivo, interpreta los resultados y asesoramiento sobre el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

MJT con el apoyo de un superior de Wellcome Trust de Becas en Ciencias Biomédicas Básicas. LDP fue financiado por la Universidad de Liverpool Fondo de Desarrollo de la Investigación. Damos las gracias al Prof FY Liew (Universidad de Glasgow) de la prestación de los iNOS - / - ratones.