Proteome Science, 2005; 3: 4-4 (más artículos en esta revista)

Proteome análisis de una cepa recombinante Bacillus megaterium heteróloga durante la producción de una glucosiltransferasa

BioMed Central
Wang Wei (wwa@gbf.de) [1], Rajan Hollmann (rho@gbf.de) [1], Tobias Fürch (tfu04@gbf.de) [1], Manfred Nimtz (mni@gbf.de) [2 ], Marco Malten (m.malten @ tu-bs.de) [3], Dieter Jahn (d.jahn @ tu-bs.de) [3], Wolf-Dieter Deckwer (wdd@gbf.de) [1]
[1] TU-BCE, el alemán del Centro de Investigación de Biotecnología, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig, Alemania
[2] Departamento de Biología Estructural, el Centro Alemán de Investigación de Biotecnología, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig, Alemania
[3] Instituto de Microbiología, Universidad Técnica de Braunschweig, Spielmannstrasse 7, D-38106 Braunschweig, Alemania

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Resumen

Un recombinante B. Megaterium cepa se utiliza para la producción heteróloga de una glucosiltransferasa (dextransucrase). Para entender mejor las respuestas fisiológicas y metabólicas de la célula huésped y la inducción a las condiciones de cultivo, proteómicos análisis fue llevado a cabo por uso combinado de dos dimensiones electroforesis en gel y espectrometría de masa (2-DE/MS) para la separación e identificación de proteínas.

2-DE método fue optimizado para la separación de las proteínas intracelulares. Dado que el genoma de B. Megaterium todavía no está disponible, péptido péptido fragmento de la secuencia utilizando la información obtenida de nanoelectrospray ionización cuadripolares-tiempo de vuelo de espectrometría de masas en tándem (ESI-QqTOF MS / MS) se aplicó para la identificación de proteínas. 167 spots de proteínas fueron identificadas como 149 proteínas individuales, entre ellos la mayoría de las enzimas que participan en las rutas metabólicas centrales de carbón y muchas enzimas relacionadas con la síntesis de aminoácidos y la síntesis de proteínas. Con base en los resultados de 2-DE mapa de referencia y la correspondiente base de datos de proteínas se construyeron para más proteómicos enfoques sobre B. Megaterium.

Por primera vez fue posible llevar a cabo análisis comparativos sobre proteómicos B. Megaterium en un lote crecido en la cultura de glucosa con xilosa dextrasucrase inducción para la producción. No se observaron diferencias significativas en los cambios de expresión de las enzimas de la glicolisis y TCA ciclo, lo que indica que dextransucrase producción, que ascendió a sólo el 2% de toda la producción de proteínas, no impone notables metabólicas o cargas energéticas en la central de la vía metabólica de carbono De las celdas. Sin embargo, a corto plazo, sobre regulación de la aspartato aminotransferasa, una enzima dextransucrase estrechamente relacionadas con la producción, inducido en la cultura demostrado la viabilidad de utilizar 2-DE dextransucrase método para la vigilancia de la producción. También se observó que en virtud de las condiciones de cultivo utilizadas en este estudio B. Megaterium tendido a canal acetil-CoA en vías de polyhydroxybutyrate producción. No se encontraron expresión aumenta con citosólicas como chaperones DnaK y GroEL durante dextransucrase producción y secreción, mientras que una fuerte sobre regulación de la proteína de unión oligopeptide-OppA se observó en correlación con un aumento de la secreción de dextransucrase en el medio de cultivo.

Antecedentes

La bacteria Gram-positivas B. Megaterium se ha demostrado como una prometedora de acogida para la producción de diversas vitaminas y proteínas heterólogas, debido a sus propiedades intrínsecas favorables como la baja actividad de la proteasa y de la secreción de alta capacidad [1]. Usando recombinante B. Megaterium cepas para la producción heteróloga de una glucosiltransferasa, a saber dextransucrase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, ha sido objeto de la investigación y la mejora de la producción y secreción de dextransucrase se logró en comparación con la producción de dextransucrase recombinante en E. coli [2]. Dextransucrase puede utilizarse para catalizar reacciones de polimerización para la producción de dextrano. Dextrano es ampliamente utilizado como un sustituto de sangre o plasma como un material de apoyo básico cromatográfico.

Para optimizar el cultivo de células y los procesos de producción de proteínas recombinantes, es importante comprender las respuestas fisiológicas y metabólicas de la célula huésped para el cultivo y las condiciones de inducción. Con este fin se realizó un análisis proteómicos con un recombinante B. Megaterium cepa. A diferencia de Bacillus subtilis, que es el mejor caracteriza bacteria Gram-positivas con su genoma ya secuenciado completamente en 1997 [3] y proteómicos amplio análisis que se ha realizado desde [4 - 6], el genoma de B. Megaterium todavía no ha sido secuenciado a nuestro conocimiento y no hay información sobre el análisis proteómico de la B. Megaterium se ha publicado. En este trabajo, por primera vez, de un análisis proteómicos recombinante B. Megaterium cepa basa en dos dimensiones electroforesis en gel en combinación con técnicas de espectrometría de masas (2-DE/MS) para la separación y caracterización de proteínas se llevó a cabo. Proteómica comparativa se realizó un análisis para estudiar la expresión de la proteína celular cambios relacionados con el cultivo y la inducción define las condiciones para la producción recombinante de dextransucrase por la recombinante B. Megaterium cepa.

Resultados y discusión
1. Proteome cartografía de la cepa B. Megaterium MS941dsrS MS941dsrS por 2-DE/MS

Los métodos utilizados para el trazado de mapas de proteómicos B. Megaterium son la caracterización de la expresión de la proteína cambia por 2-DE y la identificación de proteínas de interés de los Estados miembros. Esto tiene por objeto el establecimiento de una red funcional metabólico de la B. Megaterium, especialmente los que participan en el metabolismo central de carbono, la biosíntesis de aminoácidos y biosíntesis de proteínas, así como la identificación de las vías metabólicas y celulares procesos estrechamente relacionados con la producción y secreción de la proteína recombinante. La figura 1 muestra una típica imagen de 2-DE separación de las proteínas intracelulares de B. Megaterium en el rango de pH de 4-7. Cuando 250 μ g de proteína de una muestra se aplicaron, alrededor de 580 - 800 spots proteína puede ser detectada en los diferentes geles coomasie después de la tinción, Los anuncios coincidentes entre los distintos tipos de geles fueron entre el 58% y el 75%.

2. Lote de cultura de la B. Megaterim cepa MS941dsrS MS941dsrS recombinante para la producción dextransucrase

Nuestro estudio anterior sobre las culturas del lote B. Megaterium MS941dsrS MS941dsrS reveló que una pronta inducción xilosa en 578 OD de 0,3 y el cultivo a pH 5,2 dio la mejor producción y secreción de dextransucrase (datos no publicados). En consecuencia, para el análisis proteómicos dos culturas con lote B. megaterium MS941dsrS MS941dsrS, uno con xilosa inducción y la otra sin la inducción xilosa como control, se llevaron a cabo en las mismas condiciones. Realizar el control de la cultura tiene por objeto distinguir entre la expresión de la proteína recombinante de los cambios derivados de la producción y los dextransucrase despertado de crecimiento de las células. Como se muestra en la Figura 4 (A], el lote dos culturas muy similares demostrar tiempo curso de crecimiento de las células y el consumo de glucosa. Xilosa añadido para la inducción no es consumido por las células de carbono a causa de la represión catabólica por glucosa.

Para determinar la formación y secreción de dextransucrase en B. Megaterium, se tomaron muestras de células de la cultura inducida por xilosa poco antes de la inducción, a continuación, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h y 9 h después de la inducción. Tres fracciones proteicas, es decir, la secreción de la fracción, de células asociadas a la fracción soluble y la insoluble célula asociada a la fracción, se prepararon de acuerdo con el método descrito en la sección de Materiales y Métodos y separados en SDS-PAGE actividad tinción geles para obtener dextransucrase en las diferentes fracciones. Los resultados se muestran en la figura 4 (B]. Tres formas de dextransucrase de diferentes pesos moleculares se pueden distinguir. Representan el precursor dextransucrase con péptido de señal (200 kDa), que todavía se encuentra localizada en el citoplasma, la madura dextransucrase sin péptido de señal (188 KDa), que ya es secretada fuera de la membrana celular y la degradadas dextransucrase (165 kDa), respectivamente. Un máximo de la producción de dextransucrase alcanzado ya 1 h después de la inducción de xilosa, que se muestra como dos bandas más gruesa en la celda asociada a las fracciones soluble e insoluble en la actividad de la tinción de geles, respectivamente. Además, el producido dextransucrase se trasladaron más fácilmente la membrana celular, como lo demuestra el hecho de que ningún precursor dextransucrase es visible en la tinción de geles de actividad. Sin embargo, dextransucrase acumulado en el espacio entre la membrana celular y la pared celular, ya que las bandas no podrían ser detectadas en la secreción de la fracción. El mayor paso de dextransucrase a través de la pared celular se ve obstaculizado, ya que también fue observado por Malten et al. [2]. Después de las dos células asociadas soluble e insoluble dextransucrase disminuido de manera constante con el tiempo. Mientras tanto, el maduro dextransucrase difundida continuamente a través de la pared celular que rodea al medio de cultivo. La difusión de la barrera de la pared celular, explica la demora de tiempo entre la producción y la máxima dextransucrase su máxima secreción en el medio que se llegó a 9 horas después de la inducción.

3. Proteómicos análisis comparativo de metabolismo
Conclusión

En este trabajo un método 2DE y un mapa de proteínas de referencia para el análisis de proteómica B. Megaterium se establecieron. A pesar de los desaparecidos de la secuencia del genoma individual 149 proteínas se identificaron a través de la base de datos pública de proteína apoya homólogo proteína péptido búsqueda utilizando la fragmentación de la información adquirida QqTOF ESI-MS / MS análisis. De ellos 35 proteínas podrían ser asignados a funciones de la enzima central del metabolismo de carbono (glicolisis, vía pentosa fosfato, piruvato y ciclo TCA metabolismo) y 31 a aminoácidos de síntesis y el metabolismo, dando lugar a la construcción de una red parcial metabólico que es útil Vía metabólica para el análisis.

Durante el crecimiento del lote B. Megaterium expresiones de la glucosa sobre las enzimas glicolíticos se mantuvo aproximadamente constante, mientras que la mayoría de las enzimas del ciclo TCA fueron hasta reguladas. Los componentes de la PDH complejo enzima, así como el fosfato acetiltransferasa (PTA) fueron notablemente abajo regulado, mientras que algunas enzimas relacionadas con la síntesis de PHB se enérgicamente hasta regulados, lo que indica una discrepancia entre glicolisis metabólicas y TCA de este ciclo B. Megaterium tensión y la canalización de acetil-CoA en la biosíntesis de PHB de carbono y como fuente de almacenamiento de energía

A excepción de unos pocos casos, los perfiles de expresión proteica de la no inducida e inducida B. Megaterium lote culturas, este último, además, la producción de proteínas heterólogas dextransucrase, no difirió significativamente. Esto indica que la expresión de la proteína de B. Megaterium relativa a la central del metabolismo del carbono se rige principalmente por el crecimiento y poco afectados por la xilosa inducida de la generación de productos de genes heterólogos. De hecho, la masa de dextransucrase se estimó como sólo el 2% de toda la proteína producida. Sólo algunas enzimas de la síntesis de aminoácidos expuestas discrepancias entre inducidos y no inducidos culturas. Concretamente, el aspartato aminotransferasa (AspB) fue hasta reguladas en la inducida por la cultura. Esta enzima canales oxaloacetate en una gran familia de aminoácidos que requiere es fuerte (37%) en dextransucrase síntesis. Los niveles de expresión de chaperones citosólico necesario para el procesamiento postraduccional cambiado casi, mientras que la proteína de unión-oligopeptide (OppA) exhibieron aumento en la expresión inducida por la cultura, lo que sugiere que esta proteína puede estar involucrado en la translocación de la dextransucrase heteróloga.

Materiales y métodos
Lote de cultivo de B. Megaterium recombinante para la producción dextransucrase

El B. Megaterium cepa MS941 transformado con el plásmido pMM1520dsrS pMM1520dsrS que lleva el gen de una dextransucrase de Leuconostoc mesenteroides [38], fue elegido como el candidato cepa de la investigación sobre la producción heteróloga dextransucrase. El medio utilizado fue desarrollado para un óptimo crecimiento de la B. Megaterium cepa investigados en este estudio [39]. Contiene 33 g por litro de glucosa monohydate, 5,0 g (NH 4) 2 SO 4, 2,2 g KH 2 PO 4, 0,3 g MgSO 4 7H 2 O, 0,5 g de extracto de levadura, 2,0 mL de solución de oligoelementos y 0,1 mL Sigma antifoam 204 por litro. El oligoelemento solución contenía 40 g MnCl 2 4H 2 O, 53 g CaCl 2 2H 2 O, 2,5 g FeSO 4 7H 2 O, 2,5 g (NH 4) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O, y 2,5 g CoCl 2 6H 2 O.

Al principio, agitando frascos que contenían 50 ml del medio fueron inoculadas con una glicerol balance de la B. Megaterium cepa MS941 llevar el plásmido pMM1520dsrS pMM1520dsrS (B. megaterium MS941dsrS MS941dsrS) y cultivadas durante la noche a 37 ° C y 250 rpm. Al llegar a un OD 578 de aproximadamente 3, 10 mL cultura se añadieron a 990 ml en un lote de mediano bioreactor (Biostat B2) y de la cultura de lotes se llevó a cabo a 37 ° C, pH 5,2, 500 rpm y aireación de aire 1 L / min . Análisis de la biomasa, la glucosa y los metabolitos se llevaron a cabo tal y como se describe en detalle por Hollmann y Deckwer (2004). La biomasa como peso seco de células (CDW) se calculó a partir de OD valor medido de acuerdo a una relación lineal entre OD CDW y que se determinó en nuestros trabajos anteriores (datos no publicados). De la producción recombinante dextransucrase fue inducida por la adición de xilosa a una concentración de 0,5% w / v después de la OD 578 alcanzó aproximadamente el 0,3. Para comparativa DE 2-análisis, otro lote sin xilosa cultura de inducción se llevó a cabo en las mismas condiciones.

Para 2-DE célula de análisis, se tomaron muestras de la cultura inducida por xilosa inmediatamente antes de la inducción (I0), 1 h (I1), 6 h (I6) y 10 h (I10) después de la inducción. Del mismo modo, después de la OD 578 alcanzó 0,3 sobre la primera muestra de células (NI0) fue tomado de la cultura no inducida. Más muestras fueron tomadas 1 h (NI1), 6 h (NI6) y 10 h (NI10) después de la primera toma de muestras. Las células se refrigera inmediatamente en agua con hielo después de la toma de muestras, y después se centrifuga a 6500 rpm (Sorvall RT 6000B, DuPont) por 30 min a 4 ° C. "Pellets" de células se lavaron dos veces con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) y la solución almacenada en -80 ° C hasta su uso.

Para la detección de la producción y secreción de dextransucrase en B. Megaterium, muestras tomadas de la cultura inducida se centrifuga a 4 ° Cy 5000 rpm durante 10 min para obtener células libres de sobrenadantes de células y "pellets". El sobrenadante se centrifuga de nuevo a 4 ° C y 13000 rpm durante 10 min para obtener proteína de los sedimentos que contenía el secretada dextransucrase como la secreción de las fracciones. Los gránulos de las células se resuspendió con un buffer de lisis (100 mM Na 3 PO 4, 5 mg / ml lisozima, pH 6,5 con H 3 PO 4) y se incuba a 37 ° C por 30 min y se centrifuga a 4 ° C y 13000 rpm durante 10 minutos para separar el sobrenadante de células como la asociada a las fracciones solubles de los sedimentos, los que luego fueron resuspendidos en 8M urea y centrifugada de nuevo para recoger el sobrenadante de células como la asociada a las fracciones insolubles. Las tres fracciones fueron sometidas a la determinación de las actividades de dextransucrase según un método de tinción actividad descrita por Malten et al [2]. En pocas palabras, las proteínas de las tres fracciones se separaron con normalidad geles SDS-PAGE. DsrS que aún se encuentra vinculado a los geles se renaturated y incubados con sacarosa para catalizar la formación de dextrano. La cantidad de dextrano se formaron en relación con la actividad catalítica de DsrS para la cuantificación de la actividad.

Extracción y separación de las proteínas intracelulares de B. Megaterium por 2-D IEF / SDS-PAGE

El 2-D IEF / SDS-PAGE electroforesis en gel (2-DE) método establecido en nuestro laboratorio para el análisis proteómico de los diferentes microorganismos [40], ha sido optimizado para la separación de las proteínas intracelulares de B. Megaterium. Para obtener extractos crudos de proteínas de células se resuspendió pellets con un tampón de lisis que contiene urea 7 M, 2 M thiourea, 4% (w / v) CHAPS, 1% (w / v) dithiothreitol (TDT), el 0,8% (w / v) Pharmalyte ™ pH 3-10, y 5 mM Pefabloc, y perturbado por ultrasonication en un baño de hielo de 5 × 60 s y 2 × 30 s con un intervalo de 30 s entre cada ciclo de ultrasonidos para un mejor efecto de enfriamiento. Insoluble materiales fueron separados por centrifugación a 13000 g durante 30 min a 4 ° C. Para una mejora de 2-DE separación de B. Megaterium proteínas, extractos de proteína cruda se debe seguir tratamiento para disminuir interferir otros componentes intrínsecos de la célula. Los diferentes métodos de purificación de la membrana de diálisis, tales como el uso de Mini Kits de Diálisis, 1 kDa de corte (Amersham Biosciences), la precipitación o con varios disolventes orgánicos se han probado. Un fenol posterior precipitación con acetona dado lugar a la extracción de los mejores 2-DE separación rendimiento. En pocas palabras, los extractos crudos de proteínas se extrajeron con un buffer-TE (10 mM EDTA, pH 7.4) fenol saturado por agitación vigorosa e incubación. Las proteínas constituyen una interfase entre el blanco y el fenólicos fases acuosa. Después de desechar la fase acuosa y lavar dos veces la proteína interfase con agua Milli-Q, las proteínas se precipitó con acetona fría (-20 ° C), además lavados dos veces con acetona fría, secado al aire y almacenados a -80 ° C hasta su uso .

Alícuotas de pellets de proteína se diluye con un volumen adecuado de amortiguación de rehidratación (7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w / v) CHAPS, 1% (w / v) de la TDT, el 0,5% IPG buffer de pH 4-7 y rastrear Bromphenol cantidad de azul). La concentración total de proteínas en el sobrenadante se determinó por el método de Bradford RotiQuant utilizando el reactivo (Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del equipo. Duplicar geles fueron analizados para cada muestra y todas las muestras del mismo lote se ejecuta en virtud de la cultura exactamente la mismas condiciones. La primera dimensión de la electroforesis en gel centrándose isoeléctrico (IEF) se ejecutan con el IPGphor Isoelectric Centrándose System (Amersham Biosciences) a una temperatura de 20 ° C. 250 μ g de proteína de cada muestra se cargaron en geles Immobiline DryStrip (IPG strips), de pH por 4-7 en la rehidratación-gel. IEF se realizó con los siguientes parámetros: 30 V × 6 h, 60 h × 6 V, 200 V × 1 h, 500 × 1 h V, 1000 V × 1 h, V gradiente desde 1000 a 8000 V dentro de los 30 minutos, luego 8000 V × 10 h. La segunda dimensión electroforesis en gel de SDS-PAGE se realizó utilizando la unidad de la separación vertical de la losa Ettan Dalt Sistema II y pre-emitidos geles de poliacrilamida Ettan Dalt II Gel 12,5% (Amersham Biosciences). Antes de SDS-PAGE las tiras IPG fueron equilibrado en la FDS equilibrio de amortiguación a lo recomendado en el manual del usuario proporcionado por el fabricante para el pre-elenco geles. SDS-PAGE separación se realizó a los 25 ° C en el modo de potencia constante de la siguiente manera: 2 W / gel durante 1 h, y de 20 W / gel hasta que el colorante azul de bromofenol frente llegado a la parte inferior del gel. Posteriormente, los geles se tiñeron utilizando azul brillante G-coloidal Concentrado (Sigma, Saint Louis, Missouri, EE.UU.) por la fijación en un ácido acético glacial: metanol: agua (7:40:53) solución de 1 h; noche a la mañana con la tinción de azul brillante G-coloidal de acuerdo con las instrucciones del fabricante del equipo y lavado varias veces con agua Milli-Q. Los geles fueron escaneadas con un escáner UMAX PowerLook III a 300 dpi de resolución para adquirir las imágenes de gel. Computer análisis de los geles de proteínas para la detección in situ, la adecuación y la cuantificación se realizaron con la Phoretix 2D Avanzada Software Version 2.003,02 (Phoretix, Newcastle upon Tyne, Reino Unido). Exactamente mismos parámetros como la sensibilidad y el tamaño de operador se utiliza para la detección in situ. El mismo método de la substracción de fondo "sobre el límite más bajo", se aplicó para todos los geles. Usuario semillas se añadieron para ayudar in situ concordancia entre geles. Para superar el problema de las variaciones entre los geles de electroforesis, manual de los ajustes menores en la detección in situ y se pongan en venta se realizó cuando fue necesario, obviamente. Promedio de los valores de proteína terreno volumen y la intensidad de sus correspondientes desviaciones estándar se calcularon para caracterizar los cambios de expresión de las proteínas. Proteína terreno intensidad se define como el volumen normalizado terreno que se trata de la relación de la única vista al volumen total de puntos en un volumen de 2-D gel. Normalmente sólo las proteínas que muestran más de 2 veces el aumento o disminución de las expresiones se consideraban hasta-o abajo-regulado.

Digestión de las proteínas y el análisis de espectrometría de masas

Proteína manchas recorte del 2-DE geles fueron sometidos a la digestión en gel con tripsina según un método descrito anteriormente [41] con algunas modificaciones, a saber, después enjuague con agua y la deshidratación con acetonitrilo gel piezas fueron digeridos directamente tríptico sin más tratamiento . Péptidos obtenidos fueron extraídos y purificados con invirtió fases C 18 ZipTips (Millipore, Bedford, EE.UU.).

Matrix asistida por láser de desorción ionización tiempo de vuelo espectrometría de masa (MALDI-TOF MS) Bruker Ultraflex con un tiempo de vuelo espectrómetro de masas (Bruker Daltonics GmbH, Alemania) y nanoelectrospray ionización cuadripolares-tiempo de vuelo de espectrometría de masas en tándem (ESI-QqTOF MS / MS) con un Q-TOF 2 espectrómetro de masas (Micromass, Manchester, Inglaterra) equipado con una fuente de iones nanospray se llevaron a cabo según lo descrito por Wang et al [41].

Identificación de proteínas por proteínas homólogo búsqueda

Péptido obtenido de las masas de MALDI-TOF MS análisis se utilizaron para transferencias en especie homólogo proteína en la búsqueda de las bases de datos públicas NCBInr proteínas y péptidos por SWISS-PROT/TrEMBL masiva de huellas dactilares. El programa de búsqueda Mascotas (Matrix Science Ltd, Reino Unido, http://www.matrixscience.com] se utilizó los parámetros de la búsqueda y se dio de la siguiente manera: tripsina se utiliza la digestión enzimática, una división perdida sitios se permitió, fue modificada por la cisteína Iodoacetamide y metionina se supone que parcialmente oxidados. Todos los valores son péptido masa monoisotopic la masa y la tolerancia se fijó en 100 ppm.

MS / MS espectros de determinados precursores de péptidos QqTOF ESI-MS / MS análisis se mejora utilizando el software Max Ent 3 (Micromass), seguida de la secuenciación automática o manual utilizando el programa de PepSeq el paquete de software Masslynx ™, versión 3.5 (Micromass). Péptido secuencias obtenidas se fusionaron y se presentará para buscar la similitud de las proteínas homólogas utilizando la base de datos de búsqueda de proteínas programa MS BLAST http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/msblast.html [7, 16], con la matriz de puntuación y en contra de PAM30MS El amplio no redundante nrdb95 base de datos de secuencias de proteínas. No hay limitaciones a la proteína pesos moleculares (Mw), punto isoeléctrico (pI pI) o especies de origen fueron impuestas.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

W. Wang diseñó y llevó a cabo experimentos 2-DE, hizo la identificación de proteínas con datos de MS y contribuyó a la preparación de este manuscrito. R. y T. Hollmann Fuerch llevado a cabo experimentos con cultivos de los lotes y la actividad dextransucrase pruebas. M. Nimtz participó en QqTOF ESI-MS / MS y MALDI-TOF MS análisis, así como en los debates para la preparación de este manuscrito. Malten M. y D. Jahn suministrado la recombinante B. Megaterium tensiones y así participar en los debates para la preparación de este manuscrito. W.-D. Deckwer iniciado y coordinado este estudio, y contribuyó a la preparación de este manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Cuadro 1. Descripción de las proteínas intracelulares de
Bacillus megaterium
MS941
DsrS
Separados por electroforesis en gel bidimensional y después identificado en la digestión-gel tríptico QqTOF por ESI-MS / MS homólogo análisis y la búsqueda de proteínas utilizando MS BLAST contra de la no-redundante nrdb95 base de datos de proteínas.
Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado económicamente por la Sonderforschungsbereich 578 der Deutschen Forschungsgemeischaft (DFG). Los autores P. Westphal gracias por su excelente asistencia técnica en 2-DE experimentos. Los autores agradecen a la FMB MS grupo de análisis, sobre todo Abrahamik A., J. y U. Felgenträger Majewski por su ayuda en la QqTOF ESI-MS / MS y MALDI-TOF MS análisis.