Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 23-23 (más artículos en esta revista)

El análisis de la memoria de actividad de los linfocitos T tras la estimulación con la superposición de HLA-A * 2402, A * 0101 * 0402 y Cw Restringido CMV pp65 péptidos

BioMed Central
Monica Ghei (gheim@msnotes.wustl.edu) [1], David F, Stroncek (dstroncek@dtm.cc.nih.gov) [2], Maurizio Provenzano (mprovenzano@uhbs.ch) [2]
[1] Washington University School of Medicine, St Louis, MO, EE.UU.
[2] Secciones de Inmunología Molecular, Departamento de Medicina de Transfusión, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EE.UU.
[3] Institut für chirurgische Forschung und Spitalmanagement, de la Universidad de Basilea, Suiza

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Resumen

Los continuos esfuerzos encaminados a la identificación de nuevos epítopes inmune a través del sistema de MHC ha llevado al descubrimiento de que más de un péptido puede limitarse a los mismos antígenos HLA y la función inmune como un factor determinante de dicha asociación. El objetivo de este estudio fue comparar la capacidad de dos péptidos superpuestos, la nonamer (9-mer) por citomegalovirus (CMV) pp65 341-349 (QYDPVAALF) y la decamer (10-mer) CMV pp65 341-350 (QYDPVAALFF), Y la esadecamer (16-mer) péptido que contiene tanto el 9-mer-mer y 10 secuencias, CMV pp65 340-355 (RQYDPVAALFFFDIDL), para estimular y mantener más tiempo una reactivación de células T inmunes por HLA-A * 2402, A * 0101, y Cw * 0402-CMV células de los sujetos seropositivos. El 9-mer, 10-mer, y el 16-mer péptidos estimulado eficazmente CTLs de HLA-A * 2402, HLA-A * 0101 y HLA-Cw * 0402 CMV seropositivos donantes. Este dato confirma que tanto el 9-mer y el 10-mer péptidos son promiscuos y no se limitan a un único antígeno HLA. CMV pp65 341-349 y 341-350 CMV pp65 tienen la capacidad de producir CTLs específicos de CMV en pacientes con diferentes tipos HLA, la presentación de una ventaja práctica sobre otros péptidos que se restringe sólo a un único antígeno HLA, y, por tanto, para ser óptima CMV adoptivos terapia inmune. Además, como el péptido 16-mer abarca tanto el 9-mer-mer y el 10 de péptidos, tal vez sea mejor que cualquiera de estos péptidos para CMV adoptivos terapia inmune.

Introducción

En individuos sanos, la infección primaria con infección por citomegalovirus (CMV) es generalmente leve o asintomática y es el control efectivo de la célula mediada por la respuesta inmune [1]. Sin embargo, en los individuos inmunodeprimidos, como los enfermos de SIDA o después de trasplante de médula ósea, la reactivación por CMV se asocia con morbilidad significativa hasta que el sistema inmunológico del individuo está completamente reconstituido [2]. Uno de los métodos de prevención de post-trasplante CMV es la infección por CMV utilizando adoptivos inmunoterapia específica de los linfocitos T citotóxicos (CTLs) de los trasplante de donantes [3]. Varios HLA clase I Restringido péptidos derivados de la inmunidad dominante CMV 65 kd matriz phosphoprotein (pp65) han demostrado obtener CMV CTLs específicos. Dos superposición de HLA-A * 2402 Restringido péptidos se han descrito: pp65 341-349 y pp65 341-350. Estos péptidos son un nonamer (9-mer) y un decamer (10-mer) que se superponen con excepción de la última aminoácido fenilalanina (F) en el C-terminal [QYDPVAALF (M)]. A pesar de su similitud, la capacidad de estos péptidos para inducir una respuesta de células T se ha informado a diferir [4, 5].

Aunque se ha aceptado generalmente que un único péptido CMV es obligado y presentado por cada molécula HLA de clase I, los estudios recientes sugieren que algunos péptidos son más promiscuos y podrá ser presentada por más de un antígeno HLA clase I. En este caso concreto, el 9-mer pp65 341-349 ha demostrado estimular CTLs de ambos HLA-A * 2402 * 0402 y Cw donantes [6], mientras que el 10-mer pp65 341-350 ha demostrado ser reactiva Con HLA-A * A * 2402 y 0101 los donantes [7].

La presente investigación trató de comparar la potencia de estos dos péptidos y determinar el tamaño óptimo de péptido para CMV adoptivos inmune eficaz terapia. Ambos péptidos se realizarán las pruebas de su capacidad para estimular el CMV en CTLs específicos de HLA-A * 2402, HLA-A * 0101 y HLA-Cw * 0402 restricción. Además, un 16-mer pp65 340-355 que incluye tanto el 9-mer y el 10-mer péptidos se puso a prueba por su capacidad para reactivar las células T de memoria. Este específica péptido 16-mer fue seleccionado ya que representa la forma natural de péptidos procesados que abarcaría tanto el 9-mer-mer y el 10 de péptidos. IFN-γ mRNA transcripción de producción se mide por el cultivo de células in vitro, ensayos en los que el péptido células fueron inducidas por 3 horas después de 2 semanas de sensibilización in vitro, mientras que las proteínas IFN-γ liberación se midió utilizando el cultivo de células in vitro recogidos en el sobrenadante Diferentes puntos temporales.

El objetivo de la investigación fue determinar si tanto el 9-mer y el 10-mer péptidos mantener unos niveles de estimulación CTL en el tiempo para todas las restricciones HLA estudiados. Además, es importante investigar si la estimulación con el procesado naturalmente péptido 16-mer, seguida de la re-estimulación de los dos más pequeños péptidos incrustado dentro del concepto más amplio de secuencia, conducen a la eficacia de las células T de memoria respuesta inmune.

Materiales y métodos
Péptido selección, la síntesis y la nomenclatura

La superposición de dos péptidos derivados de la inmunidad dominante CMV 65 kd matriz phosphoprotein (pp65), el nonamer pp65 341-349 (QYDPVAALF) y la decamer pp65 341-350 (QYDPVAALFF) péptidos se utilizaron para analizar la actividad de linfocitos T de memoria en PBMCs recogidos de CMV Donantes seropositivos teniendo alelos HLA-A * 2402, A * 0101, o Cw * 0402. El esadecamer pp65 340-355 (RQYDPVAALFFFDIDL) secuencia que abarca tanto pp65 341-349 (QYDPVAALF) y pp65 341-350 (QYDPVAALFF) péptidos se seleccionarán en función de su puntuación, como analizados por MAPPP (MHC Antigen Péptido Procesamiento de Predicción) [8] Basado en FRAGPREDICT desarrollado por Holzhütter [9] (Figura 1]. El original secuencia de 20 aminoácidos de longitud (CMV pp65 340-359), como se muestra en el gráfico 1, se redujo a 16 aminoácidos (CMV pp65 340-355) con el fin de permitir la reconstitución completa de esta secuencia. El C-terminal del péptido se redujo a formar una secuencia de 16-mer y de la selección de los 16 mer-no afectó el objetivo de que ambos 9-mer-mer y 10 péptidos representados en la secuencia. El HLA restricción para este 16 secuencia de aminoácidos que no se sabe (Archivo Adicional 1].

Los tres péptidos fueron sintetizados por Princeton Biomoléculas (Langhorne, PA) con pureza de 90% y el 100% como analizados por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), disuelto a 100 μ g / ml en el 50% DMSO y almacenadas a 4 ° C. Para simplificar la nomenclatura péptido en el presente documento nos referimos a CMV pp65 péptido 341-349 (QYDPVAALF) como el 9-mer péptido, el péptido a CMV pp65 341-350 (QYDPVAALFF) como el péptido 10-mer, y la secuencia de CMV pp65 340 -355 (RQYDPVAALFFFDIDL) como el péptido 16-mer.

Donante de recolección y preparación de células

Leucocitos se obtuvieron de donantes CMV seropositivos teniendo alelos HLA-A * 2402, A * 0101, Cw * 0402 o después de obtener el consentimiento informado. La presencia de anticuerpos contra CMV fue analizado por pasiva aglutinación de látex (CMVSCAN kit, Becton Dickinson Microbiology System, Cockeysville, MD). MHC de clase I genotipos fueron determinados por la secuencia específica de primer polimerasa (PCR). Lymphapheresis se realizó con un CS3000 Plus separador de células sanguíneas (Fenwal División, Baxter cuidado de la salud, Deerfield, IL), y PBMCs fueron aisladas de los productos de aféresis Ficoll (Pharmacia Biotech, Wilkstrom, Suecia) gradiente de densidad de centrifugación.

PBMCs in vitro de sensibilización

El in vitro de sensibilización participan a 2 semanas de cultivo celular en presencia del péptido y la IL-2. En pocas palabras, un 2 semanas in vitro de sensibilización se realizó a través PBMCs de donantes CMV-seropositivos. PBMCs de cada donante se chapada en una concentración de 3 × 10 6 células / ml y en un 24 / 2 ml placa con medio RPMI completo (10% AB suero humano, la penicilina, gentamicina, glutamina, y el 1% HEPES), y directamente Estimulado con 3 μ g / ml tanto de la prueba y control de péptidos (1 μ g / ml para cada péptidos 10 6 células). Recombinante humana interleucina-2 (rhIL-2, 100 U / ml, PeproTech, Rocky Hill, NJ) se añadió en días de la celda de la cultura. Al día 15, cada lote de las células se lavaron y directamente re-estimulado en fresco ya sea con medio de prueba o control péptido o no re-estimulado. Tres horas después de volver a la estimulación de células fueron cosechadas para analizar su IFN-γ mRNA transcripción de producción de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). En tres diferentes puntos de tiempo (24, 48, y 72 horas) después de volver a la estimulación sobrenadantes fueron recogidas y analizadas para IFN-γ después de la liberación de proteínas ELISA directrices del fabricante.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

IFN-γ mRNA transcripción de la producción in vitro sensibilizado PBMCs se evaluó 3 horas después de volver a dirigir péptido inducción, que se describió anteriormente [5]. Después de 2 semanas de sensibilización in vitro (IVS), 2 × 10 5 PBMCs (concentración final de 1 × 10 6 células / ml) fueron chapada en un 96 U-parte inferior y / placa con 200 μ l de medio RPMI completo, incubaron la noche a la mañana, Y luego directamente estimulado con 1 μ g / ml de péptido específico. Después de 3 horas de incubación, ARN total fue extraído (RNeasy Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA) y 1 μ l de cDNA sintetizado (Invitrogen, Carlsbad, CA) fue usado como una plantilla para medir el IFN-γ mRNA transcripción por qRT - PCR usando un ABI Prism 7900 Sequence sistema de detección (Perkin Elmer, Foster City, CA). PCR cuantitativa en tiempo real los resultados se informaron como el número de IFN-γ copias de genes normalizado por 10 5 β-actina de copias de genes. Todos los ensayos de PCR se realizaron por triplicado e informó de que el promedio. Estimulación índice se ha aplicado sobre la base de los valores de control negativo.

ELISA

La liberación de IFN-γ in vitro de la proteína por PBMCs sensibilizado después de péptido re-estimulación se midió mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) kit (Endogen, Woburn, MA). Sobrenadantes de péptido-estimulado PBMCs se colectaron a los 24, 48, y de 72 horas. ELISA resultados se extrapolaron de una norma generada por la curva de regresión lineal. Los ensayos se realizaron por duplicado y se presenta como la media.

Resultados
IFN-γ mRNA transcripción de producción por 9-mer, 10-mer, y el 16-mer sensibilizado PBMCs de HLA-A * 2402, A * 0101, Cw * 0402 y los donantes re-estimulado con sus afines determinantes

Con el fin de analizar la inmediata reactivación de células T inmunes para cada uno de los tres factores determinantes (9-mer, 10-mer-mer y 16) después de 2 semanas de duración in vitro de sensibilización, qRT-PCR se utilizó para cuantificar los niveles de mRNA IFN-γ Producida por las células sensibilizadas después de 3 horas péptido-inducción. Así, después de las 2 semanas de péptido (9-mer, 10-mer, y el 16-mer) in vitro de sensibilización, cada lote de células sensibilizadas fue re-estimulado con los péptidos afines. Aunque ambos 9-mer-mer y 10 péptidos son capaces de mantener unos niveles de estimulación durante este período de tiempo para todos los HLA restricciones a prueba, el 9-mer péptido induce respuestas de los más altos en las células que expresan HLA-A * 2402 (SI 4.07-528 ) O HLA-Cw * 0402 (SI 4.15-483), mientras que el péptido 10-mer inducido respuestas de los más altos en las células que expresan HLA-A * 2402 (SI 3,5-528) o HLA-A * 0101 (SI 8.25-615). El péptido 16-mer también fue capaz de estimular las células T de todos los HLA-A * 2402, A * 0101 * 0402 y Cw donantes (SI 6,95, 4,96, 5,02) en niveles que fueron aproximadamente iguales a la media de los inducidos por cada Solo 9-mer-mer y el 10 de la inducción (Figura 2A].

IFN-γ mRNA transcripción de producción por péptido 16-mer-sensibilizado PBMCs de HLA-A * 2402, A * 0101, Cw * 0402 y los donantes re-estimulado con cualquiera de los 9 o los 10 mer-mer determinante

Con el fin de analizar la inmediata reactivación de los linfocitos T de memoria tras el péptido 16-mer de sensibilización, de 2 semanas de duración in vitro péptido 16-mer sensibilizado células fueron re-estimulado, ya sea con 9-mer o péptido 10-mer. Así, qRT-PCR se utilizó para cuantificar los niveles de IFN-γ ARNm producido por las células sensibilizadas después de 3 horas péptido-inducción. En comparación con los resultados anteriores, como en la figura 2A, que demostró el 9-mer péptido de la especificidad para HLA-A * 2402 y HLA-Cw * 0402, la re-estimulación, de 2 semanas de duración in vitro péptido 16-mer sensibilizado con las células 9-mer péptido confirmó el 9-mer péptido de la especificidad para HLA-A * 2402 y HLA-Cw * 0402, más su capacidad de mejorar la reactividad de los linfocitos T en los donantes con HLA-A * 0101 (SI 3.96-507). Del mismo modo, la re-estimulación, de 2 semanas de duración in vitro péptido 16-mer células sensibilizadas con el péptido 10-mer confirmó este péptido de la especificidad para HLA-A * 0101 mientras que específicamente el aumento de la reactividad de células T en HLA-A * 2402 donantes (SI 6.12-236). El HLA-Cw * 0402 especificidad fue también confirmado, y se mantiene a los 10-mer péptidos (3.58-467), probablemente la adición de una nueva asociación a HLA CMV este péptido (Figura 2B].

IFN-γ por la liberación de proteínas 9-mer, 10-mer, y el péptido 16-mer-sensibilizado PBMCs de HLA-A * 2402, A * 0101, Cw * 0402 y los donantes re-estimulado con sus afines determinantes

Después de 2 semanas de sensibilización in vitro con 9-mer, 10-mer-mer o 16 péptidos de PBMCs de HLA-A * 2402, A * 0101, Cw * 0402 y los donantes, los sobrenadantes se obtuvieron de cultivos de células a las 24, 48 y 72 horas después de la re-estimulación de cada lote de células sensibilizadas con los péptidos afines. A pesar de que tanto el 9-mer-mer y 10 péptidos fueron capaces de reactivar las células de cada uno de los tres donantes en el tiempo 0 (Figura 2A], el 9-mer péptido fue más débil que el péptido 10-mer, en el mantenimiento de una coherente T respuesta inmune en el tiempo tanto en el HLA-A * 2402 y HLA-A * 0101 donantes. En cambio, el 9-mer péptido fue más fuerte que el 10-mer en el estímulo y el mantenimiento de un T reactivación y la respuesta inmune en el tiempo teniendo en donantes HLA-Cw * 0402. La estimulación con el péptido 16-mer inducida y mantenida coherente inmune reactivación de células T en todos los donantes a prueba, según la evaluación de los niveles de IFN-γ la producción de proteínas en comparación con el control positivo (Figura 3].

IFN-γ liberación de la proteína 16-mer sensibilizado PBMCs de HLA-A * 2402, A * 0101, Cw * 0402 y volver a los donantes ya sea estimulada con 9-mer o 10-mer determinante

Después de 2 semanas in vitro sensibilización de los PBMCs de HLA-A * 2402, A * 0101, Cw * 0402 y los donantes con el 16-mer secuencia, se obtuvieron de sobrenadantes de cultivo de células a las 24, 48 y 72 horas después de la estimulación de re - Péptido 16-mer-sensibilizado con las células ya sea de 9 o 10-mer mer péptidos. Parece que todos los donantes en la re-estimulación, de 16-mer in vitro de las células sensibilizadas con el 9-mer y el 10-mer péptidos fue capaz de inducir una mejor IFN-γ la producción de proteínas de 9 o 10-mer-mer in vitro sensibilizado Células que fueron estimulados con el péptido afines, ya sea por el aumento de la producción de citoquinas proteína en cada punto del tiempo o por el mantenimiento de una mejor liberación de citoquinas proteínas en el tiempo. En concreto, este se observa para los HLA-A * 2402 y HLA-A * 0101 donantes siguientes 9-mer péptido en la inducción y el HLA-Cw * 0402 de donantes siguiente péptido 10-mer de inducción (Figura 4].

Discusión

La transferencia adoptiva de linfocitos T inmuno-infectados con el CMV, pacientes transplantados representa uno de los tratamientos de elección para eliminar la enfermedad por CMV y reconstituir rápidamente a la pérdida de equilibrio entre la infección por CMV y el sistema inmunológico [10 - 12]. El uso de péptidos inmune específica para detectar y ampliar las células T inmunocompetentes es una herramienta importante que se ha aplicado ya en varios ensayos clínicos [13, 14]. Una vez CMV epítopo cartografía se había iniciado y conducido a la identificación de los epítopos que abarca varios antígenos HLA clase I, gran effots se dedicaron a la identificación de HLA de reactividad cruzada de los que se sabe inmune y los factores determinantes de la identificación de nuevos factores determinantes. En este caso concreto, la superposición de los dos péptidos pp65 341-349 (QYDPVAALF) y pp65 341-350 (QYDPVAALFF) han demostrado tener una notable reactividad cruzada. En primer lugar, se demostró que pp65 341-349 se limita a HLA-A * 2402 y 0402 y Cw * pp65 341-350 a HLA-A * A * 2402 y 0101 [6, 7]. En este estudio un nuevo HLA especificidad para el 9-mer a HLA-A * 0101 y para el 10-mer a HLA-Cw * 0402 está bien descrita. Por otra parte, este estudio mostró que ambos péptidos son capaces de estimular eficazmente las respuestas de células T inmunes de HLA-A * 2402, A * 0101 y Cw * 0402 donantes, lo que confirma que estos péptidos son promiscuos y no se limita a un solo tipo de HLA. Mientras tanto el 9-mer-mer y 10 péptidos son capaces de mantener unos niveles de estimulación en el tiempo en el HLA-A * 2402 donantes, ambos son también capaces de inducir y mantener una reactivación inmunológica en los donantes con sus otras asociaciones HLA señaló. De hecho, el 9-mer es más capaz de mantener la estimulación de HLA-Cw * 0402 los donantes y el 10-mer está en mejores condiciones para hacerlo en HLA-A * 0101 donantes.

Curiosamente, la búsqueda de otro nuevo surgió: tanto el 9-mer-mer y 10 péptidos son capaces de inducir una población restringida de los linfocitos T de una población de células que se habían sensibilizado in vitro con un péptido de secuencia que abarca los dos péptidos. El péptido 16-mer es capaz de estimular eficazmente las células T de HLA-A * 2402, A * 0101 y Cw * 0402 a niveles que están bien mantenidos en el tiempo. En particular, parece que el 9-mer y el péptido 10-mer reactivación de las células previamente sensibilizada con el péptido 16-mer resultados en el aumento de la reactivación de células T en todos los donantes. Aunque estos resultados deben confirmarse y validado por más estudios in vivo, que especulan que el uso de este 16-mer lugar de la región solo 9-mer-mer o 10 péptidos sería ventajosa en la clínica como las modalidades de transferencia adoptivos epítopo Específicas de los linfocitos T específicos o epítopo vacunas. Estos resultados apoyan el uso potencial de la péptido 16-mer, en la terapia inmunológica CMV adoptivos [15].

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Cuadro 1. Para ir DOC
Agradecimientos

La investigación se realizó gracias al generoso apoyo de los NIH de Verano del Programa de Becas de Investigación para médicos / dentales estudiantes.