BMC Plant Biology, 2005; 5: 7-7 (más artículos en esta revista)

Inducidos por la luz alteraciones morfológicas en la acumulación de antocianinas-vacuolas de las células de maíz

BioMed Central
Niloufer G Irani (irani.8 @ osu.edu) [1], Erich Grotewold (grotewold.1 @ osu.edu) [1]
[1] Department of Plant Cellular and Molecular Biology and Plant Biotechnology Center, The Ohio State University, Columbus, OH 43210, USA

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Resumen
Antecedentes

Planta de pigmentación se ve afectada por una variedad de factores. Luz, una importante señal de la planta de desarrollo, influye en la acumulación de antocianinas principalmente a través de la activación de los factores de transcripción que regulan la ruta de biosíntesis de flavonoides. En este estudio, hemos utilizado maíz dulce mexicano Negro (BMS) células que expresan el R C1 y reguladores de la biosíntesis de antocianinas de una luz-promotor insensible como un medio para investigar la existencia de niveles adicionales de control de la pigmentación de la luz.

Resultados

BMS células que expresan el R C1 y reguladores del promotor CaMV 35S constitutiva acumular antocianinas cuando se crece en la oscuridad, lo que sugiere que los factores de transcripción y C1 R son suficientes para la transcripción de los genes correspondientes a las enzimas estructurales de la vía, sin necesidad Adicional para la luz inducida por los reguladores. Curiosamente, la luz induce una "oscurecimiento" en el color de la púrpura de la pigmentación antociánica BMS transgénicos y células que expresan R C1. Este cambio en el tono del pigmento no está asociado con una variación de los niveles o tipos de antocianinas presentes, o con una alteración de los niveles de la transcripción de varios genes de biosíntesis de flavonoides. Sin embargo, citológicos observaciones muestran que las unidades de luz inesperados cambios en la morfología y distribución de las antocianinas que contienen compartimentos vacuolar.

Conclusión

Por efecto de la disociación de la luz sobre la acumulación de antocianinas, hemos encontrado la luz para inducir la fusión de antocianinas que contienen vacuolas, la coalescencia de inclusión antociánica vacuolar (AVI)-al igual que las estructuras de contenidos, y la propagación de las antocianinas de las inclusiones en la savia vacuolar . Similar luz inducida por alteraciones en la morfología vacuolar también son evidentes en las células de la epidermis de maíz verticilos florales acumular antocianinas. Nuestros resultados sugieren un nuevo mecanismo para la acción de la luz sobre la vacuolar almacenamiento de antocianinas.

Antecedentes

Antocianinas, el color del producto final de la vía de flavonoides, desempeñan un papel importante en la atracción de insectos o animales para la polinización y dispersión de semillas. Además, desempeñan funciones como anti-oxidantes y en la protección del ADN y el aparato fotosintético de los flujos de radiación de alta [1]. Otras posibles funciones de las antocianinas, como la protección contra el frío o el estrés ofrecer resistencia a la sequía, es probable que se asocie con actividades restringidas a determinadas clases de plantas [2].

La biosíntesis de los flavonoides, un gran grupo de phenylpropanoid derivados de compuestos fenólicos, ofrece una de las mejores vías metabólicas de plantas descritas, con muchos de los genes reguladores y estructurales en la vía identificado y clonado [3, 4]. Menos se sabe acerca de los mecanismos por los que el soluble en agua antocianinas son transportados desde su lugar de síntesis, la superficie citoplásmica de la retículo endoplasmático [5, 6], en la vacuola, en que habitualmente secuestrado [7]. Vacuolas de plantas son altamente dinámico, multifuncional orgánulos que son los principales lugares de almacenamiento y el volumen de negocios de macromoléculas. Estos organelos membrana, que puede ocupar hasta el 90% del total del volumen celular, son parte integrante de la endomembrane sistema, que actúa como la terminal de productos de la vía secretora [8].

Varias especies de plantas dentro de antocianinas tienda vacuolar inclusiones que se han denominado anthocyanoplasts vagamente que se han observado para iniciar como vesículas en el citoplasma y membrana parecen estar vinculados [9, 10]. Más recientemente, el intravacuolar estructuras observadas en los pétalos de flores de diversas plantas, entre clavel y lisianthus, que se denominó antociánica vacuolar inclusiones, o AVI [11]. Estas inclusiones se sugirió que se la membrana de la menor, proteínico matrices que actúan como trampas de antocianinas, preferentemente para anthocyanidin 3, 5-diglycosides [11] o acylated antocianinas [12]. Una vez en la vacuola, muchos factores influyen en la pigmentación en vivo proporcionada por antocianinas, con importantes consecuencias para la eco-fisiología de las plantas [13, 14]. Algunos de estos factores incluyen el tipo específico de anthocyanidin presente (para por ejemplo, pelargonidin cyanidin, o myricetin), la forma de las células en las que se acumulan los pigmentos [15], la concentración del pigmento, la formación de complejos entre antocianinas y co - Pigmentos [16], y el pH vacuolar [17, 18].

Las condiciones ambientales son conocidos para inducir la acumulación de pigmentos antocianinas a través de los principales grupos de plantas superiores, de ellos la luz es la mejor estudiado [2, 19, 20]. En Arabidopsis, la antocianina vía está regulada en una moda circadiano, con genes de flavonoides en horas pico al final del ciclo de la oscuridad, probablemente la preparación de las plantas para el amanecer [21]. En el caso del maíz, los miembros de la PL1/C1 R2R3 MYB y B / R bHLH familias de proteínas reguladoras que cooperen para la regulación de los pigmentos antocianinas [3], y son necesarias para la expresión de genes de la biosíntesis de antocianinas c2 (chalcone sintasa), chi1 (chalcone Isomerasa), f3h (flavanone 3-hidroxilasa) a1 (dihydroflavonol 4-reductasa), a2 (leucoanthocyanidin dioxygenase / antociana sintasa), bz1 (UDP glucosa: flavonoides 3 - O-glucosilados transferasa) y bz2 (glutation S-transferasa) [19 ]. La luz inducida por la expresión de los miembros de estas R2R3 MYB y bHLH clases de factores de transcripción se ha propuesto a ser responsable de la inducción de antocianinas en el maíz por la luz [22 - 26].

En este sentido, investigó si la luz afecta a la acumulación de la pigmentación antociánica de maíz en un nivel que no sea a través de la activación de la conocida R2R3 MYB y bHLH reguladores de la vía. Hacia este objetivo, analizamos anteriormente descrito [27] transgénicos Negro mexicana Dulce (BMS) de maíz en las células que expresan la cultura Zea mays R C1 y reguladores de un constituyente, la luz insensible promotor CaMV 35S (BMS 35S:: R +35 S:: C1 ). Mostramos aquí que la SAE 35S:: R +35 S:: C1 células son de color rojo, aun cuando se crece en la oscuridad. Tras el tratamiento de luz, hay un oscurecimiento del color de la SAE 35S:: R +35 S:: C1 células, sin un incremento apreciable en la cantidad de antocianinas o en el tipo de anthocyanidins presente. De acuerdo con estos resultados, el estado de equilibrio de los niveles de antocianinas biosíntesis de varios genes no aumenta a la luz de tratamiento. Curiosamente, en el nivel subcelular, la luz induce una alteración en la forma en que las antocianinas se distribuyen dentro de los compartimentos vacuolar. La misma alteración en la morfología de antocianinas de la acumulación de vacuolas se observa cuando el maíz borla glumes son irradiados con luz, lo que sugiere que los fenómenos observados en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células en la cultura también se produce en la planta. En conjunto, nuestros resultados sugieren un nuevo mecanismo para la acción de la luz en el envase de antocianinas en la vacuola y en subvacuolar compartimentos. Este efecto de la luz sólo podía ser descubierto después de hacer la biosíntesis de las antocianinas independientes de la luz.

Resultados
BMS células que expresan los factores de transcripción y C1 R acumular antocianinas en la oscuridad

Para determinar si el control de la luz de la vía antociana maíz está mediada por la expresión de los B / R C1/PL y de los reguladores y / o la biosíntesis de los genes [23], se determinó la pigmentación de las células que expresan BMS R C1 y de los genes Constitutiva el promotor CaMV 35S (BMS 35S:: R +35 S:: C1) [27]. BMS 35S:: R +35 S:: C1 células cultivadas en la oscuridad durante 30 días fueron plenamente pigmentadas con antocianinas (Figura 1A]. El bombardeo de las células con el SAE R C1 y reguladores expulsados de la promotor 35S (p35SR + p35SC1) dio lugar a la acumulación de glóbulos rojos dentro de 15 horas, incluso cuando las células se mantuvieron en la oscuridad después de los bombardeos (compare Fig. 1B y 1C] . Estos resultados indican que la expresión constitutiva de la R C1 y reguladores es suficiente para la activación de la vía, incluso en ausencia de luz.

BMS 35S:: R +35 S:: C1 células oscurecer a la luz

Para investigar si la luz tiene ningún efecto adicional sobre la pigmentación presentes en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células, comparamos el color de la SAE y el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células cultivadas durante seis días en la oscuridad O bajo condiciones de luz (ver Métodos). BMS 35S:: R +35 S:: C1 células crecido a la luz mostró un oscurecimiento visual, en comparación con las células cultivadas en la oscuridad (Fig. 2, BMS 35S:: R +35 S:: C1). Sin embargo, la luz no indujo ninguna diferencia visible en el blanco y amarillo color de las células de control de la SAE no expresar la C1 y R reguladores (Fig. 2, SAE). Hemos cuantificado estas diferencias de color visual in vivo utilizando un reflectometer y el espacio de color CIELAB sistema de valores. L * valores, en representación de la ligereza, y reproducen no fueron afectadas por la luz (Tabla 1]. Los valores de a * BMS 35S:: R +35 S:: C1 células fueron positivos (+), en consonancia con el color rojo característico de estas células. Hubo sin embargo una disminución significativa (p <0,05) en la reducción de los valores a-cuando el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células fueron expuestas a la luz, que se observó en cada una de las tres veces que el experimento se realizó ( Tabla 1]. Aunque los valores de b *, lo que contribuye a amarillo (+ b) o azul (-b), fueron significativamente diferentes (p <0,05) entre la oscuridad y la luz crecido BMS 35S:: R +35 S:: C1 células, que rondando cerca de El valor cero, lo que sugiere una baja contribución al total observó cambio de color. Así, el a * b * y los valores observados corresponden a una quantifiably color rojo (rojo aburrida), con un descenso del grado de enrojecimiento de la luz, que está de acuerdo con nuestras observaciones visuales (Fig. 2]. En ausencia de un cambio en el valor de L *, la aparente oscurecimiento de las células es probablemente causado por el desplazamiento espectral de la luz reflejada hacia el rojo menos.

El contenido de antocianinas o el estado de equilibrio los niveles de mRNA de la biosíntesis de los genes no son alterados por la luz blanca en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células

Para investigar si el cambio de color observadas entre luz y oscuridad-BMS crecido 35S:: R +35 S:: C1 células se debe a una alteración en la calidad o cantidad de los pigmentos, las antocianinas se extrajeron y cuantificados. Metanólica extractos de las células, normalizado para el peso seco, fueron analizadas por espectrofotometría. Los espectros de absorción de los pigmentos obtenidos a partir de extractos de ácidos de metanol oscuro y la luz de las células tratadas mostraron idénticos perfiles muy similares y los valores de absorbancia a 530 nm (Fig. 3 A, B]. Para determinar si la luz inducida por una alteración en el tipo de anthocyanidin presente, el total de anthocyanidins fueron extraídos y separados por cromatografía en capa fina (TLC). Niveles similares de cyanidin y pelargonidin están presentes en la luz-oscuridad y tratados BMS 35S:: R +35 S:: C1 células (Fig. 3C], en consonancia con los dos tipos principales de anthocyanidins descritas previamente en el SAE 35S:: R +35 S: : C1 células [28].

En células de la SAE, R C1 y se sabe que activar varios flavonoides biosíntesis de los genes [27]. Para investigar si la activación de estos genes se mejoró aún más el tratamiento de la luz, ARN total fue extraído de la SAE 35S:: R +35 S:: C1 células incubadas durante seis días a la luz o la oscuridad y analizados por ARN gel blots (del Norte Blots, Fig. 4]. No significativa alteración en el estado de equilibrio de los niveles de mRNA chalcone sintasa (c2 c2, Fig. 4], flavanone 3-hidroxilasa (f3h, Fig. 4] o dihydroflavonol 4-reductasa (a1, Fig. 4] se observó para la luz Crecido BMS 35S:: R +35 S:: C1 células. El control de la SAE células no mostraron acumulación de ARNm para estos genes (Fig. 4]. En conjunto, estos resultados sugieren que el oscurecimiento de la SAE 35S:: R +35 S:: C1 células a la luz de tratamiento no se debe a una alteración en la cantidad o calidad de los pigmentos antocianinas presentes.

Luz blanca produce alteraciones en la sub-distribución celular y vacuolar organización de antocianinas en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células

Las alteraciones de la pigmentación de flores rosa anteriormente estaban asociados con la formación de estructuras de tipo AVI [29]. Para investigar si una alteración similar en el embalaje de las antocianinas se podría con el matiz de luz inducida por la alteración de la SAE 35S:: R +35 S:: C1 células, se determinó la morfología celular sub-oscuro de la luz y tratados BMS 35S: : R +35 S:: C1 células. Para visualizar de manera inequívoca la vacuola (s), la SAE y el SAE 35S:: R +35:: C1 se tiñeron con la célula permeable, acetoxymethyl derivado de la vacuolar tinte fluorescente, 2 ', 7'-bis (2-carboxyethyl) -5 (6)-carboxyfluorescein (BCECF-AM). En el control de la SAE células, hay típicamente una a un puñado de grandes compartimentos vacuolar (Fig. 5A, C]. En cambio, el SAE 35S:: R +35:: C1 células son siempre múltiples vacuolas (Fig. 5B, D]. Lamentablemente, antocianinas concentran en la vacuolar inclusiones de amortiguación por la fluorescencia de la BCECF-AM tinte, como se observa en algunas de las más grandes vacuolas (Fig. 5B].

Dentro de la vacuola, antocianinas se acumulan en las inclusiones que, cuando se observan bajo luz polarizada, aparecen ronda regular y en la forma o agregados, como una multa de cadenas se entrelazan con vesículas (Fig. 6]. El número de inclusiones y vacuolas por vacuola son dramáticamente afectadas por la luz en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células. En oscuros tratos BMS 35S:: R +35:: C1 células, el principal representante tipo de células (Fig. 6A, que representan el 34% del total de las 239 células observadas), tenía un rango de 20 a 30 observables vacuolas (Tabla 2] . En estas células, las antocianinas están presentes principalmente en el vacuolar inclusiones redondeadas con una característica coloración rosa pálido vacuolar de la savia, un fenómeno llamado aquí "antociana propagación". Los próximos dos tipos de células más abundantes en el presente oscuro tratados BMS 35S:: R +35:: C1 células, que corresponde al 16% y el 11% de todas las células, tienen una gama de 10-20 o 20-30 visualmente observables vacuolas Por celda, respectivamente (Tabla 2]. Las células de estos grupos se caracterizan por no observables en la propagación de antocianinas vacuolar savia bajo el microscopio de luz y, sin embargo, ha rojo o rojo pálido antociana inclusiones en la vacuola (Fig. 6C, E].

A la luz, la mayoría de la SAE 35S:: R +35:: C1 células (35%, Tabla 2) muestran una a diez pigmentadas vacuolas con inclusiones de color rojo que parecía más de tiempo y difusa como "la maraña de cuerdas" (Fig , 6B]. Estas estructuras están decididos a ser 0,1 a 0,3 μ m de diámetro, apareció en determinadas células que se bleb ramificada con estructuras de tipo en sus extremos. Una importante población de células (26%, Tabla 2] han 10-20 vacuolas, ligeramente coloreado con discreta pigmentación, inclusiones esféricas (Fig. 6D]. La tercera clase más abundante de la SAE 35S:: R +35:: C1 células presentes en la luz (12%, Tabla 2] mostró pigmentación ampliada inclusiones y vacuolas (Fig. 6F].

Comparación del tamaño de las inclusiones vacuolar en la oscuridad-luz-y crecido BMS 35S:: R +35:: C1 células (Fig. 7] muestra que la mayoría de las inclusiones en la oscuridad crecido muestras están en el rango de tamaño de 0,1 μ m - l μ m, con una notable ausencia de los más grandes. La variedad de modos de la luz vacuolar inclusiones en células cultivadas 2 μ m - 3 μ m, con algunos tan grandes como 14 μ m. Esto puede reflejar la fusión de las pequeñas inclusiones vacuolar para dar lugar a las más grandes (ver más abajo). El control de la SAE células, que crecen en la oscuridad o la luz, no mostró ninguna evidencia sub-celulares cambios morfológicos (no se muestra).

Para una mejor comprensión de los cambios inducidos por la luz de la acumulación de antocianinas en las células, se realizó microscopía confocal de barrido láser de BCECF-AM cargado BMS 35S:: R +35:: C1 células. Dark-crecido células mostró la presencia de múltiples vacuolas (Fig. 8G], el cual, tras el tratamiento de luz, al parecer se unen para formar menos, mucho más grandes vacuolas (Fig. 8H]. Light-crecido células mostrar una disminución de la fluorescencia, probablemente a causa de la desactivación por antocianinas liberados de las inclusiones vacuolar. Dark-o luz-BMS crecido células no mostraron diferencias en el distintivo visual de la intensidad de fluorescencia o vacuolar morfología (Fig. 8 C, D], lo que sugiere que el observado alteraciones morfológicas son o bien una consecuencia de la expresión de la R C1 y reguladores, de la Acumulación de antocianinas o de propiedades distintivas de las vacuolas en el que se acumulan antocianinas.

En conjunto, estos resultados muestran que la luz expuestos BMS-35S:: R +35:: C1 células tienen una importante reducción en el número de vacuolas asociadas con un aumento de su tamaño, un cambio en el número, la forma y el tamaño de los AVI y Una liberación de antocianinas de la AVI en la vacuola.

Inducidos por la luz vacuolar alteraciones morfológicas en la acumulación de antocianinas-maíz órganos florales

Para establecer si la luz inducida vacuolar BMS alteraciones observadas en las células se puede observar también en la planta, tuvimos en cuenta las borlas del maíz BI Pl plantas que acumuló grandes cantidades de antocianinas (Fig. 9]. El interior, la luz de ellas protegidas y palea (Fig. 9B] fueron la elección de los materiales para observar la luz inducida por alteraciones en la morfología vacuolar. Las células epidérmicas de estos apéndices en un C2-Idf mutantes que carecen de antocianinas (Fig. 9C] tiene uno de un puñado de grandes, observable, incoloro, central vacuolas (Fig. 9D]. En cambio, en función de la etapa de desarrollo fisiológico y de los floretes, las células de la epidermis de la lemma o palea de las flores BI Pl (Fig. 9B, E], o bien ya estaban llenos de antocianinas, o se encontraban en las fases iniciales de acumulación ( Fig 9F]. Estas células muestran un distintivo de múltiples vacuolar morfología, y las vacuolas eran a menudo muy cargados de antocianinas y estructuras de tipo AVI (Fig. 9F].

La luz del microscopio fue suficiente para inducir dramáticas alteraciones en la morfología y distribución de la antocianina vacuolar estructuras que contienen, como se ha visto en el momento de expiración de las imágenes tomadas a intervalos de cuatro segundos (Fig. 10, ver archivo adicional 1: Movie 1 para El original de los datos utilizados para realizar este análisis). En estas series, la inicialmente delgada, tubular lleno de estructuras de antocianinas (diámetro medio de 0,6 μ m, Fig. 10, flechas verdes) ampliar a un espesor de alrededor de 1,4 μ m, llenando toda la dinámica de células (Fig. 10A, flechas azules). Estas gruesas, dedo de la mano-como se hizo proyecciones hinchada, hoja de contención (~ 3,3 μ m de diámetro, Fig 10, negro flechas), para luego ser redondeado (Fig. 10A, B, C; flechas de color naranja) y se funden con los demás. Estos redondeadas y ovales compartimentos de la medición de un 1-9 μ m de diámetro está representada, al igual que las estructuras tubulares, dinámicos cambios morfológicos. Hinchazón de "vesículas" se observaron en movimiento a lo largo de los túbulos multa y los extremos de los túbulos gruesa aumentó hasta en las estructuras de ronda. Fusión de los acontecimientos, una vez iniciado, son muy rápidos, lo que dio lugar a la formación de grandes cuerpos de fusión (Fig. 10C, D, E; flechas rojas), que contiene numerosas claro (es decir, no contienen antocianinas), estructuras (Fig. 10C, D, E ; Flechas amarillas). Estas inclusiones claro, también se observaron inicialmente en la hoja-al igual que las estructuras y se formaron como el tamaño de los túbulos creció. La fusión de los órganos progresó rápidamente para llenar toda la celda, lo que finalmente se fusionan juntos en la antocianina extendido por todo el compartimiento (Fig. 10E]. Los márgenes se definen en torno a las grandes centrales AVI-como la estructura (~ 15 μ m de todo) ser más difusa con un encendedor de color rojo translúcido alrededor de la aureola opaca, oscura cuerpo (Fig. 10E].

En contraste con el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células, en el que la producción de antocianinas se desacoplar de la luz inducida por alteraciones morfológicas, la acumulación de antocianinas en estas células Pl BI es inducida por la luz [23]. Así, observaron alteraciones en la morfología vacuolar podría ser una consecuencia de la expresión inducida por la luz de los factores de transcripción, de la luz inducida por acumulación de antocianinas, de la luz inducida por alteraciones en la morfología observada en vacuolar BMS 35S:: R +35 S: : C1 células, o una combinación de ellos.

Discusión

Pigmentos antocianinas desempeñar importantes funciones eco-fisiológicos en la planta. Si bien la regulación de la biosíntesis y antocianinas se ha descrito ampliamente, se sabe poco sobre la forma en que estos pigmentos son secuestradas en la vacuola, y en qué medida sus modos de almacenamiento afectan a color. Se describe aquí cambios citológicos de vacuolas y sub-vacuolar compartimentos que contienen antocianinas maíz en células expuestas a la luz.

Nuestros estudios en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células muestran antocianinas a acumularse incluso en la oscuridad total, sin ningún tipo de efecto de la luz sobre los niveles de antocianinas ni de la cantidad de transcripciones de los diversos genes de biosíntesis de flavonoides. De estos resultados, se concluye que, cuando el R C1 y reguladores se expresan, no hay necesidad de más luz inducida por factores de influir en el control de la vía. Esto proporciona un fuerte apoyo a los resultados anteriores que sugieren que los flavonoides vía está regulada por la luz en el nivel de transcripción de la conocida R2R3 MYB y / o transcripción bHLH activadores y no a nivel de la vía de los genes estructurales [23, 25, 26]. Así, el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células proporcionar una herramienta de gran alcance para uncouple el efecto de la luz sobre la acumulación de antocianinas y pigmentación, algo no factible en la mayoría de los sistemas de la planta, donde antocianinas son inducidas por la luz.

Los niveles similares de antocianinas en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 celdas oscuras o bajo condiciones de luz nos permitió descubrir un segundo efecto de la luz en la pigmentación. Luz tratados BMS 35S:: R +35 S:: C1 celdas eran de color oscuro, en comparación con idénticas células cultivadas en la oscuridad (Fig. 2]. Reflectancia cuantificables importantes se observan diferencias entre el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células cultivadas durante seis días en continua claras u oscuras (Cuadro 1], los cambios que no están asociados a una variación en la cantidad o tipo de las antocianinas presentes (Fig . 3]. Los estudios microscópicos que estableció una amplia vacuolar alteraciones morfológicas (Fig. 6] se correlaciona con el oscurecimiento del color. BMS células no expresan la antocianina reguladores suelen tener uno o varios compartimentos vacuolar (Fig. 5]. En cambio, la expresión constitutiva de la I y C1 en estas células se traduce en un notable incremento en el número vacuolar. Queda por determinar si la acumulación de flavonoides y antocianos, la expresión de los reguladores, o ambas cosas son necesarias y suficientes para activar la biogénesis de los nuevos compartimentos vacuolar. Dentro de las vacuolas, antocianinas se acumulan en las células del maíz en rojo esférico que se asemejan a los órganos vacuolar anthocyanoplasts [27]. Aunque todavía no hemos establecido de manera inequívoca si la antocianina inclusiones presentes en el SAE 35S:: R +35 S:: C1-membrana de las células están obligados o no, que tienen características muy similares a los recientemente descrito auto-amarillo fluorescente órganos (YFB) presente En las vacuolas de las células de la SAE, inducida por la expresión de la P1 regulador de la 3-deoxi biosíntesis de flavonoides [30].

La organización de la antociana inclusiones presentes en el SAE 35S:: R +35 S:: C1 células someterse dramáticas modificaciones en la presencia de la luz. Estas modificaciones incluyen la reducción de su número y una ampliación de su tamaño (Fig. 6]. Además, la luz de vacuolas a menudo tratadas mostraron una propagación de la pigmento antocianina vacuolar en el lumen, que puede ser el resultado de la liberación de estructuras de tipo AVI. Los cambios morfológicos observados en las vacuolas de la SAE 35S:: R +35 S:: C1 células no son una "curiosidad" de las células en cultivo. Hemos descubierto similares luz inducida por alteraciones en la estructura vacuolar de maíz florales tejidos acumulando altos niveles de antocianinas (Fig. 8, 9]. Time-lapse experimentos (ver archivo adicional 1: Movie 1) ilustran la formación y fusiones de tubulares y globulares antociana lleno de estructuras que, en definitiva, se unen para dar una o unas pocas grandes vacuolas característica central de las células pigmentadas de maíz. Estas estructuras tubulares-vesicular, algunos de los cuales están llenos de vesículas claras, son una reminiscencia de las observaciones de la tubular provacuoles encuentran en vacuolating Euphorbia raíz células [8, 31]. La identidad anatómica de estas estructuras no esta demostrada, pero similar a lo que se informó para la Euphorbia células raíz, la ontogénesis de los más grandes de antocianinas que contienen vacuolas de los más pequeños es una reminiscencia de vacuolar de fusión y / o la autofagia.

Es posible que estas inducida por luz y alteraciones morfológicas en las estructuras que contienen antocianinas están directamente relacionados, si no el fondo, para los cambios de color observados. Sin embargo, alteraciones en el pH vacuolar o de la asociación de antocianinas con co-pigmentos también puede dar lugar a cambios en el tono de la pigmentación antociánica [13, 14]. Para investigar si la luz induce un cambio en el pH vacuolar de las células BMS, que utilizó la BCECF-AM tinte fluorescente, de las que la proporción de emisión de fluorescencia en la doble excitación nm/440 longitudes de onda de 490 nm puede ser calibrada a una generados in vivo PH curva [32]. El uso de este método, se estableció que el vacuolas de oscuridad y luz BMS células fueron cultivadas ácida a pH 5,8 y pH no mostraron diferencias significativas (ver archivo adicional 2: Fig. 1]. Del mismo modo, la medición de pH de crudo homogeneizado de la SAE o SAE 35S:: R +35 S:: C1 células en el agua no dieron diferencias significativas entre el valor de pH entre sí o entre la luz y la oscuridad de las células cultivadas (datos no presentados). Aunque poco probable, sobre la base de la ausencia de un cambio de la λ max de los pigmentos (Fig. 3 A, B], también investigó si la luz participado en la inducción de fitoquímicos que podrían servir como co-pigmentos, y por tanto contribuir a la Cambio de color. HPLC en fase reversa análisis no presentan ninguna diferencia significativa en el pico de perfiles de los compuestos fenólicos en la oscuridad y la luz y crecido BMS BMS 35S:: R +35 S:: C1 células (no se muestra).

A pesar de que estos resultados no descartan la posibilidad de un local y / o transitoria de luz inducida por el cambio de pH o la inducción de un menor co-pigmento responsable de la cambio de color, una posible explicación es que las alteraciones en la morfología vacuolar son la causa de Oscurecimiento de la luz inducida por el fenómeno de las células que contienen antocianinas. Similar luz de los efectos inducidos se han descrito anteriormente para la anthocyanoplasts de col roja, una observación que se atribuye a una mayor acumulación de antocianinas realzado por la luz [9]. Nuestros resultados, sin embargo, ofrecen otra explicación que la luz sí puede afectar el embalaje y la distribución de las antocianinas dentro de la vacuola, independientemente de las variaciones en los niveles de antocianinas. Del mismo modo, las flores de la "Rapsodia en Blue" levanta cultivar muestran un cambio de color inducido por la edad, de rojo a púrpura-azulado-púrpura, y esta variación se asoció con una progresiva acumulación de antocianinas en estructuras de tipo AVI [29] . Lisianthus flores también muestran una correlación entre el envase de antocianinas en AVI, la presencia de "púrpura-negruzco" pigmentación en la base del pétalo, y la reducción o ausencia de AVI en el exterior zonas, asociados con un encendedor de color púrpura De esta región [11]. Por tanto, es posible que el observado alteración en la tonalidad de la luz crecido BMS-35S:: R +35 S:: C1 células refleja un mecanismo mucho más general de la luz en el envase de antocianinas dentro de la vacuola, y por lo tanto, en la pigmentación. Si es así, el BMS 35S:: R +35 S:: C1 células proporcionar un cómodo sistema para la disección de los mecanismos de este proceso a causa de las herramientas moleculares y celulares disponibles.

Conclusión

Los resultados aquí presentados proporcionan pruebas de que la luz afecta a la pigmentación antociánica de los mecanismos más allá de la regulación transcripcional de genes que codifican enzimas de la vía. En maíz de los órganos florales y cultivos celulares, la luz induce dramáticas alteraciones morfológicas en el embalaje de antocianinas y distribución de vacuolar y sub-compartimentos vacuolar. Fenómenos similares se han observado antes, pero las dificultades en la producción de antocianinas desvinculación con alteraciones morfológicas en sus envases impedido sacar concluyentes relaciones de causa-consecuencia.

Métodos
Crecimiento, el mantenimiento y el tratamiento de las células de la SAE

BMS células fueron mantenidos en condiciones descritas previamente [33]. En resumen, la SAE células fueron cultivadas sub-cada siete días en los medios de comunicación líquido MS suplementado con 2,4, D (0,5 g / L), el 3% de sacarosa (BMS medios de comunicación) rotatorios en un agitador (150 rpm) en la oscuridad a 25 ± 2 ° C. Para los tratamientos de luz y oscuridad, las células de cultivos en suspensión se chapada en papel de filtro BMS recubrimiento en medios sólidos que contengan 0,3% phytagel, y se les permitió establecer durante 20 días en la oscuridad a 25 ± 2 ° C. Las placas fueron pasado a la oscuridad total (alumnum cubiertas con papel de aluminio) o de la luz a 50 ± 5 μ mol.m -2. S -1 (blanco frío. 215W, F96T12/CW/VHO, Sylvania, Canadá).

Experimentos de expresión transitoria

BMS células suspensión (3 g de células en 25 ml de los medios de comunicación BMS) la noche a la mañana fueron tratados con PEG 1,7% en el SAE medios de comunicación. Un ml de las células se superponen sobre la validez de filtros de papel empapado en placas de Petri. Diez microgramos de 35S:: R +35 S:: C1 plásmido (pPHP687 en [27]] fue revestida en oro microprojectiles acuerdo a la recomendaciones de los fabricantes (Bio-Rad Laboratories, Inc, EE.UU.). Revestidos partículas de oro fueron bombardeados en el PEG-BMS células tratadas Biolistic PDS-1000/He utilizando una pistola de partículas (Bio-Rad Laboratories, Inc EE.UU.) a 1100 psi. Las placas se mantuvieron en la oscuridad (cubierta con papel de aluminio) o expuestos a la luz durante un período de 24 horas, después de que las células fueron analizadas microscópicamente.

Análisis de reflectancia

In vivo reflectancia medidas fueron tomadas con una Minolta CR-300 reflectometer / colorímetro (Minolta, Japón). El color se representa como CIEL * a * b * los valores (de la CIE D65/10 ° iluminante / observador condición). L * El valor representa el nivel de ligereza, que van desde 100 (en blanco) a 0 (negro), el a * (+ rojo; verde-a) y b * (b + amarillo, azul-b). El instrumento se normalizó a nivel de baldosas blancas con el instrumento antes de realizar el análisis sobre las células cultivadas en medios sólidos BMS en placas de Petri.

La extracción y el análisis de los pigmentos antocianinas

BMS 35S:: R +35 S:: C1 o control BMS células después de una luz oscura o tratamiento fueron liofilizados durante 36 hrs. Antocianinas y otros fenólicos se extrajeron en la noche a la mañana el 50% de metanol en una proporción de 50 μ g de tejido seco por μ l de metanol. El metanol se extractos diluidos en el 1% de HCL en el 50% de metanol y se recogieron espectros de absorción entre 400 nm y 700 nm, con intervalos de 5 a 0,5 s con un Cary 50 Espectrofotómetro UV-VIS (Varian, Inc EE.UU.). Los gráficos fueron generados usando el software Cary WinUV. Antocianinas se midió espectrofotométricamente a 530 nm. Para la generación de la anthocyanidins a partir de las correspondientes antocianinas, el metanol se extrae hidrolizada por la adición de un volumen igual de 2 M de HCL (37% v / v) y se calienta en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos. Hidrolizado muestras fueron extraídas con alcohol isoamyl. Separación cromatográfica de la anthocyanidins se realizó por cromatografía en capa fina (TLC) sobre las placas de celulosa (5730 / 7, EM Ciencia, Alemania) con HCL / ácido fórmico / H 2 O, 3:30:10, v / v en la fase móvil . Veinte μ l de metanólica extractos de la no hidrolizada y hidrolizada muestras se inyecta en una Waters Alliance ® 2695 separaciones módulo (Waters Corporation, Milford, MA) en las condiciones descritas [34]. Los perfiles de HPLC se obtuvieron a los 280 nm utilizando las aguas Photodiode Array Detector de 2996 y se analizaron con el programa Empower (Waters Corporation, Milford, MA).

La extracción y el análisis de ARN

Dark luz y las células fueron cultivadas BMS homogeneizada en nitrógeno líquido y ARN total fue extraído utilizando el reactivo TRIzol siguientes recomendaciones de los fabricantes (Invitrogen, Life Technologies, EE.UU.). Para los análisis del Norte, 25 μ g de RNA total se separó en un formaldehído que contienen gel de agarosa al 1% y borró en una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Inc, EE.UU.). La mancha se hibridó con sondas de cDNA correspondiente a c2 [35], f3h [36] y a1 [37]. Ubiquitin [38] se utilizó como control de la normalización. Comparación de las señales de hibridación se llevó a cabo a BioRad phosphorimager (BioRad Laboratories, Inc, EE.UU.) y coeficientes de la oscuridad y la luz crecido callo hibridación señal a la normalización ubiquitin control se compararon.

Material vegetal

Maíz núcleos C2-Idf la genética 418D C2-Idf1 (Active-1); A1 A2 y C1 R1 Pl BI-219I B1-I; A1 A2 C1-C2 Pll Rhoades rl-r, 219J B1-I; A1 A2 C1-C2 Pl1 Rhoades r1-g se obtuvieron del Maíz http://w3.aces.uiuc.edu/maize-coop/ Coop. Los núcleos se plantaron en el campo en el verano y justo antes de la antesis, masculino borlas fueron recolectados para la observación de la estructura vacuolar de la lemma o la palea.

Microscopía y análisis vacuolar tinción

Las imágenes digitales de los verticilos florales maíz y callo células fueron capturados con una cámara Nikon COOLPIX 5700. Macroscópico imágenes de los experimentos transitorios se visualizaron con una Olympus SZH10 Investigación estéreo microscopio (Olympus, Japón) y las imágenes fueron capturadas con una cámara digital Olympus DP10. Luz y oscuridad crecido BMS células se examinan bajo un microscopio Nikon Eclipse E600. Diferencial de interferencia (DIC) de contraste se tomaron fotografías con un SPOT, RT-deslizante de la cámara digital y analizados utilizando el software de imágenes SPOT (Diagnostic Instruments, Inc, EE.UU.). DIC lapso que las imágenes fueron tomadas cada 4 segundos para 2 horas y se convirtieron en una película utilizando el software de imágenes SPOT. Por vacuolar tinción, transformado y control BMS células fueron incubadas con 10 μ M BCECF-AM (Molecular Probes, EE.UU.) en los medios de comunicación BMS durante 40 minutos a temperatura ambiente. Las células se establecen hilar, lavar dos veces y re-suspensión de la SAE en los medios de comunicación. Microscopía de escaneo láser confocal con un sistema PCM 2000/Nikon Eclipse600 (Nikon Bioscience confocal Systems, NY) fue utilizado para la captura de imágenes digitalizadas de la BCECF células teñidas utilizando la Nikon Plan Fluor 40X/0.75 objetivo aire (1 píxel = 0,3 μ m), tal como se describe [39]. La excitación de 488 nm de longitud de onda del láser de argón se utiliza en conjunción con una banda 515/30 nm de emisión filtro (EM515/30HQ). Las imágenes fueron capturados utilizando el software SIMPLEPCI (Compix Imaging Systems, PA) y ensambladas utilizando Adobe PHOTOSHOP (Adobe Systems, Mountain View, CA).

Medición de pH

BMS células (6 ml) se cultivaron en placas de Petri de 35 mm en una concentración de 0.lg/ml (peso fresco / vol.) Durante 6 días en virtud de la luz (50 μ mol.m -2. S -1) y oscura (de lámina Cubiertos) a 100 rpm. Las células fueron filtradas, pesadas y resuspendido en una concentración de 0,1 g / ml. Un ml de las células se cargaron con 10 μ M BCECF-AM, como se ha descrito anteriormente. Cien μ l de la carga y las células fueron lavadas en una pipeta 96 y placa de microtitulación. Un situ en la curva de calibración fue generada por separado para cada una de las repeticiones de la oscuridad y la luz crecido BMS células. 100 μ l de 0,1 M de varios buffers de pH de un rango de 5,0 a 7,0 con 0,005% digitonin [40] se añadió a 100 μ l de las células, y se incubaron durante 10 min. Emisión de fluorescencia se midió a 535 nm con excitación a 440 nm y 490 nm utilizando la estación de FLEX ™ y el análisis de datos del programa SOFTmax PRO 4.3 (Molecular Devices, CA). El ratio de emisión en 490/440 se utilizó para el cálculo del pH, en caso de irregularidades debido a la desigualdad de la carga, se eliminan. Estas mediciones se llevaron a cabo por triplicado.

Contribuciones de los autores

NGI llevado a cabo todos los experimentos moleculares y celulares descritos. EG concibió el proyecto y participó en el diseño y la coordinación del estudio.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Time-lapse DIC imágenes de un lema de maíz
BI Pl
Planta de sobre-acumulación de antocianinas. Las imágenes fueron tomadas cada cuatro segundos. El time-lapse serie se convirtió en una película en un fotograma por segundo, por lo tanto, la aceleración de 4X en tiempo real. Las cuatro últimas imágenes representadas en la Fig.
10
(C, D y E) son de este tiempo-lapse serie. Tenga en cuenta la clara inclusiones en la ronda de las estructuras tubulares y el gran vacuolas al final. Consulte la sección de resultados para obtener una descripción detallada.
Visualización de Instrucciones:
La película puede ser visualizado usando ya sea reproductor Quicktime o Windows Media Player. El plug-in se puede descargar de
(Quicktime Player) o
Player). El tamaño de la película es ~ 2 MB, por lo tanto, es más eficiente a fin de descargar la película en su disco duro.
Archivo Adicional 2
Figura
1
Medición in situ de pH vacuolar utilizando BCECF-AM.
Igual cantidad (0,01 g/100 μ l en peso fresco), de BCECF AM cargado células se colocaron en placas microtiter, y la emisión medido a 535 nm, 440 nm y 490 nm de longitud de onda de excitación (A). La relación se calculó 490/440 (B). Un
In situ
Curva de calibración fue generada por separado para cada uno de la oscuridad y la luz muestras con distintos pH buffers con 0,005% digitonin (C). Vacuolas de las dos claras y oscuras células fueron cultivadas BMS ácida a pH 5,8 y pH no mostraron diferencias significativas (D).
Agradecimientos

Los autores gracias Steven Schwarz de asistencia con la reflectometer experimentos, Biao Ding JC Jang y de asistencia con el uso de microscopios, Mike Zhu para el uso de la placa para la lectura, Annkatrin Rose y Asuka Itaya para la lectura crítica de este manuscrito, J. Marcela Hernández Original para la observación de que las células de la luz oscura, y de la OSU Plant-Microbe Genómica Facilidad de apoyo a la creación de la Metabolomics Laboratorio. Esta investigación fue apoyada con una donación de la Fundación Nacional para la Ciencia (MCB-0139962) para EG.