Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 5-5 (más artículos en esta revista)

Proteína C-reactiva no opsonize principios de los neutrófilos apoptóticos humanos, pero sólo se une a la membrana permeable tarde en apoptosis y no tiene ningún efecto en su fagocitosis por los macrófagos

BioMed Central
Simon Hart P (s.hart @ ed.ac.uk) [1], Karen Alexander H (karenmalexander@hotmail.com) [1], Shonna M MacCall (s.maccall @ ed.ac.uk) [1], Ian Dransfield (i.dransfield @ ed.ac.uk) [1]
[1] MRC Centro de Inflamación de Investigación de la Universidad de Edimburgo, la Escuela de Medicina, Teviot Place, Edimburgo EH8 9AG, UK

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Resumen
Antecedentes

Se ha informado de que la proteína C reactiva (CRP) se une ambos leucocitos Fc γ RIIA (CD32) y la membrana plasmática de las células apoptóticas. Desde Fc γ RIIA se convierte en funcionalmente permitido durante la apoptosis de neutrófilos, tratamos de determinar si CRP obligado a través de los neutrófilos apoptóticos Fc γ RIIA.

Métodos

Estamos preparados etiquetados directamente CRP y demostrado que es esencialmente libre de IgG. Se buscaron las pruebas de PCR vinculante para intacta, membrana impermeable y apoptosis de los neutrófilos humanos Fc γ RIIA transfección de células Jurkat. Se examinaron las consecuencias funcionales de la incubación con el CRP a la fagocitosis de las células apoptóticas por los monocitos humanos derivados de los macrófagos.

Resultados

No hemos podido detectar vinculante de PCR purificado soluble clásica a principios de los neutrófilos apoptóticos humanos o para Fc γ RIIA transfección de células Jurkat. En cambio, la membrana de los neutrófilos apoptóticos permeable fines expuestos fuerte CRP vinculante, que incluye la Ca 2 +-dependiente y la heparina de inhibirse de Ca 2 +-independiente de los componentes. Sin embargo, no hubo efecto de la CRP vinculante para finales de la fagocitosis de los neutrófilos apoptóticos por macrófagos.

Conclusión

Potencial de células apoptóticas opsonins como CRP Mayo, sólo obligará a estructuras intracelulares en células con membranas filtraciones que han progresado a una etapa tardía de la apoptosis.

Antecedentes

En inflamación aguda enorme número de neutrófilos se contrata a los sitios de las lesiones de tejidos en los que mueren por apoptosis en [1]. Macrófagos liquidación de los neutrófilos apoptóticos se ha estudiado ampliamente en virtud de suero libre de las condiciones in vitro, pero la presencia de opsonins inflamatoria en el medio ambiente es poco probable que "desnuda" en apoptosis se tropiezan los macrófagos in vivo [2]. Recientemente hemos informado de que la IgG que contienen complejos inmunes funcionalmente vinculados preferentemente a permitido Fc γ RIIA (CD32) de los neutrófilos apoptóticos [3, 4]. Se ha propuesto que Fc γ RIIA es también un receptor para el pentraxin proteína C-reactiva (CRP) [5, 6], las concentraciones séricas de las cuales pueden aumentar más de 1000 veces durante la inflamación aguda [7, 8]. Independientemente, se informó de que soluble CRP opsonised apoptosis in vitro de células Jurkat [9 - 11]. En el presente estudio se trató de determinar si la unión de la CRP a la apoptosis mediada por neutrófilos fue Fc γ RIIA. Para sortear las dificultades inherentes en la interpretación de los resultados de la unión de los anticuerpos a los receptores Fc-teniendo células, que utiliza directamente fluoresceína conjugado purificada CRP que es esencialmente libre de la contaminación de IgG.

Métodos
Conjugación de CRP con FITC

1 mg de PCR purificado de plasma humano (Sigma, Poole, Inglaterra) fue disuelto en 1 ml de agua desionizada y dializados en contra de bicarbonato de sodio 100 mM pH 8,25. Isotiocianato de fluoresceína (FITC; Sigma) fue disuelto en 1,5 mg / ml en gotas, y añadió DMSO a un volumen total de 45 μ l de proteínas por ml de solución. La mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Cribado FITC fue eliminado por diálisis exhaustiva.

Evaluación de la pureza CRP

Nativos y FITC-conjugado CRP se examinaron con arreglo a las condiciones de desnaturalización en un 9% de gel de acrilamida teñido con azul de Coomassie. Contaminación con IgG humana se evaluó mediante la comparación de Western blots de CRP con cantidades conocidas de la IgG (Sigma). Blots se probaron con conejo F (ab ') 2 de IgG anti-humano-peroxidasa seguido de cabra conjugado IgG anti-conejo (DakoCytomation; Ely, Reino Unido) y desarrollado por mejorar la quimioluminiscencia (Amersham).

CRP fosfolípido vinculante ensayo

Una micrómetros de diámetro microesferas de poliestireno (Polysciences; Warrington, PA) fueron revestidos con 1 mg / ml PhosphorylCholine-conjugados BSA (Biosearch Technologies; Novato, CA) o BSA (Sigma) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Perlas se lavaron y se incubaron con FITC-conjugado CRP en la presencia de 2 mM de Ca 2 + o 5 mM EDTA. FITC-CRP vinculante se midió por única gating sobre cuentas y el análisis de la fluorescencia en FL1 canal (530 nm), a raíz de excitación con un láser de argón a 488 nm en un BD cytometer flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Cowley, Oxford, Reino Unido).

CRP vinculante ensayo

Neutrófilos humanos se aislaron de sangre periférica de voluntarios sanos dextrano por sedimentación y centrifugación gradiente de Percoll discontinuos [12]. La extracción de ADN genómico y la determinación del polimorfismo en la posición 519 en el exón 4 del gen Fc γ RIIA se realizó según lo descrito anteriormente [3]. O un G en la posición 519 provoca tanto una arginina (R) o histidina (H) aminoácido en la posición 131 en el segundo Ig-como dominio de la Fc γ RIIA proteína. Los experimentos se realizaron con células de los donantes con cada uno de los genotipos R / R, R / H, y H / H. Los neutrófilos son de edad en la cultura durante 20 horas a 37 ° C / 5% CO 2 en el medio Iscove (Invitrogen, Paisley, UK), que contiene un 10% o suero autólogo FCS. Transfectadas con células Jurkat Fc γ RIIA humanos o el control de vectores fueron amablemente proporcionados por el Dr Eric Brown, de la Universidad de California, San Francisco, EE.UU. [13]. Superficie fenotipificación inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo confirmó expresión de Fc γ RIIA por la transfección de células, pero no la expresión de γ Fc RI o Fc γ RIII se detectó. Control de las células Jurkat transfectadas con el vector vacío no expresó ninguna receptores Fc. Las células fueron lavadas dos veces en PBS antes de su uso. Cell vinculante ensayos se realizaron en 140 mM NaCl pH 7,4, 20 mM HEPES, y, o bien 2 mM CaCl 2 o 5 mM EDTA. FITC-PCR se incubaron con células durante 30 minutos en hielo, luego lavados dos veces en la unión de amortiguación y se incubaron con conjugados con ficoeritrina Annexin V (Caltag; Towchester, UK) o 5 μ g / ml de yoduro de propidio. En algunos experimentos con células fueron incubadas con 1 mg / ml de heparina no fraccionada (Sigma) y lavada dos veces antes de la incubación con FITC-PCR. Fluorescencia se realizó un análisis del tipo de flujo Coulter Epics XL cytometer (Beckman Coulter, High Wycombe, UK) y / o un flujo FACSCalibur BD cytometer.

La inmunofluorescencia

Ancianos neutrófilos fueron etiquetados con 50 μ g / ml FITC-PCR, fijado en el 3% paraformaldehído, permeabilised con 0,1% Triton X-100, con counterstained TO-PRO-3 (Molecular Probes, Leiden, NL), y cytocentrifuged diapositivas sobre vidrio. Visualización se realizó con un sistema confocal TCSNT Leica (Leica Microsystems, GmBH, Mannheim, Alemania).

Citometría de flujo de células de clasificación

Cultivadas de neutrófilos humanos fueron etiquetados con 25 μ g / ml FITC-CRP y FL1 ordenados de acuerdo a la intensidad de la señal utilizando una BD FACSVantage clasificador celular activado por fluorescencia (FACS). Ordenar las poblaciones de células de pureza comprobado por citometría de flujo, y se examinó la morfología de células en mayo-Giemsa-manchado cytocentrifuge preparativos.

Fagocitosis de los macrófagos finales de los neutrófilos apoptóticos

Neutrófilos humanos fueron etiquetados con CFDA (CellTracker ™ Verde; sondas moleculares) y se incuba a 37 ° C durante 72 h en Iscove del medio que contiene 10% de suero autólogo dará origen a una población celular que figura> 70% fines de los neutrófilos apoptóticos. Ancianos neutrófilos fueron lavados, y se incubaron con 100 μ g / ml o CRP Iscove medio solos durante 30 minutos. Monocapas de 5-8d antiguo humanos derivados de los monocitos macrófagos en 48 y placas fueron incubadas con 2 × 10 6 años de edad en los neutrófilos Iscove del medio, en ausencia de suero durante 60 minutos a 37 ° C [14]. El sobrenadante era aspirado y los macrófagos fueron separadas por breves de incubación en el 0,05% de tripsina-0,02% EDTA (Invitrogen) y vigorosa pipeteado. El porcentaje de macrófagos que habían ingerido una o más neutrófilos apoptóticos se determinó mediante el análisis de citometría de flujo a lo descrito previamente [15].

Análisis estadístico

Los resultados se presentan como media ± SEM de al menos tres experimentos independientes utilizando las células de diferentes donantes. Los resultados se compararon mediante t de Student para datos apareados ya sea a la prueba o de medidas repetidas ANOVA y Tukey-Kramer comparaciones múltiples de prueba en su caso, utilizando GraphPad InStat versión 3 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Resultados
La pureza y la integridad funcional de FITC-conjugado CRP

Encuadernación se han realizado estudios con humanos derivados de plasma CRP que se han conjugado con FITC directamente. Nativo de PCR y PCR-FITC migrado como única bandas cuando examinadas por SDS-PAGE (Figura 1a]. Western Blot demostrado <0,1% de la contaminación de nuestro CRP preparación con IgG humana. (Figura 1b]. FITC-PCR mostró ser funcionalmente activa mediante la demostración de Ca 2 + dependiente de unión a PhosphorylCholine revestida de piedras (Figura 1c]. Del mismo modo, FITC-CRP firmemente vinculado a las células que se habían dictado necrótico por congelación-descongelación (Figura 1d].

CRP no se une a principios de los neutrófilos apoptóticos

Principios de los neutrófilos apoptóticos fueron identificados dentro de una población de neutrófilos humanos cultivados por su característica citometría de flujo láser propiedades de dispersión, el etiquetado con annexin V, y la exclusión de yoduro de propidio. No se encontraron vinculante detectables a concentraciones de PCR e incluyendo hasta 100 μ g / ml, en presencia o ausencia de 2 mM de Ca 2 + (Figura 2]. Las mayores concentraciones de CRP que hemos utilizado es comparable a las concentraciones séricas registrada durante una respuesta inflamatoria aguda. La falta de CRP vinculante se observó independientemente de Fc γ RIIA genotipo (datos no presentados).

La falta de unión de la CRP a Fc γ RIIA

La falta de unión de la CRP a la no-apoptóticos o neutrófilos apoptóticos sugirió que soluble (no agregados) CRP fue incapaz de obligar a Fc γ RIIA con una afinidad significativa. Para su confirmación, las células Jurkat transfectadas con humanos Fc γ RIIA se incubaron con FITC-conjugado CRP. No hubo evidencia de unión de la CRP preferencial a Fc γ RIIA transfección de células en comparación con los transfectadas con el control de vectores (Figura 3].

CRP se une de manera importante a una subpoblación de los neutrófilos humanos cultivadas

Una subpoblación de células fuertemente positiva era evidente cuando FITC-CRP vinculante a ungated cultivadas neutrófilos fue analizado. Estas células también fueron positivos para annexin V propidio y yoduro de tinción (Figura 4a]. Resultados similares se encontraron con linfocitos de sangre periférica humana que se ha de someterse a la apoptosis inducida por la exposición a la radiación ultravioleta (datos no presentados). La inmunofluorescencia cultivadas de neutrófilos humanos reveló CRP fuerte unión a las células que tienen muy poco o ningún residuo nuclear tinción (Figura 4b]. De acuerdo con la citometría de flujo de datos, no se detectables vinculante clásica a principios de los neutrófilos apoptóticos o no a los neutrófilos apoptóticos. Para confirmar la morfología de la CRP-positivas las células, los neutrófilos humanos cultivadas fueron incubadas con FITC-CRP y ordenados en una célula activada por fluorescencia clasificador (FACS). Luz examen microscópico de las dos poblaciones de células confirmó que la PCR de alta células eran "fantasmas" con poca o ninguna evidencia de la tinción nuclear, mientras que la PCR bajo las células compuesto de una mezcla de la no-apoptóticos y principios de los neutrófilos apoptóticos (Figura 4c]. La PCR de alta neutrófilos parecen haber progresado a una etapa tardía de la apoptosis y experimentado "evanescence nuclear" [16, 17].

Mecanismo de CRP vinculante

CRP unión a fosfolípidos depende de la presencia de iones de calcio [18], mientras que polycationic vinculante a los sitios es Ca 2 +-independiente [19]. Para determinar si el Ca 2 + se requiere para CRP vinculante a finales de los neutrófilos apoptóticos comparamos FITC-CRP obligatorio en la presencia de 2 mM de Ca 2 + y 5 mM EDTA. En presencia de EDTA, CRP vinculante se redujo en aproximadamente un 50% en comparación con el total CRP vinculante visto en la presencia de Ca 2 + (Figura 5]. Dado que se ha informado de que la heparina se une a las células Jurkat necróticas [20], que trataron de determinar si la heparina y CRP obligado a intracellullar sitios similares. Pre-incubación con heparina no fraccionada inhibe FITC-CRP vinculante a finales de los neutrófilos apoptóticos humanos en la presencia de cationes en aproximadamente un 50%, y casi abolido residual CRP vinculante cuando se incubaron en presencia de EDTA (Figura 5], lo que sugiere que la obligación de CRP Una combinación de Ca 2 +-dependiente y la heparina de inhibirse de Ca 2 +-sitios independientes.

Fagocitosis de los macrófagos finales de los neutrófilos apoptóticos

Se buscó determinar el efecto vinculante de antes de CRP en la fagocitosis de los neutrófilos apoptóticos tarde. Nuestros intentos para clasificar un gran número de neutrófilos cultivados por FACS en principios y finales de apoptosis poblaciones no tuvieron éxito, ya que durante el tiempo necesario para ordenar muchos principios de los neutrófilos apoptóticos avanzado a finales de la apoptosis, lo que hace que las células no apto para posteriores ensayos de fagocitosis. Posteriormente, hemos preparado los neutrófilos que contienen predominantemente tarde en apoptosis (> 70%) por el envejecimiento de los neutrófilos 72 h in vitro. Antes de incubación de estos fines de los neutrófilos apoptóticos con 100 μ g / ml CRP, que se han traducido en altos niveles de CRP vinculante, no tiene efecto demostrable sobre su fagocitosis por los macrófagos (Figura 6].

Discusión

Se ha informado de que la pentraxins CRP y el suero amiloide P leucocitos son ligandos de los receptores Fc γ [5]. Fc γ RIIA habilitado funcionalmente se convierte en la primera neutrófilos apoptóticos humanos [3, 4], pero hemos demostrado que soluble CRP no se une a los clásicos principios de los neutrófilos apoptóticos humanos in vitro, y no hemos sido capaces de demostrar CRP vinculante para la Fc γ RIIA transfectadas en células Jurkat . En el presente estudio se han cuidado de evitar peligros asociados a la detección indirecta de la unión a ligando neutrófilos mediante una preparación de los etiquetados directamente CRP que hemos demostrado es esencialmente libre de la contaminación de IgG, pero que era estructural y funcionalmente intacto. El fracaso de CRP de obligar a Fc γ RIIA es coherente con los resultados de Hundt y colegas que no pudieron encontrar receptores específicos para la CRP en leucocitos humanos [6].

Ha habido varios informes de Ca 2 +-dependiente opsonisation de las células apoptóticas por pentraxins [9, 11, 21]. La falta de unión a la PCR clásica principios de los neutrófilos apoptóticos humanos, que exhiben todos los cambios bioquímicos y de superficie relacionados con la apoptosis aún permanecen intactas y la membrana impermeable, plantea dudas acerca de si putativo opsonins son realmente capaces de obligar con gran afinidad por las células apoptóticas. En contraste, se demostró muy fuerte CRP vinculante a una subpoblación de edades comprendidas entre los neutrófilos que muestran las características de los neutrófilos apoptóticos tarde se informó anteriormente por Hebert [16] y [17] Ren. Se ha reconocido que la PCR se une a las células necróticas desde Kushner y Kaplan demostrado CRP en la deposición de las fibras de músculo esquelético necrótico después de la vacunación de fiebre tifoidea en vivo [22]. No siempre es reconocido que la inducción de la apoptosis en muchos tipos de células in vitro da lugar a una proporción significativa de la membrana permeable de tarde en apoptosis [23]. La presencia de fugas de células apoptóticas fines de fantasmas en una celda de población puede ser pasado por alto debido a la falta de medios materiales nucleares que se mancha muy ligeramente con Giemsa mayo-, y en los últimos fines de apoptosis puede haber sido enrejada como "desechos" cuando Analizadas por citometría de flujo. Por otra parte, estas células de pellets en cytocentrifuge mal preparados, y esto combinado con su "invisibilidad" con Giemsa de mayo a las manchas significa que su prevalencia se ha subestimado. Esto claramente tiene implicaciones para el estudio de células apoptóticas opsonisation, y gran parte de los datos publicados pueden reflejar vinculante para intracelular fracciones. CRP no es único en la unión al interior de filtraciones en apoptosis, y nos han informado de un fenómeno similar no guarda relación con el suero de proteína thrombospondin [24]. Complemento proteínas, collectins, y heparina también puede unen preferentemente a fines de apoptosis [20, 25, 26]. El responsable de las estructuras precisas CRP vinculante no se han dilucidado, pero nuestros datos indican que hay tanto de Ca 2 + dependiente de Ca 2 +-independiente de sitios de unión. Encuadernación fosfolípidos de la membrana celular puede dar cuenta de la Ca 2 +-dependiente de componentes [18], mientras que a polycations vinculante pueden ser responsables de la heparina de inhibirse de Ca 2 +-componente independiente [19]. La relativa escasez de la cromatina nuclear en la tarde en apoptosis y de la falta de co-localización nuclear visto con microscopía de fluorescencia cromatina vinculante significa que es poco probable que la responsabilidad [21].

La presencia de células apoptóticas tarde también tiene implicaciones para el estudio de la fagocitosis de las células apoptóticas, ya que estas células pueden ser reconocidos de forma diferente clásico temprano en apoptosis [17, 23]. No se sabe si "opsonins" intracelular obligado a componentes sería accesible para el reconocimiento por los receptores fagocítico. En el presente estudio hemos demostrado que, a pesar de muy fuerte CRP vinculante a finales de los neutrófilos apoptóticos, no hubo efecto detectable sobre su remoción por los macrófagos. Ren y colegas demostraron que la eficiencia de la fagocitosis de los principios y fines de los neutrófilos apoptóticos fue similar [17], por lo que creemos que es poco probable que un efecto de la CRP en la captación de tarde en apoptosis ha sido enmascarado por la absorción de los principios de base de referencia los neutrófilos apoptóticos en La población en edad de las células que hemos utilizado.

Conclusión

Mediante el uso de una etiqueta directamente pura preparación de la PCR hemos encontrado ninguna prueba de que CRP opsonises clásica principios de los neutrófilos apoptóticos in vitro. Al igual que otras proteínas y azúcares que intracelularmente se une a la membrana de las células permeables, pero no tiene influencia significativa su posterior fagocitosis por los macrófagos. Una función precisa de CRP que queda por esclarecer.

Abreviaturas

CFDA, 5-chloromethylfluorescein diacetato; PCR, proteína C-reactiva; FACS, activados por fluorescencia de células clasificador

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

SH diseñó el estudio, llevado a cabo la unión y la fagocitosis experimentos, analizar los datos, y redactó el manuscrito. KA llevó a cabo la unión y la fagocitosis experimentos. SM realiza la célula de la clasificación. ID participado en el diseño y ejecución del estudio y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr Eric Brown, de la prestación de los Fc γ RIIA transfección de células Jurkat, y Linda Wilson para el funcionamiento del microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por un Consejo de Investigación Médica Clínico Científico de Becas (G108/460).