Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 23-23 (más artículos en esta revista)

Los estudios sobre las proteínas aumentado sustancialmente en el fluido folicular ovárico de las especies bovina quistes foliculares usando 2-D PAGE y MALDI-TOF MS

BioMed Central
Jiro Maniwa (jiro.maniwa @ astrazeneca.com) [1], Shunsuke Izumi (sizumi@sci.hiroshima-u.ac.jp) [3], Naoki Isobe (niso@hiroshima-u.ac.jp) [1] , Takato Terada (tterada@hiroshima-u.ac.jp) [1]
[1-739-8528, Japón
[2] Preclinical Sciences Department, AstraZeneca KK, Osaka 531-0076, Japan
[3-739-8526, Japón

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Resumen
Antecedentes

El objetivo de este estudio fue identificar las proteínas aumentado sustancialmente en bovinos quística líquido folicular (FF), con el fin de aclarar la etiología de la patología bovina y quistes foliculares de ovario (BOFC).

Métodos

Proteínas en condiciones normales y quística FF muestras fueron sometidas a dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida (2-D PAGE) y se compararon mediante gel de plata manchada con imágenes PDQuest software de análisis de imágenes. Péptidos de este aumento de los puntos fueron analizados por láser asistida por matriz de desorción / ionización-tiempo de vuelo de la espectrometría de masas (MALDI-TOF MS), y se identificaron a partir de la base de datos NCBI por un péptido masa método de las huellas dactilares.

Resultados

Comparado proteómicos análisis mostró 8 puntos el aumento de la proteína presente en quística FF. MS análisis y la búsqueda en bases de datos reveló que el aumento de las proteínas en quística FF se bovina mitocondrial f1-atpase (BMFA), erythroid factor asociado (EAF), metionina sintasa (MeS), VEGF-receptor, glyceraldehydes 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), el calor Proteínas de choque 70 (HSP70), β-lactoglobulin (BLG) y deshidrogenasa succinate Ip subunidad (SD).

Conclusión

Nuestros resultados sugieren que estas proteínas se sobreexpresa en BOFC, y que pueden desempeñar un importante papel en la patogénesis de BOFC. Además, estas proteínas en el FF biomarcadores puede ser útil para BOFC.

Antecedentes

BOFC es uno de los más frecuentemente diagnosticados ginecológica resultados en el ganado, y es un importante problema de la reproducción en las vacas, causando la infertilidad [1 - 3]. BOFC se define generalmente como folículo-al igual que las estructuras de consumo de más de 25 mm de diámetro, sin un cuerpo lúteo en ambos ovarios [1, 4]. Se han producido varias hipótesis acerca de la causa de BOFC, como los factores heredados, de alta lactancia, el envejecimiento, los efectos estacionales, el estado nutricional, el estrógeno y el estrés del medio ambiente [1, 2, 4, 5]. La causa principal de BOFC desarrollo no ha sido dilucidado por la variedad de características histológicas [1], diversos patrones anormales hormonal [1, 4], y las diferentes respuestas terapéuticas [1, 4]. Sin embargo, en general se considera que los quistes se forman en respuesta a un "desequilibrio endocrino" [3, 4, 6]. Varias hipótesis se han propuesto lo que sugiere que la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) y gonadotropina están implicados en la patogénesis de los quistes ováricos. De hecho, algunos autores atribuyen la enfermedad a alteraciones en la síntesis y liberación de GnRH [6, 7], hormona luteinizante (LH) [7 - 9] o incluso a la deficiencia de un receptor en la pituitaria nivel [10, 11].

2-D PAGE, originalmente descrito por O'Farrell [12] en 1975, es el método de elección para la separación de proteínas celulares, en donde las proteínas se separan en dos etapas sucesivas. Esta técnica es una importante herramienta de la proteómica, con la que muchas proteínas manchas pueden visualizarse, lo que resulta en una visión global de un proteoma del estado [13]. Por otra parte, los recientes acontecimientos en 2-D PAGE y espectrometría de masas tecnologías han permitido el análisis cuantitativo de la proteómica diferencial, como una comparación entre la normalidad y el estado de la enfermedad, lo que permite la identificación de los marcadores de proteínas que caracterizan a un determinado fisiológica o patológica de células o tejidos estado [14, 15] que se han utilizado en los campos de diagnóstico y de identificación de biomarcadores de enfermedades animales y humanas [16, 17].

Como se ha descrito anteriormente, la investigación sobre BOFC se ha centrado en las condiciones endocrinológicas [6, 8], pero hay algunos informes de investigación sobre las proteínas en el FF de BOFC. Aunque Mortarino et al. [18] publicó un breve informe de investigación sobre un 2-D PAGE mapa de las proteínas expresadas en el FF de BOFC, se utilizó un 2-D PAGE proceso usando FF que no se había agotado de abundantes proteínas como la albúmina o inmunoglobulina G. Por lo tanto, se pensó que se pasa por alto los puntos de menor, pero importante de proteínas. Muranaka et al. [19] examinó también la proteína en francos franceses, el contenido de proteína total en el FF de BOFC fue significativamente más bajo que el de la FF de folículos normales.

Este estudio fue diseñado para determinar cualquier aumento de las proteínas sustancialmente en el FF de BOFC utilizando una técnica de la proteómica diferencial. Los resultados ayudarán a aclarar la etiología de la patología y BOCF y contribuirá al descubrimiento de biomarcadores BOFC.

Métodos
Diseño experimental

Este estudio consistió de las dos siguientes fases experimentales: 1) examen de la proteína muestra los preparativos de FF, y 2) la evaluación del aumento de las proteínas en el FF de BOFC por 2-D PAGE.

Experimento 1: Examen de proteínas preparación de la muestra

Quística folículos se obtuvieron de las vacas lecheras en un matadero local. FF fue aspirado cuidadosamente con una jeringa de 20 ml, y se centrifuga a 10000 × g a 4 ° C por 30 minutos para eliminar las células y otros materiales insolubles, y se almacena a -30 ° C hasta su procesamiento para la preparación de muestras de proteínas.

Tres tipos de proteínas FF muestra se prepararon con el fin de encontrar un método para la preparación de la muestra 2-D PAGE.

Tipo A: No tratamiento

Tipo B: agotan las impurezas (sales, lípidos, ácidos nucleicos o detergente)

Tipo C: agotan ambas abundantes proteínas (albúmina e IgG) e impurezas;

Un detallado método de preparación de muestras para el agotamiento de los abundantes proteínas y las impurezas de tipo C se muestra en la siguiente sección sobre "Preparación de la muestra". No agotado FF fue utilizado como Tipo A. agotan las impurezas de FF se utilizaron como Tipo B. Las muestras de agotamiento de ambos abundantes proteínas (albúmina e IgG) y de las impurezas se utilizaron como Tipo C. Estas muestras fueron sometidas a 2-D PAGE y la plata Mancha gel imágenes fueron comparadas visualmente.

Detalles de la preparación de muestras, 2-D PAGE y tinción de plata se muestran en la última parte de esta sección.

Experimento 2: Evaluación de aumento de las proteínas en el FF de BOFC

Con ovarios (n = 4) o sin (n = 3) quística folículos se utilizaron en este experimento. Un quiste folicular fue diagnosticada cuando el folículo fue mayor a 25 mm de diámetro, en la ausencia de un cuerpo lúteo funcional, en tanto la derecha y la izquierda ovarios [1]. Folículos de unos 10 mm de diámetro de los folículos ovarios sin quística se utilizaron como grandes folículos normales. Alrededor de 300 - 1000 μ l de FF fue aspirado cuidadosamente de cada folículo con una jeringa. Después de measureming progesterona y estradiol-17 β en FF, FFs quística de folículos y se almacenan por separado los de folículos normales se combinaron.

Cada folículo se fijó en formalina después de la aspiración de FF, procesado por examen histológico y teñidas con hematoxilina y eosina utilizando un método estándar.

La proteína FF muestras fueron preparadas por el método de Tipo C (ambos agotados de abundantes proteínas (albúmina e IgG) e impurezas). Cada una de las muestras de folículos quísticos combinaron con muestras de control se tramitó simultáneamente por 2-D PAGE dos veces y geles se visualizaron por tinción de plata. Los geles fueron teñidos escaneados utilizando un escáner de escritorio y de las imágenes escaneadas de quística y FFs normal se analizaron con la versión 7.1 del software PDQuest (Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, EE.UU.). Expresiones de proteínas manchas en las imágenes de quística FFs normal y que se tramitaron por 2-D PAGE se compararon simultáneamente, y una comparación general de los resultados del 4 quística folículo imágenes se hizo.

Ocho puntos de proteínas, que son más de quística FF fueron extirpados de la plata manchada geles y sometidos a análisis de espectrometría de masas y la identificación de proteínas.

Los detalles de cada proceso experimental se dan en la siguiente sección.

Inmunoensayo enzimático de la progesterona y estradiol-17 β en el líquido folicular

El procedimiento de ensayo inmunoenzimático para la progesterona y estradiol-17 β fue seguida, tal como se describe anteriormente [20]. FF diluye con H 2 O se extrajeron con éter de petróleo o de la progesterona dietiléter de estradiol-17 β. La decantada éter fase se seca en un tubo de vidrio y un buffer (0,05 mol / L de ácido bórico, 0,2% BSA) se añadió. Estas muestras se colocaron reconstituido en los pozos de un microtiterplate que fue previamente recubierto con una anti-conejo de anticuerpos IgG (ICN, Pharmaceuticals Inc, EE.UU.), seguida por la adición de un anticuerpo anti-progesterona y Horseradish peroxidasa (HRP) conjugado para progesterona progesterona , Y un anti-estradiol-17 β anticuerpos (Kambegawa Institute, Tokio, Japón) y conjugado HRP estradiol-17 β (Kambegawa Inst.) Para estradiol-17. Después de 2 h de incubación se lavaron platos y un 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine solución se aplicó en el sustrato seguido de la lectura de densidad óptica de las mediciones con una longitud de onda de 450 nm.

Proteína preparación de la muestra

Inicialmente, el contenido de proteína total en FF se determinó utilizando un kit comercial de proteínas de ensayo (DC Proteína de ensayo, laboratorios Bio-Rad Inc, Hercules, EE.UU.). Después de medir el contenido de proteína, alta abundantes proteínas, la albúmina y la inmunoglobulina G (IgG) fueron retirados de las FF Aurum utilizando un mini kit de proteína de suero (laboratorios Bio-Rad, Inc, Hercules, EE.UU.) para permitir la visualización de las proteínas de baja abundancia. A continuación, las proteínas en agotado FF muestras se concentraron por centrifugación usando un 3 kDa cortar unidad de filtros de membrana de celulosa (Microcon YM-3, Millipore, Bedford, EE.UU.). Por último, las impurezas tales como sales, lípidos, ácidos nucleicos o detergente fueron retirados de las muestras concentradas utilizando un 2-D Clean-Up Kit (Amersham Biosciences, San Francisco, EE.UU.).

2-D PAGE

Cincuenta μ g de proteína de la muestra se disolvió en una muestra de amortiguación (8 M urea, 0,5% ampholine ph3.5-10, 0,5% Tritón X-100, 10 mM dithiothreitol (TDT) y Orange G). La muestra de amortiguamiento, incluyendo 50 μ g de proteína, fue absorbida en un gradiente de pH inmovilizado (IPG) tira (Immobiline Dry Strip, 11 cm, pH 3-10, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) durante la noche. La franja rehidratada fue sometido a isoeléctrico centrándose en una cámara de electroforesis MultiPhor II (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para un total de 22651 Vh a 15 ° C. La banda se centró IPG equilibrado en dodecil sulfato de sodio (SDS) de amortiguación (30% glicerol, 1,0% SDS y 6 M urea en 50 mM Tris-HCl). El primer paso equilibrio se llevó a cabo en SDS equilibrio de amortiguación con 16 nM TDT, y la segunda parte de la SDS equilibrio de amortiguación que figuran 240 mM iodoacetamide y azul de bromofenol. Ambas medidas equilibrio duró 15 minutos a temperatura ambiente. El equilibrado IPG franja se colocó sobre un gradiente de 8-18% en gel de gradiente de poliacrilamida (SDS ExcelGel, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para la segunda dimensional SDS-PAGE. La SDS-PAGE se realizó a 20 mA durante 30 min, 50 mA durante 5 min y 50 mA durante 70 min a 15 ° C con toma de corriente de 600 V de limitación y 30 W utilizando una cámara de electroforesis MultiPhor II. Después de la separación en SDS-PAGE, las proteínas en el gel se fija y visualizados por tinción de plata utilizando un Kit Plus Silver Stain (Bio-Rad Inc laboratorios, Hercules, EE.UU.).

Espectrometría de masas y análisis de la identificación de proteínas

El anuncio fue extirpada de la plata manchadas de gel y, a continuación, digeridos con tripsina utilizando un método descrito previamente [21]. Para la digestión en gel, gel de las piezas se sumergieron en el 50% acetonitrilo solución durante 10 minutos y este proceso se repitió varias veces. Después de un lavado con acetonitrilo, acetonitrilo se ha retirado y el gel de piezas se secaron en una centrífuga de vacío durante 10 min. El gel piezas fueron sacudidos con 100 μ l de solución de la reducción (10 mM de TDT y 25 mM de bicarbonato de amonio) por 60 min a 56 ° C. Posteriormente, el gel de las piezas se agita bajo la oscuridad con 100 μ l de una solución alquilantes (55 mM y 25 mM iodoacetamide bicarbonato de amonio) durante 45 min. El gel de las piezas se agita con un 50% de acetonitrilo y 25 mM de bicarbonato de amonio durante 10 minutos dos veces. El disolvente se eliminó, y el gel de piezas se secaron de nuevo. El gel piezas fueron sumergidos en una solución que contenga la digestión 12,5 μ g / ml secuenciación grado modificados tripsina y 25 mM de bicarbonato de amonio y se incubaron en hielo durante 10 min. Después de eliminar no absorbida solución, el gel de piezas se incubaron durante 16 horas a 37 ° C. Digeridos péptidos se extrajeron dos veces de piezas de gel con 50 μ l de acetonitrilo 50% y 0,1% de ácido trifluoroacético. El agrupados sobrenadantes se secaron en una Speed Vac, y los péptidos se disuelve en 10 uL de 50% acetonitrilo with0.1% ácido trifluoroacético. MALDI-TOF MS se realizó en un Ultraflex tiempo de vuelo de instrumento (Bruker Daltonics, Billerica, EE.UU.), equipado con un láser de nitrógeno a 337 nm. Todos MALDI-TOF resultados se obtuvieron en el reflector de modo positivo utilizando α-cyano-4-hydroxycinnamic ácido (solución saturada en el 50% de acetonitrilo, con 0,1% de ácido trifluoroacético) como la matriz. Analitos se prepara mezclando 0,5 μ l de la muestra péptido con 0,5 μ l de la matriz soln. MALDI sobre una placa y se permite que el aire seco a temperatura ambiente en una campana antes de insertar luego en el espectrómetro. Espectros de masa fueron calibradas con la angiotensina II (1046,54 Da), la angiotensina I (1296,68 Da), la sustancia P (1347,74 Da), bombesin (1619,82 Da), la hormona adrenocorticotropa (ACTH18-39) (2465,20 Da), y la insulina (5733,54 Da) . Todas las masas son reportados como monoisotopic valores de masa. Además, los péptidos derivados de la tripsina (843,02 y 2212,44 Da) se utilizaron para la validación cuando se observó claramente. Los péptidos se identificaron con el programa de búsqueda de Mascotas (http://www.matrixscience.com, Matrix Science, Londres, Reino Unido) en contra de la base de datos NCBI para realizar resúmenes teóricos tripsina y búsqueda de posibles sin modificar tríptico péptidos (con un máximo de un perdido división) O sospecha de las especies modificadas. Metionina residuos fueron considerados como normales, ya sea Met o su forma oxidada (Met-buey), y residuos de cisteína se consideraban carbamidomethylated (C-cam) o reaccionaron con acrilamida para producir Cys-Sb-propionamide (C-pam).

Análisis estadístico

Las diferencias en la concentración de estradiol-17 β y progesterona en el fluido folicular, y la proporción de los que las concentraciones de la hormona entre normal y folículos quísticos fueron analizados por análisis de varianza, seguido por el estudiante de la t-test. Las diferencias se consideraron significativas a P <0,05.

Resultados
El examen de la preparación de muestras de proteínas

2-D PAGE imágenes de tipo A (sin tratamiento), tipo B (agotado de las impurezas) y tipo C (agotadas de las dos proteínas y abundantes impurezas) se muestra en la Fig. 1. Sólo algunos grandes vetas y manchas se ve en la imagen de gel tipo A. Después de la eliminación de impurezas, tales como sales, lípidos y ácido núcleos, el gran vetas desaparecido, pero hay alrededor de 15 puntos, entre ellos un gran terreno de albúmina, en el gel Imagen de tipo B. Por tanto la eliminación de impurezas y abundantes proteínas, la imagen se ha mejorado, y cerca de 40 puntos se visualizaron en el gel de imagen de tipo C.

Evaluación del aumento de las proteínas en el FF de BOFC

El examen histológico, los folículos ováricos de los ovarios sin quistes utilizados como controles normales en este estudio (Grupo A en la figura 2] estaban intactos y se evaluaron a ser grandes folículos normales y sanos. Por otra parte, las capas de células de la granulosa se exfoliadas y de la teca interna de los folículos quísticos son más delgadas que las de los folículos normales (Grupo B en la figura 2], y se evaluaron como etapa tardía folículos quísticos.

Los ratios de estradiol-17 β / progesterona para tres de los cuatro quística folículos se encontraban por debajo de 1, y las de todos los folículos normales son superiores a 1 (Tabla 1].

FFs de folículos normales fueron en general palish amarillo a amarillo y de los folículos quísticos se fulvescent y amarillo oscuro. Esto sugiere interfusion de sangre en el FF de folículos quísticos. El contenido de proteína total en FFs se muestran en la Tabla 1. Aunque el número de muestras es limitado, no hay ninguna tendencia en particular, el contenido de proteínas, con independencia de los quistes.

Se comparó la expresión diferencial de proteínas por PAGE 2-D de FFs de quística y folículos normales. Plata detectaron manchas sobre manchas de proteínas 30-40 sobre imágenes de ambos normal y folículos quística (Grupo A, y Bs en la figura 3, respectivamente). Sólo había grandes manchas en la imagen de los folículos normales, mientras que las pequeñas manchas de proteínas minoritarias no se detectaron en un panel de la Figura 3. Por otra parte, hay alrededor de 30 puntos en la imagen quística de folículos, y estas incluyen alrededor de 10 proteínas minoritarias manchas en paneles B1 y B2, como se muestra en la Figura 3. La mayoría de estos lugares fueron agrupadas en una plaza en la zona de paneles B1 y B2. Una imagen comparación utilizando PDQuest mostraron aumento de 8 puntos se estable proteína presente en todos los geles FF quística (Grupo C en la Figura 3]. Todos los 8 puntos fueron digeridos y dirigido a MALDI-TOF MS análisis para la identificación de proteínas. Búsqueda en bases de datos de huellas dactilares con el péptido en masa por MALDI-TOF-MS/MS análisis identificó la proteína de los puntos N º 1 al 8 como BMFA, EAF, MeS, VEGF-receptor, GAPDH, HSP70, BLG y SD (Tabla 2], respectivamente. A pesar de que el peso molecular y punto isoeléctrico de HSP70 informó calculado a partir de la estructura primaria difieren de las extrapolado por la posición de la mancha en el gel, se confirmó por MS / MS análisis de secuencia de aminoácidos que la proteína de terreno N º 6 se HSP70 .

Discusión

Se ha informado de que FF bovina incluye abundantes proteínas, como la albúmina y IgG [19]. Mortarino et al. [18] llevó a cabo 2-D PAGE en la BOFC de FF, que no se agote de estas proteínas abundantes, de manera que pasa por alto algunos puntos de menor, pero importante de proteínas. Por lo tanto, el efecto de eliminar las impurezas y abundantes proteínas, tales como sales, lípidos, ácidos nucleicos y detergente, de las FF en 2-D PAGE fue examinado en el presente estudio con el fin de obtener satisfactorios 2-D PAGE imágenes diferencial de la proteómica. La calidad de las 2-D PAGE imágenes se ha mejorado y el número de manchas visualizado por el aumento de la eliminación de abundantes proteínas, como la albúmina y IgG de FF, así como otros fluidos corporales, el suero [22, 23], líquido cefalorraquídeo [24] Bilis y [25], y mediante la eliminación de obstáculos, tales como sales, ácidos nucleicos y lípidos, para el isoeléctrico centrándose proceso [26] en este estudio. Concomitante a la eliminación de la albúmina e IgG, se produjo un importante aumento en la intensidad de la tinción de varios puntos menor abundancia de proteínas. Esto indica que 2-D PAGE utilizando refinados FF es una útil herramienta para la investigación experimental sobre la fisiología de FF en los ovarios de granja y animales de experimentación.

La muestra folículos ováricos utilizados en este estudio fueron examinadas y morfológicamente endocrinologically. Los diámetros de los folículos quísticos fueron superiores a 25 mm por la observación macroscópica; las capas de células de la granulosa ya exfoliadas y de la teca interna en la que algunos folículos quísticos son más delgadas que las de los folículos sanos. Estas observaciones muestran que los folículos examinados en el presente estudio fueron etapa tardía folículos quísticos [1, 27 - 29]. No dominantes reduce quística folículos mostraron menores estradiol-17 β y las concentraciones más altas concentraciones de progesterona comparar a la normalidad folículos quísticos o folículos dominantes, de modo que la proporción de estradiol-17 β / progesterona de la no dominante quística folículos se reduce por debajo de 1 [30]. Los ratios de estradiol-17 β / progesterona de tres de los cuatro folículos quísticos en este estudio fueron inferiores a 1 y estos valores están en consonancia con el examen histológico, es decir, que estos folículos se alturas folículos quísticos.

Este estudio fue diseñado para identificar las proteínas específicas en el marco financiero de BOFC el fin de ayudar a esclarecer la patología de BOFC utilizando 2-D PAGE. Hemos encontrado 8 puntos adicionales de proteínas en el gel de los folículos quísticos en comparación con el control normal, y estas proteínas se identificaron como BMFA, EAF, MeS, VEGF-receptor, GAPDH, HSP70, BLG y SD usando el MOLDI-TOF MS técnica.

Proteínas de choque térmico (HSPs) son codificadas por los genes cuya expresión es sustancial en las condiciones estresantes, tales como golpes de calor, la inhibición del metabolismo de la energía, la exposición a metales pesados, estrés oxidativo, la inflamación y [31, 32]. En estas condiciones, HSPs aumentar la supervivencia celular mediante la protección y la desagregación de las proteínas de estrés-lábil. En ninguna de las condiciones de estrés, HSPs tienen múltiples funciones del hogar, como plegables y translocating nueva síntesis de proteínas [32, 33]. Se confirmó que HSP70 se expresó claramente en las células de la granulosa de los ovarios humanos in vitro [34], y es sintetizada por las células del cumulus y ovocitos de vacas en [35], y dentro de las células de la granulosa de folículos en ratas [36]. HSPs desempeñar un papel importante en la fertilización y el desarrollo embrionario temprano [37 - 39]. Recientemente, la capacidad de inhibir la apoptosis ha pasado a ser ampliamente reconocida como una función de la HSP70, y esta capacidad puede contribuir a su efecto protector frente a la muerte celular [39 - 42]. HSP70 inhibe la apoptosis y este efecto se puede atribuir a neutralizar sus interacciones con varios proapoptótico efectores [40]. Isobe y Yoshimura [43] informó de que en la teca interna de las especies bovina folículos ováricos, una alta frecuencia de apoptosis se observó a principios de los folículos quísticos, mientras que esta frecuencia disminuyó a fines de folículos quísticos. Llegaron a la conclusión de que la disminución de la tasa de apoptosis de las células puede ser responsable del retraso en la regresión folicular, y que el control de la apoptosis puede ser esencial para reducir la incidencia de folículos quísticos. Esta observación es consistente con nuestro resultado de que HSP70, que disminuye la muerte de las células apoptóticas, se aumentó en el FF de folículos quísticos. Peter [3], hizo hincapié en que la comprensión de los mecanismos que regulan las células de la granulosa el crecimiento, diferenciación y apoptosis es de gran importancia clínica porque aberrantes señalización en ninguna de estas vías es que pueden estar relacionados con quística en los ovarios. HSP70 podría ser la clave de las proteínas relacionadas con la apoptosis en las células de la granulosa. Se cree que las vacas con quistes foliculares se ven expuestos a diversos tipos de estrés, tales como el estrés oxidativo [29], el balance negativo de energía, mala función hepática y que circulan bajo factor de crecimiento tipo insulina-I [44]. Aunque la relación entre estos y destaca el aumento de la HSP70 en FF en este estudio no está clara, se especuló que la sobre expresión de HSP70 disminuye la apoptosis en la teca interna y conduce a la demora en la regresión de folículos quísticos que habían impedido la ovulación, debido a un desequilibrio hormonal .

VEGF que se conoce como hipoxia-inducible mitogen de las células endoteliales [45], y también se menciona como un factor de permeabilidad vascular [46], que afectan a la vasodilatación y la permeabilidad capilar y estimular el crecimiento de las células endoteliales y la angiogénesis in vivo. VEGF y sus receptores se han encontrado en los ovarios de numerosas especies incluidas las especies bovina, ovina, porcina y mono ovarios, y puede ser importante reguladores de la angiogénesis ovárica [47]. En los seres humanos, VEGF está implicado en la etiología de los trastornos graves reproductiva como el síndrome de ovario poliquístico, y en este síndrome, elevación de VEGF pueden interactuar con sus receptores, como Flk-1/KDR, en los ovarios, la prevención de la apoptosis de células de la granulosa y La resultante folículo atresia, contribuyendo así al crecimiento y la persistencia de un gran número de folículos [45]. Isobe et al. [48] informó de que el número de positivos los buques y las zonas con factor de von Willebrand, un indicador de daño endotelial, se redujo significativamente en la teca de folículos en asociación con el quiste de desarrollo. Esto sugiere que un menor número de cambios degenerativos en la vasculatura producen en BOFC, lo que permite un suministro de sangre y puede resultar en el mantenimiento de la estabilidad del tejido folicular y la continuación de la acumulación de FF. El aumento de los receptores de VEGF, que es bien conocido como un mitogen de células endoteliales y un factor de permeabilidad vascular, en el presente estudio puede haber sido asociada con el crecimiento folicular anormal a través de un constante suministro de sangre y la acumulación de francos franceses procedentes de suero en el BOFC .

BMFA es el componente soluble en el agua de la ATP sintasa, la enzima y desempeña un papel central en la transformación de la energía en la mayoría de los organismos vivos [49]. SD es una enzima clave que participan en el ciclo del ácido tricarboxylic y fosforilación oxidativa como parte de la cadena respiratoria mitocondrial [50]. MeS es una importante enzima celular del hogar [51] y metionina es el más aminoácido limitante para el cultivo de ganado [52]. Por lo tanto, las fluctuaciones de los aminoácidos o energía en el metabolismo de las vacas con folículos quística puede conducir a un aumento BMFA, SD y MeS. Sin embargo, no existe información específica sobre las tres proteínas o EAF, BLG en el PIB y la fisiología ovárica, desarrollo folicular y / o regresión, y la relación exacta entre folículos quísticos y estas proteínas Queda por aclarar.

La mayoría de las proteínas identificadas en el líquido folicular de folículos quísticos en el presente estudio no son el tipo de factores que uno esperaría encontrar secretada en el líquido folicular, que son en su mayoría proteínas intracelulares. Isobe y Yoshimura [43] informó de que en la apoptosis vende capa granulosa se observaron en quística folículos, y las células de la granulosa capas exfoliadas también en este estudio. Por lo tanto, estas proteínas intracelulares podría ser aprobada en el FF degenerado de la capa granulosa. Por otra parte, el quística folicular fluidos utilizados en este estudio eran de color amarillo oscuro y fulvescent, sugiriendo interfusion de sangre en el FF quística de folículos, y EAF se incrementó en quística FF. Por lo tanto, la posibilidad de que estas proteínas llegó a través de la sangre no se puede descartar. Nuevas investigaciones acerca de la fuente de estas proteínas y el mecanismo por el que entró en el FF son necesarios.

Conclusión

En conclusión, a pesar de que examinó principalmente etapa tardía quistes y puede ser sólo una escena complicada BOFC de formación, se identificaron 8 aumento de las proteínas en el FF de BOFC mediante 2D-PAGE y la MOLDI-TOF MS técnica. Nuestros resultados sugieren que estas proteínas juegan un papel importante en la etiología de BOFC, y que la sobre expresión de HSP70 puede contribuir a retrasar la regresión folicular por la disminución de la apoptosis en la teca interna, y la sobre expresión de los receptores de VEGF puede estar asociada con folicular anormal El crecimiento y la acumulación de FF. Además, el 8 proteínas encontradas en el FF podría utilizarse como biomarcadores para los quistes ováricos. Se necesitan más estudios para aclarar la etiología de la patología y BOFC incluido el examen de la fuente de estas proteínas, su interacción, la relación entre estas proteínas y de la fisiología ovárica, FF y de las diversas etapas de folículos, incluyendo atretic folículos dominantes y quistes.

Contribuciones de los autores

JM fue responsable del diseño, la coordinación del estudio y los experimentos que realizó mediciones hormonales, 2D-PAGE, y la identificación de proteínas, participó en el análisis de los datos y en la redacción del manuscrito. SI colaborado en la MOLDI-TOF MS análisis y la identificación de proteínas. NI colaborado en la mediciones hormonales y exámenes histológicos. TT fue responsable del diseño y la coordinación del estudio. Se analizaron los datos y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Agradecemos al personal de la Oficina de Inspección de Carne de la ciudad de Hiroshima para el suministro de las especies bovina ovarios. También damos las gracias al Sr Mateo Man, AstraZeneca KK, Inglés para su corrección del manuscrito.