Expresión de la AID en la levadura induce mutaciones en el contexto similar al contexto de la hipermutación somática en GC pares en los genes de inmunoglobulina

El sistema inmune utiliza varias estrategias para modificar el material genético para generar diversos tipos de anticuerpos de alta afinidad [1]. Estas estrategias permiten la producción de múltiples variantes de anticuerpos a una amplia gama de diferentes antígenos [2]. Inicialmente, los receptores de antígeno son generados por un sitio específico proceso llamado recombinación V (D) J recombinación que se forman en la médula ósea [3]. Sin embargo, esto no es suficiente para asegurar una adecuada respuesta inmune. Pareja linfocitos B emigran a los órganos linfoides secundarios donde encuentran antígenos. Tras la activación de los antígenos, los linfocitos B maduros comienzan a proliferar y formar centros germinales, donde los genes de inmunoglobulina sufrir modificaciones adicionales: cambiar la clase de recombinación (RSE), la conversión de genes de inmunoglobulina (CIG) y la hipermutación somática (SHM) [4]. SHM, la CIG y la responsabilidad social de la empresa, requieren un activo transcripción [5] y generar diversidad de los anticuerpos, que es seguido por la selección conduce a la producción de anticuerpos de alta afinidad [6]. La frecuencia de mutaciones durante este proceso es hasta seis órdenes de magnitud más alta que en otros genes [6]. La mayoría de las mutaciones son la base par de sustituciones, que se producen con una frecuencia similar en GC y AT de pares de bases. Estadísticamente preferido hotspots para mutaciones en pares GC son RGYW RGYW RGYW / WRCY WRCY WRCY motivos (GC mutación están subrayadas, R significa base de purina, Y defiende base del pyrimidine y W está a favor de una o T) [7], o recientemente refinado DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH motivos (D está a favor de G, T o A) [8]. Hotspots de mutaciones en el AT se encuentran en pares WA WA / TW TW motivos (mutación AT están subrayados) [9].

Un importante avance en la comprensión de los mecanismos de responsabilidad social de la empresa, la CIG y la SHM fue el descubrimiento de que todos ellos dependen de la activación inducida por citidina deaminasa, AID [10 - 16]. Los pacientes con defectos AYUDA han gigante centros germinales y niveles elevados de un solo tipo de anticuerpos de baja afinidad, IgM. Ellos padecen de infecciones bacterianas recurrentes en las vías respiratorias [17] debido a la falta de respuestas de anticuerpos eficaces que dependen de varios pasos cruciales de la terminal de la diferenciación de células B, incluyendo la RSE y la SHM. SHM está dirigida a regiones específicas de ADN en tejidos especializados. Defectos en esta orientación puede resultar en todo el genoma mutagénesis y cáncer. Los linfomas de células B poseen translocaciones que pondrán en proto-oncogenes inmunoglobulina loci (ver [18]]. AYUDA Constitutiva de expresión en ratones resulta en un aumento de incidencia de tumores [19].

Cuando se descubrió, se pensó AID para actuar en la mutagénesis y recombinación en la inmunidad por la edición de ARN [10, 11, 20]. Se propuso que en las ediciones previas-AID mRNA encoding una nicking endonucleasa el que se inicia SHM, la CIG y la responsabilidad social de las empresas [5]. Este modelo se denomina "edición de ARN" [20]. La AID es homóloga a la conocida edición de la enzima ARN-APOBEC1, que deaminates cytosine en la posición 6666 en ApoB100 mRNA y aparentemente no tiene ningún papel en la inmunidad. AYUDA posee la capacidad de deaminate citidina, y lanzaderas entre el núcleo y el citoplasma similar a APOBEC1 [4, 5, 21, 22]. Una hipótesis diferente, llamado "DNA deamination", sugiere AYUDA deaminates cytosine directamente y que uracil generados en esta reacción desencadena reacciones de los líderes de inestabilidad genética [23 - 26] (ver [27 - 33] para comentarios).

Experimental se están acumulando pruebas a favor de la hipótesis de DNA deamination AYUDA función [29, 31 - 34]. AID es capaz de inducir SHM y de la RSE en hibridomas y en los fibroblastos, lo que sugiere que es la única de células B componente específico necesaria para la inducción de ambos eventos genéticos [13, 14, 35]. AID también pueden inducir mutaciones cuando se expresa en E. Coli [24]. Estas mutaciones ocurren en la misma secuencia de ADN motivos como mutaciones durante SHM [8, 36]. Por lo tanto, la célula eucariótica específicos de los componentes no son necesarias para la mutagénesis. Mutator Este efecto es mayor en uracil-DNA glycosylase con déficit ung1 cepas, que son incapaces de reparar en uracil ADN [37], lo que sugiere que la de cytosine deamination a uracil en el ADN es la causa de estas mutaciones [24]. Se encontró que la expresión de dos homóloga deaminases, APOBEC1 y APOBEC3G, es altamente mutagénico en bacterias [38]. Casi todas las mutaciones que surgen tras la expresión de estos deaminases se GA a AT transiciones, en consonancia con el modelo de ADN deamination. AYUDA deaminates solo desamparados y abandonados a supercoiled doble de ADN [39 - 44] (véase también el examen [31]]. AYUDA exposiciones clara secuencia de ADN contexto específico, que se asemeja a la especificidad de la GC a AT componente de mutagénesis SHM (GYW GYW / WRC WRC motivos, ver [8, 40, 44 - 46]]. La especificidad de las mutaciones inducidas en bacterias es consistente con deamination predominante de la no transcritas filamento de la DNA [36, 45], que se piensa que es solo varados durante la transcripción (revisado en [31]]. Durante SHM, sin embargo, los dos filamentos de la DNA son blanco de mutagénesis [7], [47]. Esta discrepancia entre los parámetros de los vertebrados y en SHM deaminasa inducida por mutagénesis en procariotas que aún queda por resolver.

Para caracterizar los pasos iniciales de las mutaciones inducidas por AID, hemos examinado la especificidad de la mutator efecto de la AID humanos expresada en la levadura. Hemos construido una levadura con un vector humano sintetizado artificialmente AYUDA insertar genes usando codones altamente expresado común a los genes de levadura. Se encontró que la expresión del gen artificial hAIDSc fue moderadamente mutagénico en la cepa de tipo salvaje y altamente mutagénico en el ung1 cepa, similar a la de expresión sin modificar AYUDA humanos [48]. Esto es coherente con la uracil DNA deamination modelo de mutagénesis. Se identificaron un espectro de mutaciones en el gen CAN1 se producen en la naturaleza y el tipo de cepas ung1 expresando hAIDSc. Se comparó la secuencia contexto de las mutaciones inducidas por AID en la levadura en GC con bases de mutaciones somáticas en los genes de inmunoglobulina. Estas comparaciones revelaron significativamente similares propiedades y seguir apoyando la hipótesis de que la AID es una de las causas principales de la GC mutaciones en los genes de inmunoglobulina en pares durante SHM.

Codón de uso es diferente en la levadura y los humanos. Para mejorar nuestro sistema de expresión de la AID sobre el trabajo publicado anteriormente [48], hemos construido un nuevo vector de expresión de levadura con el gen humano AYUDA recodificado para utilizar el mismo utilizado por los codones altamente expresado genes de levadura y de galactosa con un promotor inducible. Proceda transformantes crecían en el medio que contienen galactosa y la AID fue la proteína fácilmente detectados en los extractos de levadura por Western blot (Fig. 1, carril 3).

La expresión de la hAIDSc no dio lugar a ninguna profundo de inhibición del crecimiento de la célula título normalmente en torno al 5 × 10 ^7, que es típica de los que contienen galactosa mínimo a medio (datos no presentados). Las tasas de mutación fueron analizados por análisis de fluctuación (Tabla 1]. Nuestro cepa permite la detección de diversas clases de eventos genéticos (ver Materiales y Métodos, y también [48, 49]]. El uso de este cepa podemos obtener la información acerca de expresar el carácter específico del efecto mutagénico.

La expresión de la hAIDSc no indujo mutaciones frameshift a Su ⁺ (última columna del cuadro 1]. En Ung1 ⁺ cepas, hAIDSc expresión conduce a un aumento de 7,6 veces ^¿r mutaciones adelante y un 3 - 6 veces más en la reversión de mutaciones sin sentido (Ade ^+, Trp ^+). La mutación ung1 per se llevó a un 5 - 10 veces aumento de las tasas de mutación, como se muestra en las filas uno y cuatro. Cuando el hAIDSc se expresó en la ung1 cepa, la mutator efecto multiplicativo fue para adelante ^¿r mutaciones (82 veces más que la cepa de tipo salvaje) y sinérgicos para la reversión de mutación sin sentido (a 404 - 1290 veces más que de tipo salvaje). TAG y TAA mutaciones sin sentido no puede volver atrás por cierto-a través de mutaciones de GC a AT transiciones. Hemos demostrado previamente por el análisis genético y la secuencia de revertants reversión que se produce por supresores dominante y, probablemente, representan mutaciones en el anticodon del tRNA genes, que podrían ser de GC A-Ts [48]. La alta respuesta de ade5-1 y trp1-289 marcadores a hAIDSc puede reflejar el papel de la AID en la transcripción inducida por la hipermutación en la levadura, desde el tRNA genes son transcritos diferente de genes metabólicos. El alelo ura3-29 reversión fue estimulado sólo débilmente. Se sabe, que el alelo revierte a través de diversos cambios en la GC en par "TCT" secuencia de ADN contexto [50], que es diferente de focos de AID deaminations. Los resultados sugieren que uracil DNA deamination es la principal fuente de la mutación inducida por la hAIDSc en la levadura y que sean compatibles con nuestros estudios anteriores [48]. Optimizado codón de uso no se ha traducido en el aumento de la mutagénesis en condiciones de constante inducción de la galactosa promotor desde el potencial mutagénico de expresión de la hAIDSc es comparable con expresión de los nativos AID humanos [48].

Se estudió la especificidad de las mutaciones en el gen CAN1 inducida por la expresión de los hAIDSc. ¿Independientes ^r mutantes se obtuvieron en condiciones de hAIDSc expresión en la naturaleza y el tipo de cepa ung1. Resultados de la secuenciación de los mutantes se resumen en los cuadros 2, 3 y [véase la archivo adicional 1]. La mayoría de las mutaciones (64 de 70 en la de tipo salvaje y 62 de 66 en la ung1 cepa) fueron GC en pares de bases. Transversions comprende el 12% de las mutaciones en la GC en pares de tipo salvaje y el 1,6% en el ung1 cepa (Tabla 4]. La menor proporción de transversions en el ung1 cepa es coherente con los datos obtenidos anteriormente en pollos y ratones [26, 51]. Se han comparado estos espectros con los espectros de mutaciones en CAN1 espontánea en la naturaleza de tipo cepas obtenidas por Rattrey y coautores [52], en el cuadro 5. La principal propiedad de estos espectros de mutación fue una alta frecuencia de mutaciones frameshift (> 20%) [52]. Otra de las características de las mutaciones espontáneas es una alta frecuencia de mutaciones en bases AT (> 50%) y una mayor frecuencia de transversions en comparación con las transiciones (> 50%) (véase también el desglose de los tipos de mutaciones espontáneas obtenidos previamente por Otros grupos [53 - 55]]. Estas características de CAN1 mutaciones espontáneas son similares a las propiedades de mutaciones observado en la levadura SUP4-o genes [56]. Por lo tanto, el espectro de mutaciones inducidas por la expresión de los hAIDSc son diferentes de las mutaciones espontáneas en los genes de levadura. Este resultado indica que las mutaciones espontáneas constituyen una pequeña fracción (si la hay) de las mutaciones inducidas por la expresión de los hAIDSc.

GC mutaciones pueden surgir por deamination putativo de la transcrita o no transcritas filamento de la DNA. Ung1 mutaciones en la cepa, en representación de deamination proclividad de uracil sin reparación, se producen a un ritmo superior en el capítulo transcripto (Cuadro 4]. Esto es diferente de los efectos de la AID expresión observada en la mayoría de E. Coli selectiva de los sistemas [31]. En la cepa de tipo salvaje, hay cierta prevalencia de mutaciones debido a putativo no transcritas capítulo deaminations (Cuadro 4], que sugiere la posibilidad de que en nuestro sistema de la reparación de uracil transcritas en el filamento de la DNA es más eficaz que la no transcritas en el capítulo . Evidentemente, hAIDSc está dirigida a ambos filamentos de la DNA en levaduras, de forma similar a las mutaciones somáticas en GC bases durante SHM [6, 7, 9, 57 - 59]. Es importante mencionar que, en circunstancias normales, no existen diferencias en el filamento de la DNA preferencias entre los espectros de la mutación de tipo salvaje y ung1 cepas [60].

A continuación, examinó si el contexto de las mutaciones del ADN inducidas por el AID en la levadura es similar a SHM mutaciones en mamíferos o en E. Expresando hAID coli (Cuadro 5]. DGYW DGYW DGYW y GYW GYW motivos [7, 8, 40] insuficientemente representados en las mutaciones espontáneas que ocurren en la naturaleza o el tipo de cepas ung1 (cuadro 5, fila 1-2) y fueron de 2 - 5 veces excesivamente representados en las mutaciones inducidas Por AID en la levadura (cuadro 5, filas 3-4). Listas de mutación hotspots se muestran en la Tabla 6. Distribuciones de AID inducida hotspots mutación en la naturaleza de tipo y ung1 cepas son significativamente diferentes (Cuadro 6, P = 0,003). La especificidad de las mutaciones en la levadura se correlaciona mejor con el punto de acceso por motivos SHM en ratones que hace la especificidad de las mutaciones inducidas por AID en E. Coli. De hecho, de cada cuatro comparaciones, los índices de preferencia por la mutación en el punto de acceso motivos de levadura eran más altos que en el E. Coli (comparar con hileras de 3-4 hileras de 5-8; filas con 10-11 hileras de 5-8, el cuadro 5]. Algunas propiedades de la levadura se asemejan a mutaciones en la AID inducida in vitro de la mutación del espectro [40]. Por ejemplo, una CGYW CGYW CGYW / WRCG WRCG WRCG secuencia que no es mutable en SHM [8] tenía una alta mutabilidad ung1 mutación en el espectro (Cuadro 6]. Se ha sugerido que una enzima de reparación del ADN de mamíferos, tal vez el uracil-DNA glycosylase, eficiente reparación de la lesión CpG dinucleotides y, por tanto, elimina las mutaciones de CGYW CGYW CGYW / WRCG WRCG WRCG motivos in vivo [8]. Hemos encontrado 5 GGYW GGYW GGYW y 3 TGYW TGYW TGYW hotspots (Cuadro 6]. Curiosamente, no se encontraron en los hotspots AGYW AGYW AGYW motivos (Tabla 6], que son los más frecuentes motivos hotspot en mamíferos inmunoglobulina genes [47]. La ausencia de la mutación en los hotspots AGYW AGYW AGYW no puede atribuirse a su menor prevalencia debido a que el número de AGYW, GGYW GGYW GGYW, y TGYW TGYW TGYW motivos en CAN1 fue similar (resultados no presentados). Sin embargo, un patrón general de las mutaciones en la levadura es similar a los ataques de mutación somática en DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH mutable motivos, que son muy específicos para SHM en mamíferos. En el control, no significativa a la orientación de las mutaciones DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH mutable se encontró motivos para mutaciones espontáneas en el medio silvestre o ung1 tipo de levadura (P _{≤ W Wrandom>} 0,05, en el cuadro 5, filas 1-2).

No hemos encontrado un número importante de mutaciones AT, que normalmente comprenden la mitad de todas las SHM [47, 58, 61]. Este resultado se corresponde con los resultados publicados anteriormente en la expresión de la AID en E. Coli [24, 36], en la levadura [48], en fibroblastos murinos [13], y, en hibridomas humanos [35]. Al parecer, los componentes adicionales son necesarias para el modelo de todo el espectro de SHM en condiciones de AID expresión en sistemas heterólogos o no de células B tejidos.

La levadura es un bien estudiado organismo eucariota modelo utilizado para diversos estudios genéticos. La levadura se utilizó en este estudio para caracterizar la mutator efectos de la expresión ectópica de la AID. El reportero CAN1 gen ha sido elegido por numerosos estudios mutacionales [52, 54] y un bien caracterizado transcripción patrón [62 - 64]. Los resultados son diferentes de los estudios de los efectos en AYUDA procariótico modelos y experimentos in vitro. Hemos observado mutaciones que surgen debido a deamination se produzcan en ambos filamentos de la DNA. En E.coli, transcripción deamination mejora de la no transcritas filamento de la DNA, que se expone como un solo varados durante la elongación del ADN reacción, pero no la mutación de la transcrita filamento de la DNA, que es probablemente, a la protección por E. Coli RNA polimerasa [42, 43, 65]. El filamento de la DNA observó la orientación de las mutaciones en ung1 levadura se asemeja orientación de las mutaciones somáticas en los genes de inmunoglobulina vertebrados (Cuadro 5]. Curiosamente, se produjo un importante capítulo en el sesgo de las mutaciones de tipo salvaje hacia la levadura no transcritas capítulo (Tablas 4 y 5]. Una mayor eficiencia de reparación del ADN transcrito capítulo es una posible explicación de esta asimetría. Preferencial de reparación por escisión de nucleótidos de la transcrita capítulo es un fenómeno bien conocido [66]. La posibilidad de transcripción-junto reparación de uracil bases en el ADN todavía no se ha estudiado a fondo.

Curiosamente, uno de los hilos tendencia a la no-transcrita filamento de la DNA se encuentra en Ung ^{- / -} Msh2 ^{- / -} ratón (cuadro 5, fila 8) [67]. La diferencia entre el número de mutaciones en DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH sitios frente a todos los demás G: C en sitios de tipo salvaje y Ung ^{- / -} Msh2 ^{- / -} cepas fue estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher, P = 0,04). Esto puede indicar que la AID tiene una preferencia a la no transcritas filamento de la DNA como se sugirió anteriormente (véase el examen [32]]. Una excesiva deamination ADN de la no transcritas filamento de la DNA puede ser compensado por más eficiente de reparación de este capítulo durante el SHM fase 2 [67] causando aproximadamente igual frecuencia de las mutaciones del ADN en ambos capítulos (Cuadro 5]. Mayor eficiencia en la reparación de la línea transcrita no es coherente con la idea de la orientación preferente de la ADN polimerasa η a la no transcritas en el capítulo SHM [9, 25]. En general, el capítulo de especificidad en SHM Ung ^{- / -} Msh2 ^{- / -} ratón es similar a la AID en las mutaciones inducidas por las cepas de tipo salvaje de la levadura y E. Coli (Cuadro 5]. Diferencias sustanciales entre la orientación de la AID observó a la mutable motivos en Ung ^{- / -} Msh2 ^{- / -} silvestres y de tipo ratón (Tabla 5] no son consistentes con la hipótesis de que durante la mutagénesis A: T-fase se centró casi exclusivamente orientada A la A: T bases [67, 68]. Es posible que mutagénesis durante esta fase está dirigida a ambos A: T y G: C bases con preferencia a la A: T bases y sin preferencias para DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH motivos mutable, esto es consistente con lo observado mutaciones y Contexto específico de la ADN polimerasa η in vitro [9, 25, 69], DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH-independiente de mutagénesis G: C provocará la erosión de las bases de un alto inicial DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH motivo especificidad observada en Ung ^{- / -} Msh2 ^{- / -} ratón (Tabla 5]. También hay diferencias entre el capítulo específico de Ung ^{- / -} Msh2 ^{- / -} AYUDA ratón y las mutaciones inducidas en los fibroblastos humanos (cuadro 5], esto se podría explicar por algunas diferencias en la orientación AYUDA asociada a la transcripción o la reparación de uracil entre B - Linfocitos y fibroblastos. Todos estos resultados sugieren que una débil línea sesgo es una propiedad intrínseca de SHM.

Una diferencia significativa entre los sistemas in vitro y se observó nuestros experimentos. AYUDA cataliza múltiples deaminations in vitro [40]. Hemos detectado 11 clones con múltiples mutaciones (10 clones con dos mutaciones y un clon con tres mutaciones) y se verificaron el número de mutaciones en la primera y segunda mitades de CAN1. Si múltiples mutaciones surgen como resultado de eventos independientes, la mitad de los clones se espera que tengan mutaciones en diferentes mitades de CAN1. En seis de los 11 clones de las mutaciones se encuentran en distintas partes de CAN1, por lo tanto, independiente de los acontecimientos de mutación es la explicación más probable. En general, la especificidad y la distribución de las mutaciones en la levadura no exhibió un patrón de múltiples mutaciones que habría sido coherente con el postulado processive acción de AID [40]. Estos resultados son consistentes con una alta frecuencia de reordenará los genes de inmunoglobulina V con una mutación somática (por ejemplo, [70]]. Processive aparente no-acción de la AID in vivo puede explicarse por una competición por la unión a la secuencia de ADN CAN1 entre el AID y otras proteínas que participan en la transcripción, la replicación y / o reparación. Por ejemplo, se sabe que un factor que estimula la replicación AID [71], mientras que la especificidad de la AID in vitro se estudió el ADN, sin factores adicionales. Evidentemente, esto requiere más investigación.

El mecanismo de SHM iniciado por AID puede ser de la siguiente manera (ver [23, 24, 27, 28, 67, 72]]. Deamination de cytosine en el DNA conduce a la formación de un mal UG base par. Si la izquierda no, nuevas rondas de replicación de ADN que contiene uracil-sólo generará transición tipo de mutaciones, GC a AT. Uracil remoción por uracil-DNA glycosylase lleva a una apyrimidinic sitio (AP). AP El sitio puede ser dejado de lado por una ADN polimerasa especializados y, de ser un no codificante lesión, podría dar lugar a una transición o mutación transversion. AP El sitio también puede ser una incisión por AP-endonucleasa y luego reparados por el corto parche de reparación por escisión de base (BER) con la participación de más propensa a errores de ADN polimerasas con generación de las transiciones y transversions (por ejemplo, ver [72]]. Este mecanismo genera mutaciones en pares GC. Con el fin de explicar la alta frecuencia de mutaciones durante el breve parche REC reacción, hay que postula que la relativamente precisa de ADN polimerasa β es sustituido en las células B por un error propensos a la polimerasa. El candidato es la DNA polimerasa ι, que se expresa en el linfoma de Burkitt línea celular BL-2 [73], y cuya inactivación suprime SHM en esta línea [74]. Sin embargo, derivado de 129 cepas de ratones, que carecen de la polimerasa η activa, son plenamente competentes en SHM [75]. La razón de esta discrepancia no establecidos en aún.

Otro tipo de mutación, que comprenden aproximadamente el 50% de todas las mutaciones durante SHM, es un cambio en los pares de bases AT [47, 58, 61]. La explicación de los orígenes de la mutación en base par se basa en varias observaciones. Se sabe que las mutaciones en pares de bases AT dependen de la reparación de componentes desajuste MSH2, MSH6, EXO1 y propenso a errores ADN polimerasa η [9, 29, 67, 68, 70, 72]. Se piensa que ser el resultado de propenso a errores de circunvalación o reparación de abasic sitio por polimerasas propenso a errores, en particular, el ADN polimerasas η, y ζ ι [9, 25, 70, 73, 74, 76, 77] (revisado En [28, 72, 78, 79]]. Es posible que se generan de la siguiente manera. Inicio de la reparación de un desajuste GU base par conduce a un vacío. Las deficiencias también pueden ser generados por mucho parche de REC. Reparación de las deficiencias con la participación de propenso a errores del ADN polimerasas puede dar lugar a mutaciones distal a la par inicial GU [25, 68]. Una vez más, hay que postula que la brecha no es habitual en la reparación de células B se inexacta, ya que normalmente es realizado por muy exactos replicativa ADN polimerasas. La última característica del actual modelo de ayudas iniciados por las modificaciones genéticas es que mellas y lagunas, que se planteen durante la reparación del ADN, estimular la recombinación [16, 48]. SHM en la Ung1 ^{- / -} ratones está muy sesgada a favor de la transición, ya que la vía es a través de apyrimidinic sitios bloqueados [26].

Las mutaciones en pares de bases AT están ausentes en Msh2 ^{- / -} Ung1 ^{- / -} ratones [67]. ¿Es importante señalar que Ung1 no es una de las principales enzimas involucradas en la reparación general de G: U desajustes en ratones, tal como sugirió pequeños mutator fenotipos en la Ung1 ^{- / -} ratones y de la existencia de la robusta Smug1 glycosylase [80]. En las células B, sin embargo, la sola Ung1 parece ser crucial para todos los procesos de diversificación genética [67, 81]. Las mutaciones en la base de AT no se observan cuando el AID se expresa en procariotas o en la levadura [31, 36, 48], y este trabajo. Por lo tanto, el actual modelo de los sistemas de reconstruir SHM sólo parcialmente. Delicado equilibrio de la falta de adecuación de la actividad de reparación y propenso a errores polimerasas, específico para células B, pudieran ser necesarias para el espectro completo de las mutaciones SHM [68]. Cambios en la estructura de la cromatina son necesarios para SHM [82] y este nivel adicional de regulación deben tenerse en cuenta al examinar diferentes modelos de SHM.

En el presente estudio, hemos demostrado que la expresión de la AID es mutagénico en la levadura y el efecto mutagénico es uno y dos órdenes de magnitud mayor en la cepa ung1. Esta observación sugiere que la causa de los efectos mutator AID es impulsado por ADN deamination. Contextos de la secuencia de ADN coinciden con los puntos de acceso mutación DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH mutable motivos de la hipermutación somática, que es coherente con el modelo de ADN deamination de SHM, lo que sugiere que la especificidad por el sustrato intrínseca de la propia AID es uno de los principales determinantes de los hotspots mutacionales en GC De pares de bases en SHM.

Un nuevo gen hAID se construyó utilizando los codones característica altamente expresado a los genes de levadura. El programa del constructor de ADN de levadura y http://cbi.swmed.edu/computation/DNABuilder/dnabuilder.html codón datos de uso [83, 84] se utilizó para la construcción de una secuencia de ADN humano de codificación AID, con la levadura preferible codones. El ADN correspondiente a esta secuencia de codificación y de la c-myc Etiqueta en el C-terminal (hAIDSc) fue sintetizado la costumbre-y clonado en BamHI BamHI-SalI SalI cortar pESC-LEU (Stratagene) por el vector de expresión McLab Company (San Francisco ). En esta construcción, la deaminasa genes se colocaron abajo del fuerte, de galactosa GAL1 promotor inducible. Análisis de la secuencia de ADN confirmaron la secuencia completa de la documentación. Se demostró la producción de proteínas por Western blot como se describe anteriormente [85], con una modificación - el occidental Breeze Kit (Invitrogen) se utiliza para la detección de la proteína en los extractos de levadura.

Para nuestros experimentos con la levadura deaminasa vector de expresión de genes de la levadura se utilizó la cepa CG379-3-29RL (MAT α ura3 Δ leu2-3112 trp1-289 bik1:: ura3-29RL his7-2 ade5-1 lys2-Tn5-13) [48, 86, 87]. Esta cepa permite la medición simultánea de las tasas de mutación en varios loci. Estos incluyen a) la tasa de mutación hacia adelante en la CAN1 locus, en donde mutaciones reflejan una variedad de sustitución, frameshift eventos más complejos y, b) la tasa de reversión de mutaciones sin sentido: la trp1-289 (TAG [88]] y ade5 - 1 (TAA, [89]], en donde reflejan las mutaciones en la base de sustituciones codón sin sentido, así como en la codificación de los genes supresores de tRNAs, y c) la reversión de la ura3-29 missense TCT mutación que se produce a través de CG TA transiciones, y CG de CA CG transversions a GC [50], d) la reversión de la his7-2 alelo mutante que se produce principalmente a través de + 1 frameshifts AT homopolymeric en un plazo [49, 90].

Mutación tasas fueron analizados por análisis de las fluctuaciones [49, 90]. Independiente transformantes de la de tipo salvaje y los derivados de nuestro ung1 básicos cepa se cultiva en un medio mínimo que carecen de leucina para seleccionar el plásmido, y que contiene en lugar de la glucosa, galactosa, para inducir la expresión hAIDSc.

Levadura transformantes solo parches procedentes de las colonias (64 por cada placa) fueron réplica chapada a la galactosa que contienen medio sin leucina. Después de dos días, se les réplica chapada en canavanina-que contenían el medio para seleccionar a can1 mutantes. Después de cinco días de incubación, uno se puede ^r colonia fue recogido de cada streak y sembró en medio canavanina-que contiene. Cromosómicas ADN de células procedentes de una colonia de estos can1 mutantes se aisló utilizando un kit de extracción de ADN de levadura (Epicentro). Con posterioridad mediante amplificación por PCR y secuenciación se realizó tal como se describe anteriormente [91].

Cinco in vivo e in vitro de una mutación espectros, que se han descrito antes [13, 26, 36, 40, 47] se utilizaron en este estudio. Consideramos que estas grandes espectros de mutación reflejar sesgo intrínseco en el proceso de mutación. La recopilación de las mutaciones somáticas en la VkOx transgén incluye los datos derivados de transgénicos cadenas ligeras con varias copias del transgén y de las celdas seleccionadas en Peyer del intestino Parches (PP). Las copias múltiples se orientan en la misma celda, incluso cuando la luz que codifican la cadena no es parte de la molécula de antígeno anticuerpo vinculante. Esto implica que la mayoría de las mutaciones son acumulados sin seleccionar. En el caso de las células procedentes PP, la presión selectiva es múltiple, por lo tanto, una vez más, el denominador común de las desviaciones observadas refleje los prejuicios intrínsecos [92, 93].

La prueba exacta de Fisher se utilizó para comparar las frecuencias de las transiciones y transversions. Esta prueba también se utilizó para comparar el número de mutaciones en DGYW DGYW DGYW / WRCH WRCH WRCH sitios frente a todos los demás sitios en la GC de tipo salvaje y Ung ^{- / -} Msh2 ^{- / -} cepas de ratón. A Monte Carlo modificación de la χ ² de Pearson prueba de los espectros de homogeneidad [94] fue utilizado para comparar las distribuciones de mutación a lo largo de hotspot CAN1 posiciones de la secuencia. Los cálculos se realizaron utilizando el programa COLAPSO [95]. CAN1 mutaciones en el gen se detectó fenotípica utilizando el ensayo se ha descrito anteriormente, no obstante, la lista completa de posiciones detectables en este gen no se conoce. Predijimos estas posiciones SIFT utilizando el programa con los parámetros por defecto [96]. Mutación hotspots se definieron a partir de un umbral para el número de mutaciones en un sitio. El umbral se establece a través del análisis de la distribución de frecuencias derivado de una mutación del espectro utilizando el programa CLUSTERM http://www.itb.cnr.it/webmutation/ [97]. En breve, este programa se descompone una mutación del espectro en varias clases de sitios homogénea, con cada clase aproximarse por una distribución binomial. Las variaciones en las frecuencias de mutación entre los sitios de la misma clase, por definición, son aleatorios (probabilidad de mutación es el mismo para todos los sitios dentro de una clase), pero las diferencias entre las clases son estadísticamente significativas. Cada sitio tiene una probabilidad P (C) que se asignará a la clase C. Una clase con la más alta frecuencia de la mutación que se denomina punto de acceso de clase. Sitios con de P (C _hotspot) ≥ 0,95 de ser asignado a la clase C hotspot _hotspots se definen como hotspot sitios. Este enfoque asegura que la cesión es estadísticamente significativa y robusta (véase Rogozin et al. [98] para la discusión detallada de este enfoque y de los problemas asociados a su aplicación).

Secuencia de nucleótidos características se puede correlacionar con una mutación del espectro y la correlación puede ser la prueba de significación estadística. La importancia de las correlaciones entre la distribución de los motivos mutable y mutaciones a lo largo de una secuencia diana fue medida por un procedimiento de Monte Carlo (CONSEN el programa) [7]. Este enfoque tiene en cuenta las frecuencias para cada una de las sustituciones de nucleótidos, la posibilidad de múltiples mutaciones en un sitio, y el contexto de la mutación sitios. La simulación de Monte Carlo fue ejecutada con ponderado de los sitios, con el peso de un sitio definido como:

H donde _j es el número de mutaciones en el sitio j. W _j pesos se resumen de todos los sitios analizados en la secuencia resultante en el peso total W. Un total de la distribución de los pesos W _azar se calculó para 10000 objetivo secuencias aleatoriamente mezcladas con los espectros de mutación. Cada uno de los espectros de mutación aleatoria resultante contenía el mismo número de mutaciones que el espectro observado con la misma distribución de las mutaciones más de los sitios elegidos al azar. La distribución de W _azar se utilizó para calcular la probabilidad P _{≤ W Wrandom.} Esta probabilidad es igual a la fracción de azar en la que los espectros W _azar es el mismo o mayor que los pequeños W. valores de probabilidad (P _{≤ Wrandom W} ≤ 0,05) mostró una correlación significativa entre un mutable motivo y frecuencia de la mutación [7, 99] .

Este trabajo fue diseñado por YIP, TAK y IBR. YIP y CF participan en la construcción de vectores, Western blot de las proteínas, las tasas de mutación y de las mediciones de aislamiento can1 mutantes. LA VIM y realizó PCR y secuenciación del ADN y han participado en el análisis de las mutaciones. IBR hizo análisis estadístico de los espectros de mutación.