Microbial Cell Factories, 2005; 4: 18-18 (más artículos en esta revista)

El uso de los plásmidos pIVEX sobreproducción de la proteína en Escherichia coli

BioMed Central
Julie Rogé (jroge.abag @ wanadoo.fr) [1], Jean-Michel Betton (jmbetton@pasteur.fr) [1]
[1] Unidad de Repliement et Modélisation des Protéines Instituto Pasteur-CNRS URA2185 28, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, Francia

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Resumen
Antecedentes

El pIVEX plásmidos son vectores optimizados para la expresión en el Sistema de Traducción Rápida (RTS) de células libres de control del sistema de transcripción de bacteriófago T7 elementos. Incluso si estos plásmidos son para uso in vitro, es por lo general vale la pena comparar ambos libres de la célula bacteriana y la expresión genética de la misma construcción. Sin embargo, algunos usuarios RTS encontrado problemas cuando introcuded estos plásmidos en cepas de Escherichia coli productoras de acogida de la RNA polimerasa T7.

Resultados

Verificamos que en la transformación de las dificultades de uso común BL21 (λ DE3) cepa con pIVEX surgió de la presencia de un fuerte promotor T7 combinado con un alto número de copias del plásmido, independiente de la expresión génica. Cuando estos vectores se introdujeron en este abrigaban una cepa compatible plásmido que lleva el represor lactosa (lacI), la mejora de la eficiencia de transformación de 4 órdenes de magnitud. Por otra parte, hemos diseñado un protocolo que permite la transformación, después de la inducción, la sobreproducción de proteínas pIVEX codificada en el BL21 (λ DE3) cepa.

Conclusión

El uso de la correcta plásmido / combinación de acogida y de transformación de expresión protocolo, podríamos comparar directamente sobreproducción de la misma pIVEX codificada de las dos proteínas in vivo e in vitro de sistemas de expresión.

Antecedentes

Los acontecimientos recientes en los sistemas de células libres de ofrecer nuevas y prometedoras posibilidades para la producción de proteínas recombinantes [1]. La RTS, comercializado por Roche, es un intercambio libre de las células del sistema con la mejora de la productividad [2]. El suministro continuo de consumo de sustratos y la eliminación de los productos de reacción proporcionar un rendimiento de varios miligramos de proteína. Este sistema utiliza bacteriófago T7 RNA polimerasa para llevar a cabo la transcripción, mientras que un enriquecido E. Coli S30 extracto proporciona el mecanismo de traducción. Así, la producción de proteínas en RTS requiere un paso preliminar de la clonación con fines de la meta gen en un vector, aguas abajo del promotor T7. A tal efecto, la familia de expresión pIVEX plásmidos se ha optimizado para su utilización in vitro. Incluyen una T7 promotor T7 gen se compone de los 10 potenciador de la traducción [3], una eficiente procariótico secuencia Shine-Dalgarno con una distancia óptima para el inicio codón, un sitio de clonación múltiple, y un terminador T7 que impide 3'-terminal de la degradación de exonucleolytic El ARNm. Estos vectores son muy convenientes desde múltiples sitios de clonación fueron diseñados para permitir fusiones de genes con varias etiquetas, ya sea en la N-o C-terminal de proteínas por objetivo la conservación de la misma estrategia de restricción marco de lectura y compatibilidad.

Algunas investigaciones revelaron que menos de una expresión óptima en este sistema de células libres podría explicarse por la presencia de estructuras secundarias estables en mRNAs [4]. De hecho, se mantienen los niveles de transcripción de muy alta debido a la gran actividad T7 RNA polimerasa. En consecuencia, no existe un verdadero acoplamiento de la transcripción y la traducción puede tener lugar in vitro, y sin protección mRNAs estable puede formar estructuras secundarias, en particular en la región de iniciación de traducción que inhiben ribosome vinculante y limitar los niveles de expresión. Hay mRNA plegables algoritmos que pueden predecir tan desfavorables intramolecular estructuras secundarias, pero no dan información acerca de los niveles de expresión. Aunque existen mecanismos de regulación similares en E. Coli [5], es sencillo y útil para evaluar in vivo los niveles de expresión de un plásmido que dio pIVEX pobres rendimientos de proteína in vitro. La influencia de mRNA estructuras secundarias en la traducción no es idéntica en ambos contextos. Sin embargo, la transformación de los más utilizados RNA polimerasa T7 producir BL21 (λ DE3) cepa [6] por pIVEX se altera debido a que la ausencia del gen lacI, codificación de la lactosa represor, en los plásmidos de alto número de copias. Aquí, nos informe la manera de resolver este problema mediante el diseño de un simple protocolo compatible con un plásmido que lleva el gen represor lactosa. Este método permite la comparación directa de la in vitro y de expresión bacteriana pIVEX vectores.

Resultados y Discusión

A diferencia de otros T7 promotor basado en vectores, la pIVEX no contienen una secuencia operador lac aguas abajo del promotor T7. Desde pIVEX de expresión no es reprimida por LacI, que no contienen el gen correspondiente. De hecho, los primeros intentos de transformar, por un procedimiento químico, la BL21 (λ DE3) cepa con diferentes pIVEX no transformantes, ya que no se obtuvo la ampicilina-LB sobre placas de agar. En el supuesto de que la expresión basal de pIVEX puedan tener efectos adversos sobre el crecimiento bacteriano, decidimos poner a prueba diversos plásmido / combinaciones de acogida con el fin de controlar más estrechamente tanto en la transcripción lacUV5 promotor de la T7 RNA polimerasa de genes en el cromosoma de acogida, y, en consecuencia, En el promotor T7 en el pIVEX plásmido. Además, otras investigaciones indicaron que la eficiencia de esta transformación E. B coli cepa podría ser crítico [7]. Por lo tanto, electroporated recién BL21 (λ DE3) las células que contienen tanto la codificación pLysS plásmido T7 lisozima [8], un inhibidor natural de T7 RNA polimerasa, o la pDIA17 plásmido [9] albergar el gen lacI. Ambos residentes cloranfenicol plásmidos son resistentes y compatibles con pIVEX ya que llevan el origen de replicación del plásmido p15A. Para facilitar el análisis de expresión entre los recombinantes, un plásmido GFP-pIVEX codificación de la proteína de fluorescencia verde, las buenas prácticas agrarias, se utiliza para la detección de fluorescencia de las colonias solo en placas de agar. Como el control de tóxicos de expresión, de la misma cepas también se transformó con un vacío pIVEX plásmido (pIVEX2.4d).

Los resultados presentados en el Cuadro 1 muestran que 1) la presencia de la clonación de genes de codificación de las buenas prácticas agrarias en pIVEX no tiene ninguna influencia en la transformación de la eficiencia, 2) pLysS no aumentó la tolerancia de la BL21 (λ DE3) para cualquiera de los plásmidos pIVEX empleados, y 3 ), En cambio, pDIA17 aumenta la eficiencia de transformación de 4 órdenes de magnitud. Estos resultados sugieren que la producción basal de T7 RNA polimerasa en BL21 (λ DE3) era incompatible con un alto número de copias del plásmido que no codifican el gen lacI, incluso sin un gen clonado abajo el promotor T7. Sin embargo, un aumento sustancial de la lactosa represor de pDIA17 en BL21 (λ DE3) células es suficiente para permitir la presencia de pIVEX.

Además, la producción de las buenas prácticas agrarias pueden ser evaluadas directamente a partir de la transformación de las placas. A 37 ° C en ausencia de IPTG, la producción de las buenas prácticas agrarias pIVEX-GFP, el crecimiento de las células después de la noche a la mañana en medio sólido LB, fue suficiente para dar fluorescentes colonias en estas condiciones. Estos altos niveles de filtraciones expresión es desconcertante, pero se ha demostrado que cuando uninduced BL21 (λ DE3) las células se cultivan a la fase estacionaria en medio LB que carecen de la glucosa, el promotor lacUV5 es derepressed [10]. Aparentemente, LacI niveles de pDIA17 son suficientes para aumentar la tolerancia pIVEX competentes en el estado, pero no para garantizar la estricta represión en la uninduced estado estacionario. El examen de la transformación placas reveló que el 100% de las colonias de BL21 (λ DE3) / pDIA17 células fluorescentes, pero sólo el 90% de los que lleven pLysS (Tabla 1]. Este resultado sugiere que algunos transformantes carecían de buenas prácticas agrarias de producción, está en buen acuerdo con un informe reciente en la que el mayor nivel de producción de una hemoglobina recombinante, de la comparación de ambas cepas, se encontró en la BL21 (λ DE3) / pDIA17 cepa [11] . Aunque todos los transformantes obtenidos con pIVEX-GFP en esta cepa muestran fluorescencia brillante transformación en placas, la misma falta de buenas prácticas agrarias de producción se observó en repetidas ocasiones por subcultivando estas células en medio líquido LB, que contiene tanto la ampicilina y el cloranfenicol. De hecho, muchos estudios han informado de que los pobres ya la síntesis de proteínas o falta total de la producción de proteínas es un problema común y frecuente cuando se usa el sistema de expresión promotor T7. La producción de proteínas tóxicas que causan inestabilidad plásmido es la explicación convencional para esta observación [8]. Sin embargo, una investigación reciente ha sugerido que la disminución de los niveles de producción de proteínas en la BL21 (λ DE3) cepa es más atribuible a la reducción de las mutaciones cromosómicas el nivel funcional de la RNA polimerasa T7 que a la significativa pérdida de plásmido o mutaciones que surgen en el plásmido [12] . De acuerdo con este estudio, el aislamiento de pIVEX-GFP subcultured ADN de las células no expresan y transformación en nuevos competente BL21 (λ DE3) / pDIA17 células restablecido las buenas prácticas agrarias de producción.

Para comparar ambas in vitro e in vivo de expresión, hemos utilizado la proteína de unión de maltosa (MalE), el receptor soluble de la alta afinidad de transporte de maltosa de E. Coli, como modelo de proteína [13]. Anteriormente, nos mostró que algunas secuencias adicionales en la N-terminal de esta proteína pueden influir en su nivel de producción en el RTS de células sin sistema [14]. Los cuatro utilizan plásmidos pIVEX permitir la proteína de fusión con dos diferentes péptido-tags, Su-y Strep-etiqueta, ya sea en la N-o C-terminal de MalE [15]. Entre ellos, una construcción (pIV2.2ME) sólo obtuvieron niveles muy bajos de proteínas en la célula de la libertad de expresión del sistema (Figura 1]. De hecho, cuando el Strep-etiqueta fue fundida a la N-terminal de MalE, la correspondiente proteína fue indetectable en geles de poliacrilamida-SDS teñidos con azul de Coomassie. Desde Su-MalE etiquetados en el N-terminal se produce correctamente, que la hipótesis de que el Strep-etiqueta en lugar de la secuencia N-terminal de posición tuvo una influencia negativa, probablemente por la formación de una estructura secundaria desfavorable en la región de iniciación de traducción del ARN mensajero, que Dificulta la síntesis de proteínas. Debido a que este fenómeno puede ser minimizado dentro E. Coli células, examinamos malE expresión en BL21 (λ DE3) de los mismos cuatro pIVEX plásmidos.

Para garantizar la correcta producción de proteínas celulares, recién transformado BL21 (λ DE3) llevando pDIA17 con los diversos plásmidos, y en lugar de la selección de transformantes en placas de agar LB suplementado con ampicilina y el cloranfenicol, la selección se llevó a cabo en medio líquido LB incluya a los dos antibióticos. Al día siguiente, los cultivos fueron diluidos saturadas (1:100) en medio LB líquido fresco, complementado sólo con ampicilina, y se incuba a 30 ° C. Se encontró que el procesamiento de la totalidad de la población de transformantes es menos tedioso que el cribado individual colonias para la correcta expresión, y por la reducción del crecimiento de la temperatura a 30 ° C, el número de copias del plásmido pUC se redujo [16]. Posteriormente, las culturas fueron inducidos durante la fase de registro, y las células se cosecharon 1,5 horas después de la adición de IPTG. Después de la lisis, el estado de equilibrio de los niveles MalE fueron analizados por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida. Como se muestra en la Figura 1, todos los pIVEX dado muy grandes cantidades de MalE en estas condiciones. Aunque la expresión de pIV2.2ME fue inferior a la de otros plásmidos, la correspondiente proteína se detecta fácilmente en el gel teñido de azul de Coomassie. Así, en contraste con RTS expresión, de la N-terminal Strep-etiquetados correctamente MalE es producida en E. Coli células. En la práctica, el éxito de expresión celular puede ayudar a validar un pIVEX plásmido en el que el objetivo es gen introducido correctamente entre los elementos de regulación, pero no detectables expresión in vitro.

Conclusión

El uso de un plásmido correcta / combinación de acogida y de transformación de una simple expresión de protocolo, se podría comparar directamente la producción de la misma pIVEX de las proteínas codificadas en dos sistemas de expresión, pero realizado in vivo e in vitro. Con el desarrollo de sistemas de células libres en genómica estructural y proteómica funcional de los programas, será interesante investigar sistemáticamente, en un gran conjunto de las proteínas, ya sea expresión se comporta de manera similar en ambos ambientes.

Materiales y métodos
Cepa bacteriana y la transformación

B cepa E. coli BL21 (λ DE3) se obtuvo de Novagen. La electroporación se realizó utilizando un Eppendorf Electroporator 2510. Las bacterias se cultivaron en 100 ml de LB A 600 de 0,7, enfriada con hielo, y cosechados por centrifugación (10 min, 1000 g a 4 ° C). El pellet se lavó dos veces con 100 ml de helado de agua destilada, y una vez con 5 ml helado el 10% de glicerol. La última fue de pellets de bacterias en suspensión en un volumen final de 500 μ l en el 10% de glicerol. Alícuotas (50 μ l) se mezcló con 10 ng de ADN plásmido en cubetas refrigerados (0,2 cm de electrodos de vacío). Una simple pulso de 12,5 kV / cm y se aplicó 1 ml de SOC fue inmediatamente añadió. Luego, electroporated bacterias fueron trasladados a la cultura tubos de polipropileno y se agita durante 1 h a 37 ° C, ya sea antes de enchapado en placas que contienen LB ampicilina (100 μ g / ml) y cloranfenicol (25 μ g / ml), o diluir en líquidos LB suplementado con Ambos antibióticos.

Plásmidos

Plásmido pLysS se obtuvo de Novagen, y pIVEX-GFP, la codificación de las buenas prácticas agrarias ciclo de la variante 3 [17], es un generoso regalo de Cordula Nemetz. Plásmidos pIV2.1ME, pIV2.2ME, pIV2.3ME, y pIV2.4ME, que transportaba a los de tipo salvaje malE sin señal de secuencia de genes, bajo el control del promotor T7, fueron construidos anteriormente [14] por subcloning el mismo producto en la PCR PIVEX2.1MCS correspondiente, pIVEX2.2bNde, pIVEX2.3MCS, y pIVEX2.4bNde vectores (Roche). PDIA17 plásmido pACYC184 es un derivado de la ejecución gen lacI bajo el control del promotor tetraciclina [9].

Síntesis de la proteína de reacción

MalE síntesis in vitro se realizó en RTS500 E. HY coli con la RTS ProteoMaster instrumento, en esencia, tal como se describe en el Manual de Instrucciones de Roche. La transcripción unido / traducción reacciones, que se inició mediante la adición de 15 μ g de pIVEX ADN plásmido, se llevaron a cabo en 1 ml de volumen total durante 20 horas a 30 ° C. In vivo expresión se realizó en BL21 (λ DE3) células teniendo pDIA17 plásmido a 30 ° C en LB suplementado con ampicilina (100 μ g / ml). Culturas fueron inducidos a un un 0,8 por 600 de adición de IPTG a una concentración final de 500 μ M, y se permitió el crecimiento de 1,5 horas después de la adición de IPTG. Proteínas de tanto in vitro como in vivo extractos fueron separados por 12% SDS-gel de poliacrilamida y teñidos de azul de Coomassie.

Abreviaturas utilizadas

GFP - proteína verde fluorescente

IPTG - isopropílico - β-D-galactoside

LB - Luria Bertani

MalE - maltosa proteína de unión

PCR - reacción de polimerasa en cadena

RTS - un rápido sistema de traducción

SDS - dodecil sulfato de sodio

Contribuciones de los autores

JR realizado transformaciones bacteriana. JMB realizó la síntesis de proteínas y preparó el manuscrito. Ambos autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Cordula Nemetz y Hélène Munnier Lehmann-por el don de plásmidos, y Emmett Johnson para leer detenidamente el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de Instituto Pasteur y el CNRS.