Particle and Fibre Toxicology, 2005; 2: 3-3 (más artículos en esta revista)

La influencia de peróxido de hidrógeno y de la histamina sobre la permeabilidad pulmonar y translocación de iridio nanopartículas en el pulmón aislado de rata perfundidos

BioMed Central
James J Meiring (james.meiring @ med.uni-muenchen.de) [1], Paul Borm, JA (p.borm @ hszuyd.nl) [1], Karim Bagate (Bagate.k @ wanadoo.fr) [1] , Manuela Semmler (semmler@gsf.de) [2], Jürgen Seitz (seitz@gsf.de) [2], Shinji Takenaka (takenaka@gsf.de) [2], Wolfgang G Kreyling (kreyling@gsf.de) [2]
[1] Investigación de Partículas Core, Umweltmedizinische Instituto für Forschung (UITA) an der Heinrich-Heine Universität gGmbH, Auf'm Hennekamp 50 D-40225 Düsseldorf, Alemania
[2] GSF Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Ingolstädter Landstr. 1-85746 Neuherberg / München, Alemania
[3] Centre of Expertise in Life Sciences (CEL), Zuyd University, PO Box 550, 6400 AN HEERLEN, The Netherlands

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Resumen
Antecedentes

Translocación de las partículas ultrafinas (UFP) en el que devuelve la sangre desde los pulmones hasta el corazón ha sido enviado como un mecanismo de partículas inducida por efectos cardiovasculares. El objetivo de este estudio fue evaluar la función endotelial de la barrera en la translocación de UFP de la inhalación de pulmón en circulación.

Métodos

El aislado de rata perfundidos pulmón (IPRL) se utilizó en virtud de ventilación de presión negativa, y las partículas radiactivas de iridio (18 nm, CMD, 192 Ir-UFP) se inhala durante 60 minutos para lograr un pulmón carga de 100 - 200 μ g. Inhalación de partículas se hizo bajo los tratamientos siguientes: i) el control de la perfusión, ii) la histamina (1 μ M en perfundido, iii) luminal histamina instilación (1 mM), y iv) luminal instilación de H 2 O 2. Partículas translocación a la perfundido fue evaluada por la radiactividad de 192 Ir isótopo. Permeabilidad de pulmón mediante el uso de Tc 99m-etiquetados triamine pentaacetic ácido dietileno (DTPA). Además de la luz de la evaluación morfológica microscópica fijo pulmones, la fosfatasa alcalina (ACP) y la enzima conversora de la angiotensina (ACE) en perfundido se mide para evaluar la integridad epitelial y endotelial.

Resultados

La distribución de partículas en el pulmón es homogénea y similar a las condiciones in vivo. N Ir translocación de las partículas de presión negativa en la inhalación se detectó en el control de IPL, pero pulmones pretratadas con histamina (1 μ M) en el perfundido con luminal o de H 2 O 2 (0,5 mM) mostraron pequeñas cantidades de radiactividad (2-3% de la dosis) En la pasada perfundido a partir de 60 minutos de la perfusión. Si bien la cinética de las partículas translocación eran diferentes de la permeabilidad de 99m Tc-DTPA, el pretreatments (H 2 O 2, vascular histamina) causó cambios similares en la translocación de las partículas solubles y mediador. El aumento de la translocación a través de epitelio y endotelio tiempo con un retraso de una hora producido en ausencia de daño epitelial y endotelial.

Conclusión

Permeabilidad de la barrera a la UFP de pulmón o las nanopartículas se controla tanto en el nivel epiteliales y endoteliales. Condiciones que afectan a esta función barrera, como la inflamación puede afectar a la translocación de NP.

Introducción

Los estudios epidemiológicos han demostrado un aumento de la morbilidad y mortalidad por la contaminación del aire de partículas [1, 2]. El mayor riesgo relativo para la mortalidad y los ingresos hospitalarios fueron observadas en los sujetos con enfermedad pulmonar, como el asma y la EPOC [1, 2]. El mecanismo exacto por el cual puede afectar adversamente PM seres humanos sigue siendo desconocido, pero varias hipótesis se han transmitido. Estos incluyen PM causas que provocan la inflamación pulmonar liberación de los factores que influyen en la coagulación de la sangre [3], la reducción de la función pulmonar [4], el aumento de la viscosidad del plasma de sangre [5], la reducción de la variabilidad del ritmo cardíaco [6, 7] y la desestabilización de plagas arteroesclerótica [8 ]. Algunos de estos efectos se atribuyen a trasladadas con nanopartículas sobre la base de sus posibles efectos en la función vascular [9, 10], la coagulación de la sangre [11], la función mitocondrial [12] y de la corriente de Ca [13, 14].

Nanopartículas se ha demostrado que trasladar de pulmón a la circulación [15 - 18], pero la mayor parte de la dosis inhalada permanece en el intersticio pulmonar [19], incluso hasta varios años [20]. Por tanto, parece que no, pero el epitelio de la barrera endotelial es más importante en la prevención de la translocación a la sangre. Aumento de la permeabilidad de pulmón se ha medido por el aumento de células Clara proteína en la sangre [21] DTPA o el incremento de la limpieza en el pulmón [22] después de ozono y hyperoxia. Los recientes trabajos en los pulmones de conejo aislados perfundidos muestra que las nanopartículas pueden influir en la permeabilidad microvascular medido por el aumento de peso después de la oclusión [23]. Sin embargo, desde los mecanismos de transporte de nanopartículas en un sub-nivel celular se desconoce que queda por determinar si lo anterior índices de permeabilidad de pulmón están relacionados con la translocación de las nanopartículas. Las partículas también puede causar la liberación de mediadores vasoactivos, como la histamina, que era la que se plasma en el aumento de hámster después de la instilación de las partículas de escape diesel [24]. La histamina es bien conocido para inducir la permeabilidad vascular a través de su acción sobre el endotelio los receptores H 1 [25]. Por último, por el estrés oxidativo y los mecanismos ambiente nanopartículas pueden provocar la activación de los macrófagos alveolares del pulmón y las células epiteliales que se traducen en la producción de citoquinas pro-inflamatorias, como TNF e Il-1 en los seres humanos [26] y de los modelos de rata [27] que son típicamente Asociados con el aumento de la permeabilidad de pulmón [28, 29].

El objetivo de este estudio fue evaluar nanopartículas translocación en relación a los cambios de permeabilidad de las pequeñas moléculas y de la integridad epitelial y endotelial monocapas. Con el fin de manipular la permeabilidad en la falta de contratación y activación de neutrófilos hemos utilizado un hecho aislado de rata perfundidos pulmón. En el tratamiento de pulmón para modificar la permeabilidad in vitro se aplicaron incluido el estrés oxidativo por instilación de peróxido de hidrógeno y de la permeabilidad endotelial por la histamina en el perfundido. Estos tratamientos fueron seleccionados por su importancia para las condiciones de los pacientes con complicaciones pulmonares o sistémicas. Partículas translocación fue evaluada por la radiactividad inherente, de 18 nm de tamaño de las nanopartículas de iridio (192 Ir-UFP).

Materiales y métodos
Los animales y el procedimiento quirúrgico

Adultos, sanos, hombres ratas Wistar-Kyoto (WKY / Kyo @ Rj ratas, Janvier, Francia) (200-250 g) fueron alojados por parejas en una humedad (55% de humedad relativa) y la temperatura (22 ° C) controlado habitación. Ellos se llevan de 12 h día / noche ciclo. Las ratas se les permitió aclimatarse a la instalación de un mínimo de 10 días antes de usar. Cuando los experimentos se realizaron las ratas eran más de 17 semanas de edad. Los estudios se llevaron a cabo bajo las directrices federales para la utilización y el cuidado de los animales de laboratorio y fueron aprobadas por el Gobierno y Oberbayern GSF Institucional por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Procedimiento quirúrgico para aislamientos de pulmón fue realizado de acuerdo al método de Uhlig y Wollin [30]. En pocas palabras, las ratas fueron anaesthetized intraperitoneal con 80 mg / kg ketamin. Anestesia profunda se caracteriza por la falta de respuesta a los pies pellizcos. Heparina (500 UI) fue inyectado a través de la cola vena. Una incisión de la línea media se hizo de la región pélvica para el cuello de la rata. Con el ventilador en funcionamiento, la tráquea se cannulated utilizando un catéter rígido y el catéter se adjuntó a la ventilación. Por lo tanto fueron ventiladas del pulmón desde el inicio del procedimiento en su conjunto. Los animales fueron exsanguinated apertura de la aorta abdominalis intraperitoneal profunda después de la anestesia con ketamina (100 mg/100 g de peso corporal) y xylazina (0,5 mg/100 g de peso corporal). Después de la anestesia incisión longitudinal ventral se hizo para abrir la cavidad torácica y abdominal y que se celebró abierto utilizando pinzas. El timo se ha retirado y el ápice del corazón fue cortada para introducir una cánula en la arteria pulmonar. Una leve corriente de alrededor de la perfusión de 1 ml / min se mantuvo antes de la inserción de la cánula. Se prestó atención en no introducir burbujas de aire en la arteria pulmonar. La aurícula izquierda se cannulated por la promoción de la cánula venosa a través de la válvula mitral. Una ligadura se colocó alrededor del corazón para mantener tanto la cánula en el lugar. La cánula de aorta se adjunta a continuación, el revestimiento Perspex alimentados a través de la tapa de los 500 mL de presión negativa de la cámara. Después de la tapa de Perspex sido montado en la cámara de ventilación de presión negativa comenzado. La configuración respiratorias durante la ventilación con presión negativa fueron 65 respiraciones por min. Regular suspiros se introdujeron (hiperventilación) para mejorar la función de los pulmones.

Aislado de perfusión pulmonar

El IPL-4401 ventilación pulmonar de perfusión aislada del sistema (FMI GmbH Oberbach) se utilizó para nuestro estudio. Presión negativa adicional de cámara ha sido construida por GSF-Centro Nacional de Investigaciones para el Medio Ambiente y la Salud. El sistema consiste en breve de un animal pequeño ventilador, envueltos superior de los medios de comunicación embalse, de presión negativa de la cámara de la celebración de corazón-pulmón-bloque, líneas de perfusión, bomba peristáltica y transductor de presión de la arteria pulmonar. Los programas de computadora (FMI GmbH Oberbach) fue operado por una computadora personal y 386 permite un constante monitoreo de la presión arterial pulmonar. El embalse superior de los medios de comunicación, la cámara de ventilación y perfusión líneas se celebraron a 37 ° C por un re-distribuir el agua de baño. La perfusión medio fue seleccionado sobre la base de su amplia utilización en perfusión de órganos aislados y consistía en una modificación Krebs-Ringer-bicarbonato de amortiguación. Krebs-Ringer composición fue la siguiente (mM): NaCl 118; KCl 5,9; CaCl 2 2,5; MgSO 4 1,2; NaH 2 PO 4 1,2; NaHCO 3 24,9; 11,1 glucosa, el pH se ajustó a 7,4. Entonces se mezclan en una proporción 1:1 con solución Haemacell (Hoechst Marion Roussel). El buffer fue previamente calentada y gaseado con un 95% de O 2 y 5% de CO 2 a un ritmo lo suficientemente bajo como para evitar la excesiva espuma del medio. El medio fluye a través del sistema pasó por una burbuja trampa antes de llegar a los pulmones y el buffer de pH fue de control permanente durante todo el experimento. Frecuencia respiratoria se fijó en 65 respiraciones por minuto. Pulmones fueron infladas en un máximo de presión negativa de -1,5 kPa en la cámara. Trazo volumen se fijó en 10 ml de lograr un volumen de las mareas por lo general 3-4 ml (a causa de la alteración de cumplimiento de los pulmones). Los pulmones se ampliaron (suspiró) cada 4 minutos la aplicación de una presión negativa de -2,5 kPa a la cámara. La configuración óptima de la perfusión incluyen la tasa de perfusión de 5 ml / min y un medio de pH de 7,4. La presión de perfusión no es constante pero se mantuvo entre 10 y 14 kPa.

Generación de partículas y la exposición

Los aerosoles de partículas ultrafinas iridio (Ir-UFP) Ir radiomarcada con 192 se produjeron con un generador de chispa, tal como se describe anteriormente [15]. Tamaño de la distribución y el número de concentración fueron supervisados continuamente por un diferencial de la movilidad medidor de partículas (DMPS 3070, TSA instrumentos) y un contador de partículas de condensación (CPC 3022A, ETI Instruments). La distribución del tamaño de los 192 Ir-UFP tenía por objeto contar con un diámetro de la mediana de 17-20 nm (desviación estándar geométrica 1.6) en una concentración de partículas de 10 7 cm -3 con el objetivo de volumen tidal de 3-4 cm 3 en una Frecuencia de 65 / min. La estimación de la dosis en estas condiciones es de 180 μ g / hora. Schematical Una descripción del sistema experimental se muestra en la Figura 1

Diseño experimental

Después de un período de 15 minutos de equilibrio, en la que los pulmones ya estaban ventilados y perfundidos, el experimento iniciado por la inhalación de recién producido Ir-192 UFP de la línea de aerosoles. Instilación intratraqueal de 99m Tc-DTPA o instilaciones otras se realizaron en este punto la hora de comienzo. El perfundido continuamente y se recogió la muestra a 15-min intervalos de tiempo (Figure. 2]. Los siguientes tratamientos fueron investigados,

Grupo I: grupo de control, sólo 192 Ir-UFP inhalación de 120 min,;

Grupo II: instilación de 50-100 μ L 99m Tc-DTPA, 500 μ l de H 2 O 2 en bolo (10 mM), 192 Ir-UFP aerosol para inhalación 120 min;

Grupo III: instilación de 50-100 μ L 99m Tc-DTPA, histamina perused continuamente durante las próximas 2 horas a la concentración de 10 μ M, 192 Ir-UFP aerosol para inhalación 120 min;

Grupo IV: instilación de 50-100 μ L 99m Tc-DTPA y 500 μ l bolo instilación histamina a una concentración de 10 mM, 192 Ir-UFP aerosol para inhalación 120 min;

Grupo V: la instilación de 50-100 μ L 99m Tc-DTPA.

Evaluación de 192 Ir-UFP translocación

El perfundido muestras, así como el corazón-pulmón-bloques se analizaron para Ir-192 UFP actividad en un blindado 1-L-bien de tipo espectrómetro gamma. Análisis de 192 Ir actividad se realizó en esas muestras estudiadas para 99m Tc-DTPA permeabilidad cuando el Tc 99m actividad ha degradado - véase más abajo. Mediciones de la actividad de ambos isótopos tenían caries y con corrección de fondo. 192 Ir actividad en el perfundido muestras se ofrecen como una fracción del total de la actividad se encuentra en el perfundido y el corazón-pulmón-bloque.

Evaluación de la permeabilidad pulmonar

Tecnecio-99 m DTPA etiquetados (99m Tc-DTPA; DRN 4362 TechneScan-DTPA, Malinckrodt Medical BV, Países Bajos) fue utilizado para evaluar la permeabilidad de pulmón. El DTPA polvo liofilizado fue disuelto en 10 ml estéril 99m Tc salina que contiene la actividad, que fue eluida de la 99m Tc generador. Las soluciones fueron autorizados a equilibrar durante 15 minutos a temperatura ambiente. El volumen infundido en la tráquea se 50-100 μ L DTPA en una concentración de 120-250 μ g. Tc 99m y una actividad de 5-10 MBq. El 99m Tc-DTPA permeabilidad se estudió la medición de la actividad en el corazón-pulmón-el bloque y perfundido muestras. El Tc 99m radiactividad también fue analizado en el blindado 1-L-bien de tipo espectrómetro gamma-en la foto adecuada pico de Tc 99m. Desde el 99m Tc actividad fue escogido para ser al menos un orden de magnitud superior a los 192 Ir depósito en los pulmones, la interferencia de los rayos de Compton en el Tc 99m ventana procedentes de 192 Ir fue insignificante. Tc 99m permeado en la actividad perfundido muestras fue dada como una fracción acumulada de la actividad total infundido recuperado en el perfundido y el corazón-pulmón-bloque.

Preparación y tejido de microscopía

Inmediatamente después de la terminación de la perfusión pulmonar partículas radiactivas los tratados pulmones de aire se seca con aire ambiental a una presión de 3,5 kPa y la posterior distribución de imágenes de partículas. Para histopatología sólo pulmones tratados con no radioactivo iridio partículas se utilizaron. Tras el experimento, la tráquea y la vena pulmonar de la IPL preservados con glutaraldehido al 2,5% en buffer fosfato 0,1 M (pH 7,2, 340 mOsm) a 25 cm de presión fijador. Posterior a la fijación de los pulmones se hizo por inmersión de todo el pulmón en la misma fijación solución por 2 horas a temperatura ambiente. T 25 cm fijador presión. Dos rebanadas de izquierda-derecha y caudal lóbulos de cada animal fueron incluidos en parafina y 5 μ m de espesor fueron teñidos con hematoxilina y eosina. Pequeñas porciones de la parte izquierda del lóbulo de la aa sub-grupo de 7 animales fueron embebidas en Epon ®, y semithin secciones (1 μ m) se tiñeron de azul de toluidina.

Análisis bioquímico de la perfundido

Perfundido muestras se analizaron para la histamina con un kit ELISA de IBL-Hamburg (referencia no. RE 59221). El límite de detección del kit fue de 0,3 ng / ml cuando se usa plasma. Enzima conversora de la angiotensina (ACE) se midió según el método cinético de Maguire y el precio [31] utilizando las normas de los laboratorios Bühlmann AG, Suiza (Referencia KK-ACK), la determinación de proteínas se realizó según la Bicinchonic ácido (BCA) de proteínas de ensayo [32] . Clara-proteína celular se midió en perfundido mediante un inmunoensayo sensible látex [21], con un límite de detección de 1 μ g / l perfundido. Fosfatasa alcalina (ALP) se hizo con determinación KIT fabricados por Diasys Diagnóstico GmbH Alemania Cat no: 104019990314. Las muestras medido (espectrofotómetro Beckman DU 640) a 25 ° C por la longitud de onda de 405 nm. El aumento de la extinción se midió cada minuto por 3 min y actividad de la enzima se midió como la diferencia de la extinción dividido por los minutos multiplicar un factor constante 2754 [33].

Análisis Estadístico

Los resultados se expresan como medias ± SD, y / o como experimentos individuales (fig. 5]. Las diferencias entre los tratamientos se realizarán las pruebas de significación estadística mediante la prueba de Mann-Whitney. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo. Todas las estadísticas se ejecuta con SPSS para Windows XP.

Resultados
La distribución y deposición de partículas

El primer conjunto de experimentos mide la distribución de 192 Ir-UFP relacionados con la radiactividad en los pulmones. El deterioro de los pulmones se observó el rendimiento basado en el aumento de la frecuencia de la inflación para mantener el volumen tidal, pero no puede ser cuantificado en negativo en la presión de perfusión experimental set-up debido a mantener un sistema cerrado para la protección contra las radiaciones razones de seguridad. En una presión positiva utilizando el mismo equipo, el volumen tidal, la respiración y la presión de peso no más de un cambio de 2 horas de perfusión período. La distribución del tamaño de las partículas en el aerosol inhalado fue bien reproducible y contar con la mediana de diámetro (CMD) osciló entre 16 y 18 nm de diámetro de las partículas (Fig. 3]. Desviación estándar geométrica (GSD) siempre fue de 1,6. La deposición de partículas en los pulmones aislados perfundidos se comparó con los animales expuestos en paralelo a la misma aerosol y mostró similar distribución homogénea, con un poco más baja deposición (datos no presentados).

Translocación de las partículas ultrafinas modificado después de permeabilidad

En un gran conjunto de la perfusión en el control de los pulmones no translocación de 192 Ir-UFP partículas y se señaló la diferencia entre la perfusión del diferente es pequeña (<5%), como se muestra en la Fig. 4A. Luego se aplicaron varios tratamientos para investigar el papel de la permeabilidad epitelial y endotelial en la translocación de partículas. En primer lugar, la hiperinflación de duplicar el volumen tidal cada minuto se aplicó, pero no se ha traducido en el aumento de la translocación de las nanopartículas (datos no presentados). La inyección de un bolo inicial de H 2 O 2 en la tráquea de la IPL para llegar a una concentración final de 0,5 mM, a causa de partículas translocación para comenzar a los 60 minutos después de inicio de la inhalación de aerosoles radiactivos. Una diferencia significativa (P <0,05, Mann-Whitney U-test) en las partículas relacionadas con la radiactividad en el perfundido se observó entre el control y el H 2 O 2 en el grupo de 90, 105 y 120 minutos después del inicio de la inhalación (Fig. 4A] . En otro momento de los puntos más allá de 60 minutos las diferencias a los pulmones de los no tratados limítrofes significación (P <0,1; prueba de Mann-Whitney). La diferencia entre la perfusión a este tratamiento en la figura 4A fue mucho mayor que en el control de la perfusión. No obstante, cada presentación de los experimentos de H 2 O 2 pretratados pulmones (Figura 5A] muestran una tendencia similar en todos los perfusión. El aumento de la radiactividad en perfundido sólo se detectó después de 60 minutos de la perfusión. Una vez frente a translocación similar perfil se observó en los pulmones a la presencia de 1 μ M histamina en el líquido de perfusión vascular (Fig 4A]. Sin embargo, aquí la significación estadística en el control de esta condición frente a los pulmones sólo fue alcanzada después de 120 minutos de la perfusión (Fig 4A], que se explica por los distintos experimentos se muestra en la Fig 5B. Por otra parte, en los pulmones tratados con una inyección en bolo no histamina Ir-192 UFP se detectó radioactividad en el perfundido.

Curiosamente, la cinética de translocación de DTPA (Fig. 4B] y Ir-UFP son muy diferentes. Mientras que Ir-UFP sólo empieza a aumentar en perfundido después de 60 min de la inhalación, DTPA se mide en perfundido a los pocos minutos de la instilación intratraqueal. Por otro lado los efectos de H 2 O 2 y vascular histamina en la translocación de partículas se reflejan también en el aclaramiento de DTPA-(Fig. 4B]. Aunque no es significativo, ambos tratamientos causado tendencias de una mayor tasa de translocación de DTPA una hora después de la administración, que también es observado por la translocación de 192 Ir-UFP. La histamina inyección en bolo, con una meta final de la concentración en el lumen del 0,5 mM causó una considerable disminución gradual de la permeabilidad DTPA (fig. 4B], y no se observaron efectos en Ir-192 UFP translocación.

Biomarcadores de daño epitelial y endotelial

Fosfatasa alcalina (ALP) fue medida en el control y tratamiento previo pulmones como un marcador de daño celular tipo II. No se observaron diferencias significativas en la actividad ALP (15-135 minutos) se observaron entre perfundido control de la IPL y H 2 O 2 previamente tratados pulmones después de la exposición a 192 Ir-UFP (Fig 6A]. En la IPL vascular histamina perfundidos con una menor actividad de la ALP fue vista en 15 y 30 minutos en comparación con la perfusión del pulmón que sólo recibió 192 Ir-UFP por inhalación. En otro momento todos los puntos ALP no mostraron diferencias para el control de los pulmones (Fig 6A]. La histamina bolo grupo hizo también no difieren de grupo de control. Para evaluar el daño endotelial, la enzima convertidora de angiotensina (ACE) se midió en el pulmón perfundido (Figura 6B]. No se observaron diferencias significativas en la actividad de la ECA entre el grupo control y los pulmones aislados y tratados con H 2 O 2, histamina en perfundido histamina o entregados como bolo en la tráquea (ANOVA, post-hoc de Tukey y la prueba de Mann-Whitney). Para comprobar si el H 2 O 2 efecto fue mediado por la liberación de histamina se mide la histamina en el perfundido, pero no detectaron diferencias significativas a los niveles de histamina en el control de la perfusión (datos no presentados). También una medida de la proteína total de permeabilidad pulmonar no detectó diferencias entre los distintos tratamientos utilizados en estos experimentos.

Morfología de los pulmones

Los resultados de los análisis histopatológicos se resumen en la Tabla 1 y se ilustra en la Fig. 7. En general hay bastante grandes daños al final de la perfusión de los experimentos, pero no hay muchas diferencias entre los distintos tratamientos. Sub-epitelial, infiltración de células redondas, junto con la dilatación intersticial moderada a grave edema estuvo presente en todos los grupos. De vez en cuando la dilatación alveolar, alveolar inflamación y líquido en el lumen alveolar se detectaron. El procedimiento de perfusión in vitro pueden ser responsables de la dilatación peribronchial perivasculares y en todos los pulmones. H 2 O 2 podría ser directamente responsable de los daños epiteliales de los bronquios proximales en el H 2 O 2 inculcado grupo.

Discusión

El objetivo de nuestro estudio fue evaluar la función de la barrera epitelial y endotelial en la translocación de las partículas ultrafinas a través de los pulmones a la circulación sistémica utilizando el modelo de pulmón aislado perfundidos. Translocación de Iridium (Ir) partículas fue supervisado por la radiactividad de las partículas mismas, y no por ninguna etiqueta adjunta radiactivos. No translocación de 192 Ir-UFP (17-20 nm) se detectó en los pulmones de ratas aislados y perfundidos. Sin embargo pulmones previamente tratados in-situ con histamina en el lado endotelial (1 μ M) o de H 2 O 2 (0,5 mM) en el lumen alveolar mostró pequeñas cantidades de radiactividad en el perfundido sola pasada después de un período de tiempo de 60 min. Si bien la cinética de las partículas DTPA y translocación eran diferentes los tratamientos in-situ y de la histamina H 2 O 2 causados unidireccional en ambos procesos, en ausencia de pruebas bioquímicas de daño epitelial y endotelial.

En este estudio se aplican varios tratamientos ex vivo de los pulmones aislados o bien con H 2 O 2 o la histamina. Uso de H 2 O 2 se prevé que induce un estrés oxidativo, que también es causada por la inhalación PM en el pulmón por tanto directamente la formación de radicales por la tarde y los mandantes indirectamente contratados por células inflamatorias (revisión: [34]]. El estrés oxidativo ha sido enviado como un hipotético mecanismo central en los efectos negativos de la tarde, incluyendo partículas ultrafinas [35]. En realidad, la capacidad oxidativa de la tarde fue demostrado por nosotros para ser un predictor de la respuesta inflamatoria bronquial a la tarde después de la instalación en condiciones normales de voluntarios humanos [26]. A principios de Rhaman et al [36] transmitió que el estrés oxidativo y el agotamiento de GSH puede afectar a los pulmones de una mayor permeabilidad que permite el paso de partículas a través de epitelio pulmonar en el intersticio. Este concepto es apoyado por nuestros datos utilizando una alta concentración de H 2 O 2 (5 mM) en bolo por inyección en el pulmón, para llegar a una concentración final de 0,5 mM. De hecho, el revestimiento pulmonar-líquido de los pacientes con EPOC se ha demostrado que contienen niveles de H 2 O 2 hasta 5 μ M [37]. A pesar de que este modelo no cumplir con todas las condiciones de una respuesta inflamatoria, modelos similares se han aplicado en otras ex-vivo permeabilidad de los estudios [38, 39]. En aislado de rata perfundidos pulmones, una baja concentración de H 2 O 2 (0,25 mM) en el perfundido fue demostrado que aumenta la permeabilidad capilar, en ausencia de la peroxidación lipídica [38]. A corto plazo, el tratamiento con H 2 O 2 (100 mM) en el epitelio de la vía aérea humanos tubos causó un aumento de seis veces en la translocación de 111 In-DTPA, que se explica por la apertura de vías paracellular [39]. En nuestro estudio, suponemos que luminal concentración final de 0,5 mM H 2 O 2 es alcanzado y hemos encontrado un aumento en la translocación de ambos UFP Ir-192, así como una tendencia al aumento de la translocación de 99m Tc-DTPA después de un período de tiempo que De alrededor de 60 min. Sin embargo, ninguna relación temporal entre los dos marcadores de translocación fue visto, que sugieren que operan a través de diferentes rutas.

Más datos sobre la ruta de translocación de 192 Ir-UFP en los pulmones se da por los resultados obtenidos con la histamina administrada tanto en el lado luminal y a través de la microvasculatura. Estos datos muestran que la histamina en niveles muy bajos en el perfundido (1 μ M) provocó un aumento de la translocación de las partículas, así como 99m Tc-DTPA-permeación después de un período de tiempo de unos 60 minutos (Fig 4]. Por otro lado luminal administración de la histamina (0,5 mM) no aumentó 192 Ir-UFP translocación y, de hecho, mostró una ligera reducción 99m Tc-DTPA permeación. La histamina es un potente mediador vasoactivo bronquial y que se ha demostrado que el estar involucrados en ambos efectos locales y sistémicos de las partículas de diesel [40]. En primer lugar, a la degranulación de mastocitos histamina es el principal mediador de la constricción bronquial, como se observa en la respuesta alérgica vía aérea [41]. Esta constricción probablemente también explica la reducción en nuestro 99m Tc-DTPA de limpieza después de una inyección en bolo histamina en la tráquea. El enfoque utilizando vascular histamina es pertinente porque la histamina ha demostrado que aumenta después de la instilación de las partículas en tracheally aislados perfundidos de conejo pulmón ex-vivo (Nemmar et al, 1999) [42], hámsters in vivo (Nemmar et al, 2003) [11 ] Y voluntarios humanos sanos (Salvi et al, 1999) [43]. Suponemos que la histamina en bajas concentraciones (10 -6 M) en el sistema aumenta la permeabilidad endotelial [44], y permite un aumento en el transporte intercelular de 192 Ir-UFP ubicado en el intersticio a través del endotelio en el perfundido. Un efecto similar de 10 -4 M vascular histamina se encontró recientemente en pulmones aislados y perfundidos de conejo (Nemmar et al, 2005) [45]. En este último estudio de las partículas de látex (24-190 nm) trasladadas desde el compartimento vascular hacia la luz, como ha señalado la posterior lavado broncoalveolar. El importe de invertir translocación fue de alrededor del 2,5% de la dosis administrada dentro de 2 horas de la perfusión. No translocación de las partículas de látex con diferentes tamaño (24-190 nm) y la química de superficie (carboxilato versus amina), y se observó a cargo, bajo condiciones normales de las condiciones fisiológicas en el conejo pulmones. En nuestros estudios de las partículas de 18 nm iridio no trasladar también a través de las barreras de pulmón de rata, a pesar de que utiliza la ventilación por presión negativa que causó considerables daños al tejido pulmonar.

En su conjunto estos resultados sugieren que la translocación de partículas ultrafinas en el pulmón se producen a través de diferentes rutas. Entre las diferentes rutas de captación podemos discriminar transcitosis y párrafo (inter)-celulares de transporte. Hermans et al [46] declaró que radiomarcado marcadores como 99m Tc-DTPA etiquetados permear la barrera epitelial intercelular al pasar por los cruces. Desde la cinética de DTPA y 192 Ir-UFP translocación no tratados en los pulmones es tan diferente, sugerimos que Ir-192 UFP son trasladadas a lo largo de diferentes vías. De hecho, partículas ultrafinas pueden utilizar diferentes vías transcytotic como clathrin revestida de piscinas, pinocytosis y no recubierto piscinas, llamado caveolae [47]. Caveolae son la vía más probable de la absorción de los 192 Ir-UFP utilizado en nuestro estudio (18 nm), tal como se deriva de los estudios realizados por Gumbleton [47]. Las células del epitelio alveolar, que comprende el 95% de la superficie de pulmón de células tienen un espesor de 400 nm y aproximadamente 600,000 a 900,000 caveolae que son 50-60 nm de ancho. Ese alto número de unidades de transporte posible llevar a condición de que el PN de menos de 60 nm pueden ser rápidamente asumido y transportados a través de la capa de células epiteliales. Recientemente Kato et al (2003) [48] mostró que la lecitina de poliestireno recubierto de látex perlas (240 nm) se incorporaron en el Tipo Iy II, las células epiteliales alveolares, así como en el lumen capilar. Se sugirió que estas perlas de látex pasar de las células del epitelio alveolar capilar a la luz a través de transcitosis. Kapp et al (2004) [49] encontró Ti0 2 (29 mn), partículas intracelulares como las agrupaciones que forman partículas forma de agujas o partículas de forma redondeada. Esto también puede explicar el relativamente bajo y variable translocación como se observa en otros, en los anteriores estudios in vivo [15 - 18]. Por lo tanto, antihistamínicos para modificar o facilitar el paso trans-endotelial y, de hecho, constató que este aumento de la translocación de 192 UFP-Ir a la perfundido. Sin embargo, no podemos discriminar entre transcitosis y para-celulares en el endotelio de transporte. Suponemos que el largo período de tiempo (60 min) detectó que se necesita antes de pasaje es causada por el hecho de que un intersticial de carga tiene que ser construida por el paso del epitelio de 192 Ir-UFP en el pulmón. Los métodos utilizados en nuestro estudio y el estudio de Nemmar et al (2005) [45] no permiten evaluar si se ha producido a través de la translocación partículas primarias o de los agregados. La inhalación en nuestro estudio asegura único UFP deposición alveolar en la región y prácticamente no hay aglomeración en el epitelio alveolar, debido a la superficie y el número de partículas depositadas. Sin embargo, a la inyección vascular agregados se forman, salvo las modificaciones de superficie que se utilizan obstaculizar este proceso. Por lo tanto, puede ser que translocación observado en el estudio de Nemmar ocurre como agregados por encima de los mecanismos de facilitación o por ataque de las células fagocíticas, pero no en nuestro estudio. En este sentido, los estudios realizados por Heckel et al (2004) [50] han demostrado que el 4 por TEM nm-partículas de oro realmente pasa membranas y llegar a la luz como partículas individuales. La diferencia entre 4 y 20 nm partículas pueden sin embargo ser enorme desde el 4 de AU-nm partículas no son reconocidas por el sistema retículo-endotelial.

Nuestros hallazgos pueden ser criticado debido a una serie de factores que se asocian a nuestro diseño experimental y el rendimiento. En primer lugar, hay que tener en cuenta que los aislados y perfundidos pulmones no están bajo condiciones fisiológicas, ya que, por ejemplo, el flujo linfático se altera, se suprime la perfusión bronquial, inervación autonómica está desconectado y no células de la sangre (incluyendo células inflamatorias) están presentes en el Perfundido. Sin embargo la presión negativa artificial de la perfusión aislada de pulmón se asemeja a afecciones respiratorias y el período de tiempo de los experimentos se limitaba hasta 2 horas como máximo para evitar una excesiva disminución de la función. Sabiendo esto, la falta de medición fisiológicas concomitante en la presión negativa de ventilación es una de las principales falencias en nuestros datos. La obvia razón de ello es que, dada la utilización de Ir-192 radiactivo UFP inclusión de los dispositivos de medición se permitió por razones de seguridad, la protección contra las radiaciones, ya que podría dar lugar a un sistema abierto y de las emisiones de partículas radiactivas. Hemos tratado de compensar esta falta de conocimientos técnicos de la medición de los índices bioquímicos de los daños en perfundido y la realización de la histología en los pulmones después de la prueba. No hay evidencia de daño pulmonar extensa en el control de las condiciones o después del tratamiento in situ de los principales obstáculos de pulmón se señaló. La liberación de ALP y ACE como biomarcadores de la integridad epitelial y endotelial no son elevados durante la perfusión y no corresponden a la pequeña translocación de 192 Ir después de un período de tiempo de unos 60 minutos-UFP. Aunque en el análisis microscópico del pulmón mostró desquamation secciones de la capa epitelial de los pulmones tratados in situ con peróxido de hidrógeno, ALP perfundido en los niveles no fueron diferentes de que en el grupo control. Las condiciones experimentales también no afecta a la integridad de la capa endotelial desde perfundido niveles de la ECA no se modificaron durante la perfusión. Sin embargo, en la mayoría de los pulmones se observó edema en la microscopía como la dilatación intersticial (Tabla 1] al final del experimento. La formación de edema se debe al desequilibrio entre el líquido transvascular de filtración y remoción. También el exceso de líquido provoca un intersticio de la sobrehidratación asociados a la acumulación de líquido en el edema del tejido conectivo suelto [51]. Podría argumentarse que el edema podría afectar a la translocación de Ir-192 UFP de la luz a través del intersticio a través del endotelio. De hecho, un estudio reciente utilizando iv inyección de partículas de oro coloidal (4 mn), en conejos, mostraron que un pequeño pero significativo porcentaje (7%), de la UFP fue considerado en endoteliales y células epiteliales del pulmón [50]. Después de la infusión LPS, causando leve edema pulmonar, transendothelial transporte se ha visto impulsada por cinco veces, mientras que una cantidad significativa de partículas de oro acumulado en el intersticio (14%) e incluso llegó a los alvéolos (11%). Aunque esto sugiere una posible interferencia de edema en nuestro estudio, uno debe darse cuenta de que en el estudio anterior [50] edema estuvo presente en el principio y translocación se sigue en una dirección diferente. Sin embargo un efecto de las partículas sobre el edema translocación se considera poco probable en nuestra configuración experimental, ya que no Ir-192 UFP translocación se observó en el grupo control y después de un bolo histamina para un máximo de 2 horas después del inicio de la inhalación.

La translocación de 192 minutos Ir-UFP aisladas en el sistema de perfusión pulmonar se ajusta a nuestros anteriores hallazgos in vivo [15] usando la misma por la inhalación de partículas en dosis similares en ratas. Otros estudios informaron sin embargo muy diferentes cantidades y cinética de la translocación. Nemmar et al [16] estudiaron las partículas translocación después de la instilación intratraqueal de uF partículas en hámsters in vivo y observó un rápido (3% dentro de los 5 min) translocación de las partículas de 80 nm de albúmina recubiertas con Tc 99m, pero no se observó translocación después de los 15 minutos. Por otra parte, el mismo grupo no pudo encontrar látex (24-190 nm) translocación de partículas aisladas de conejo perfundidos con presión positiva en los pulmones [45]. Química de la superficie no afectó a este proceso. En un enfoque similar utilizando látex perlas fluorescentes y ventilación con presión positiva, también no encontró translocación de partículas (datos no presentados). En contraste Brooking et al [48] muestran un continuo aumento en la translocación con el tiempo hasta los 180 minutos durante nasal la inhalación de partículas de látex entre 50 y 250 nm por las ratas. El último estudio se destacó la importancia de que el tamaño de las partículas más pequeñas partículas ultrafinas mostraron mayores tasas de captación a las grandes partículas. Además se demostró que la superficie química de las partículas es una característica importante [52]. Oberdorster et al [18] informó de muy amplia (> 20%) de translocación uF partículas de carbono (18 mn), a corto plazo después de la inhalación. Cualquiera que sea el mecanismo o propiedades de las partículas involucradas en el pulmón, pasando obstáculos, la pregunta sigue siendo qué partículas translocación significa en términos de efectos sistémicos. La principal hipótesis es que provoca la inflamación del pulmón y facilita la liberación de mediadores que afectan negativamente a los parámetros cardiovasculares [3]. Alternativamente, la translocación de las partículas en el cerebro (Oberdorster et al, 2004) [53] o de la circulación sistémica también puede explicar los efectos de la tarde la exposición sobre el corazón y tejido vascular. La sangre que sale de los pulmones entra por primera vez en el corazón antes de que sea bombeada a los demás órganos. En nuestros trabajos anteriores que muestran que las suspensiones o filtrados de PM 10 podría tener efectos directos en los buques [9]. Sin embargo, los efectos son más bien debido a los componentes solubles (es decir, metales de transición) que a ellos mismos partículas [9] y están en contraste con los resultados in vivo sobre la función endotelial con el PM [54, 10] 2004).

Aunque estos datos no permiten conclusiones cuantitativas sobre el mecanismo exacto y la importancia de la translocación de UFP sistémica como un mecanismo de los efectos adversos de la tarde, lo que hacemos confirmar que las partículas ultrafinas pueden trasladar de la circulación pulmonar en la utilización de la rata aislados perfundidos a pulmón Farmacológica mediación. Permeabilidad de la barrera pulmonar a partículas ultrafinas parece estar controlado tanto en el nivel epitelial y endotelial y condiciones que afectan a esta función barrera, como la inflamación puede afectar a la translocación de la UFP. Las condiciones en las que esto ocurre imitar las condiciones que se cumplen en los enfermos, incluidos los sensibles temas de los asmáticos y los pacientes con EPOC.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo del Ministerio alemán de Medio Ambiente (BMU) y el Medio Ambiente de Baden-Württemberg programa de investigación de armas biológicas Plus, proyecto número 20018. Damos las gracias a Doris dr Hoehr Erich Jermann y para la asistencia técnica durante la puesta en marcha del proyecto, y el doctor Roel Schins por sus valiosas sugerencias durante la realización del estudio.