Theoretical Biology & Medical Modelling, 2005; 2: 19-19 (más artículos en esta revista)

Cuantificación de la glucógeno sistema en cascada: la ultrasensibles respuestas de hígado de glucógeno sintasa y fosforilasa muscular se deben a los diseños distintivos de reglamentación

BioMed Central
Vivek K Mutalik (vivekm@che.iitb.ac.in) [1], KV Venkatesh (venks@che.iitb.ac.in) [1]
[1] Departamento de Ingeniería Química y la Escuela de Biociencias y Bioingeniería, Instituto Indio de Tecnología, Bombay, Powai, Mumbai-400 076, India

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Resumen
Antecedentes

Vías de señalización son intrincadas redes de los ciclos de modificación covalente reversible. Esa enzima multicyclic cascadas de ampliar la entrada de estímulo, la causa de integración de múltiples y muestran señales de salida de las respuestas sensibles. Reglamento de la glucógeno sintasa y fosforilasa modificación covalente reversible por ejemplo los ciclos de transducción de señales por cascadas de la enzima. Aunque este sistema de regulación de la síntesis de glucógeno y desglose parece similar en todos los tejidos, las sutiles diferencias han sido identificados. Por ejemplo, la fosfatasa-1, un enzima dephosphorylating del sistema, está regulado de manera muy diferente en el músculo y el hígado. ¿Estas pequeñas diferencias en la estructura reglamentaria que afecta el rendimiento general de la cascada de glucógeno en un tejido específico? Estamos abordar esta cuestión mediante el análisis de la estructura reguladora de la cascada sistema de glucógeno en el hígado y las células del músculo en estado de equilibrio.

Resultados

El sistema de cascada glucógeno en el hígado y las células musculares se analizó en el estado de equilibrio y los resultados fueron comparados con datos de la literatura. Se encontró que el sistema de cascada de exposiciones muy sensibles-como cambiar las respuestas a los cambios en la concentración de AMP cíclico y los resultados son sorprendentemente diferente en los dos tejidos. En el músculo, la glucógeno fosforilasa es más sensible que la glucógeno sintasa a AMP cíclico, en tanto que lo contrario se observó en el hígado. Además, cuando el hígado sufre una transición de hambre alimenta-estado, el inútil ciclo de la simultánea de síntesis y degradación del glucógeno cambia a la regulación de reciprocidad. En virtud de esa transición, diferentes proporciones de activos glucógeno sintasa y fosforilasa pueden coexistir debido a la inhibición de diferentes glucógeno sintasa de la fosfatasa activa por fosforilasa.

Conclusión

La muy sensible respuestas de glucógeno sintetasa en el hígado y en la fosforilasa muscular primaria a los estímulos puede atribuirse a los diseños distintivos reglamentarios en el sistema de cascada de glucógeno. Las diferentes sensibilidades de estas dos enzimas Mayo ejemplo de la adaptación de estrategias empleadas por el hígado y las células musculares para satisfacer las demandas específicas de celulares.

Antecedentes

Señalización de las redes y vías metabólicas en las células vivas se rigen a través de una compleja red de cascadas de la enzima. La estructura reglamentaria de estos covalentes modificación cascadas, en combinación con allosteric interacciones determina el control de los procesos celulares [1, 2]. Un ejemplo prototípico de esta enzima en cascada sistema es la regulación de la glucógeno fosforilasa (GP) y la glucógeno sintetasa (GS), enzimas que intervienen en la degradación del glucógeno (glucogenolisis) y síntesis (glucogénesis), respectivamente [3 - 6]. Para evitar un inútil ciclo, la activación simultánea de la glucogenolisis y se impide la síntesis de glucógeno a través de la regulación recíproca de glucógeno fosforilasa y sintetasa de las actividades por un único regulador de red [5, 6]. A pesar de que esta regulación recíproca es idéntica en todos los tejidos, hay sutiles diferencias distintivo que indica las estrategias de adaptación en diferentes tipos de células. Por ejemplo, en el músculo esquelético, phosphoprotein fosfatasa-1 (PP1) es inactivada por allosterically inhibidor-1, mientras que en el hígado no inhibidor específico se ha observado [3, 7]. En lugar de ello, se ha demostrado que activa GP sí juega un papel inhibitorio similar, la regulación de la SG en cascada por allosterically inactivación de la fosfatasa correspondiente [8] (Fig. 1]. En el hígado, la fosforilación estados de GP y GS están reguladas por la glucosa y la glucosa-6-fosfato, mientras que en el músculo, GP y GS están regulados principalmente por AMP cíclico (AMPc) y la concentración de calcio [9]. A falta de glucógeno en el hígado, es decir, bajo condición de hambre, los dos GP y GS parecen coexistir en una forma activa que constituya un ciclo fútil, superando así la reciprocidad en un reglamento existente normalmente alimentados condición [10]. En el presente trabajo, hemos cuantificado el glucógeno sistema de cascada en el estado de equilibrio para examinar el efecto de la arquitectura de red sobre su desempeño en el hígado y el músculo. También hemos adquirido conocimientos sobre el funcionamiento del sistema en el hígado y alimentados bajo condiciones de hambre. El modelo incorpora el estado de equilibrio de la estructura en cascada, de varias etapas y cero para los efectos y los inhibidores de la sensibilidad en respuesta a AMPc y de la glucosa.

El sistema de regulación de la síntesis de glucógeno y desglose consiste principalmente en la fosforilación y dephosphorylation de fosforilasa quinasa (PK), que además regula las actividades de GP y GS [revisado en [3 - 6], [9 - 12]] (Fig. 1] . Las actividades de estas enzimas dependen de las señales extracelulares como hormonas y el metabolismo celular de las señales, como la glucosa y los niveles de cAMP [5, 11]. Fosforilación de GP y GS convierte catalíticamente a más activo (a la forma) y los inactivos (b-forma) las especies que sus respectivas formas dephosphorylated. GP se activa por PK, en la que-a su vez se activa por AMPc dependiente de la proteína quinasa (CAPK). GS es inactivada por múltiples proteínas cinasas incluidas CAPK y PK [9]. PP1 es una de las principales fosfatasas catalizar la dephosphorylation de PK, GP y GS. El PP1 regulación de la actividad es muy distinta en los músculos y el hígado, que son los principales sitios de la glucogenolisis y glucogénesis (Fig. 1]. En el hígado, GS fosfatasa allosterically es inactivada por activa GP, mientras que en el músculo, PP1 es inactivada por allosterically activado CAPK-inhibidor-1 [3, 5, 9, 12]. Por lo tanto, un mayor nivel de cAMP en el citosol de músculo, no sólo aumenta la fosforilación de PK, GP y GS, sino que también disminuye su dephosphorylation mediante la regulación de las correspondientes fosfatasas. Además de la modificación covalente, GP y GS están también regulados por allosteric interacciones. AMP es un activador allosteric, mientras que la ATP y la glucosa-6-fosfato se allosteric inhibidores de la fosforilasa-b [3]. B-sintasa allosterically es inhibida por las concentraciones fisiológicas de ATP, ADP y fosfato inorgánico, y es también allosterically activado por la glucosa-6-fosfato [9].

Teóricas y experimentales cuantificaciones [13 - 23] han puesto de manifiesto que existen importantes ventajas en disponer de un enzima interconvertible estructura en cascada en lugar de un simple allosteric interacción. Estos pueden incluir la señal de amplificación, la flexibilidad, robustez, y ultrasensitivity señal de la integración [22]. Ultrasensitivity se ha definido como la respuesta de un sistema que es más sensible a los cambios en la concentración de un ligando de la normal respuesta hiperbólica representada por la ecuación de Michaelis-Menten [20]. El coeficiente de Hill se ha utilizado como un parámetro de sensibilidad para cuantificar sigmoidal, la pendiente de las curvas de dosis-respuesta [22]. A Hill coeficiente mayor que uno indica un ultrasensibles respuesta, y de un valor inferior a un subsensitive indica una respuesta. La existencia de ultrasensitivity covalentes modificación en los ciclos se debe a la operación de enzimas en una región de saturación con respecto a sus sustratos (lo que se denomina orden cero sensibilidad) [14, 15], la participación de la misma efector en varios pasos de un camino [15 ], Y la presencia de inhibidores de stoichiometric [20]. Todos estos requisitos para ultrasensitivity parecen ser cumplido por las cascadas de enzimas que participan en la síntesis y degradación del glucógeno.

Edstrom y compañeros de trabajo [24, 25] han proporcionado la prueba experimental de orden cero ultrasensitivity en la glucógeno fosforilasa muscular en cascada. Análisis teórico de la glucosa inducida por cambiar entre la glucógeno sintasa y fosforilasa en el hígado mostraron la posibilidad de un marcado límite en la respuesta [26]. Además, los múltiples efectos de cAMP en la cascada del sistema de glucógeno se logran mediante la activación de paso adelante y de la inhibición indirecta paso inverso (inhibición de fosfatasas), por lo tanto, cumplir el requisito de ultrasensitivity [27]. Aunque se sabe que el segundo mensajero AMPc afecta a cinco diferentes pasos en la glucógeno cascadas, de su papel eficaz en múltiples ultrasensitivity no se ha cuantificado. La salida de la ejecución de la glucógeno sintasa y fosforilasa cascada en presencia de un inhibidor no se ha caracterizado.

El objetivo principal del actual trabajo fue comparar la estructura reguladora de la cascada del sistema prevaleciente de glucógeno en el hígado y el músculo a través de análisis el estado de equilibrio. La cuantificación incorpora las influencias de todos los efectores que regulan la producción de glucógeno respuesta de la cascada del sistema. Los resultados de la simulación reveló que el sistema de cascada de exposiciones muy sensibles-como cambiar las respuestas a los cambios en la concentración de AMPc y la salida de las respuestas son sorprendentemente diferente en el músculo y el hígado. En el músculo, la glucógeno fosforilasa es más sensible que la glucógeno sintasa a AMPc, mientras que lo opuesto se observa en el hígado. El estado de equilibrio análisis indica que, cuando el hígado sufre una transición de estado alimenta a los hambrientos, diferentes proporciones de los activos GP y GS pueden coexistir. La transición de esa inútil ciclo de reciprocidad a la regulación depende de la inhibición de diferentes GS fosfatasa GP y por este reglamento sean necesarias para hacer frente a los problemas que existen en virtud de las condiciones de hambre.

Materiales y métodos

Las cascadas de enzimas que participan en la regulación de la síntesis y degradación del glucógeno en el músculo y el hígado se muestra esquemáticamente en la Fig. 1A y 1B, respectivamente. Las concentraciones de metabolitos de la ATP, AMP y PPi se asume como constante a lo largo del análisis. Allosteric reglamentos de GP y GS por estos metabolitos y efectores también son desatendidas. La información detallada sobre el conjunto de ecuaciones y la lista de los parámetros utilizados para la simulación se dan en el Apéndice. La mayoría de los parámetros y las concentraciones de la enzima se toman de las fuentes de la literatura y el mismo conjunto se ha utilizado para simular el sistema de cascada de glucógeno del músculo esquelético y Hígado. En el presente trabajo, la concentración de cAMP se considera el principal aporte a la cascada de glucógeno. El fraccional activaciones de SG (dephosphorylated forma) y GP (fosforilados forma) se toman como la salida de las respuestas de los sistema de glucógeno. Los efectos de cAMP en la cascada de enzimas están mediadas a través de la activación de la allosteric enzima CAPK. En ausencia de cAMP, CAPK existe como inactivas holoenzyme, R 2 C 2, estrechamente vinculado con subunidades de la reglamentación dímero R 2 y la subunidad catalítica C. Sin embargo, en presencia de cAMP, R 2 C 2 se activa a través de la Unión de AMPc a la subunidad de reglamentación y posterior disociación de la holoenzyme cAMP en determinada subunidades reguladoras y de la subunidad catalítica libre [17]. El régimen general de la reacción de activación es CAPK,

R 2 C 2 + 4 (AMPc)2C + R 2 (AMPc) 4 [1]

En el presente trabajo, CAPK activación por cAMP se supone que es paso por paso disociación de la subunidad catalítica. La expresión analítica para cuantificar la activación CAPK se toma de Shacter et al. [17] y se supone que el complejo entre la subunidad catalítica de CAPK enzima y su objetivo es insignificante en comparación con la concentración total de CAPK. La activación de CAPK en términos de formación de la subunidad catalítica se evalúa mediante la siguiente ecuación cúbica (véase el Apéndice para más detalles):

Donde (R 2 C 2) t denota la total CAPK, C es la subunidad catalítica, (AMPc) es el total de la concentración de cAMP, y K 11 y K 22 son las constantes de disociación de la primera y segunda respectivamente subunidades catalíticas. A raíz válida se obtuvo como total CAPK subunidad catalítica de concentración utilizando Eq. 2 y se toma como insumo para la modificación de las enzimas objetivo abajo.

Figura 1A muestra el esquema de las cascadas de enzimas que participan en la regulación de la síntesis y degradación del glucógeno en el músculo esquelético. Aunque la fosforilación de doble y múltiple PK fosforilación de la SG se han observado in vitro [5, 9], por simplicidad hemos considerado un único sitio de la fosforilación de estas enzimas. Para incorporar el PK y CAPK catalizó la fosforilación de la SG, se supone que tanto el formulario de enzimas catalizar una piscina antes de la SG fosforilación. Ca +2, que actúa como un estímulo de entrada al sistema, se supone que estarán presentes en las concentraciones correspondientes a la plena activación de PK. Fosforilados Inhibidor-1 inactiva la PP1 por un allosteric reacción, pero que no inhibe la fosfatasa-2A. En este sentido, consideramos que la fosfatasa 2A-como dephosphorylating activo inhibidor de la enzima-1, como inhibidor-1 no inhibe su propia dephosphorylation incluso a saturar la concentración [3].

Figura 1B muestra el esquema de la estructura en cascada de glucógeno en el hígado. Los estudios in vitro han demostrado que la glucosa-6-fosfato puede estimular dephosphorylation GS y de inhibir la fosforilación de GP y GS-b-a, mientras que la glucosa actúa como un activador de allosteric GP Fosfatasa [28 - 33]. En el presente trabajo, hemos incorporado a lo largo de estos efectos con el allosteric inhibición de la PP1 por GP-a. Se supone que la glucosa y la glucosa-6-fosfato influir en la fosforilación y dephosphorylation reacciones por la disminución de las respectivas constantes de Michaelis-Menten (véase el Apéndice de ecuaciones). Concentración de glucosa se varió entre el 0,1 mM a 100 mM y el correspondiente nivel de la glucosa-6-fosfato se calculó que se fisiológicas en la gama de 0.1-0.5 mM. El nivel intracelular de AMPc está regulado por la concentración de glucosa a través de las señales hormonales, tales como glucagón. La relación inversa entre los niveles de glucosa y el AMPc se incorporó a la estimación de los niveles de cAMP de la concentración de glucosa (detalles en el Apéndice)

El rendimiento de la enzima cascadas en respuesta a diferentes estímulos de entrada cAMP fue analizada por la ecuación de estado de equilibrio de funcionamiento de la obra clásica de Goldbeter y Koshland [14]. A título ilustrativo, se presenta la siguiente ecuación cúbica, que cuantifica la activación fraccional inhibidor-1 (Figura 1A], tomando todas (Michaelis-Menten) de los complejos de una cascada en cuenta:

Donde f 1 = I / I t, t es el total inhibidor de la concentración, (PP2) t es el total de la fosfatasa 2A y otros términos como son dadas en la Fig. 1A. A partir de la limitación 0 <f 1 <1, válido raíz se obtuvo como un inhibidor de la utilización de fracciones sin modificar modos de ecualización. 3. El fraccional fosforilados inhibidor (es decir, I p / I t) puede obtenerse en la siguiente relación,

La ecuación para el funcionamiento allosteric interacción de PP1 con inhibidor de la fosforilasa-1 y se ha tomado de nuestros trabajos anteriores [34]. La siguiente ecuación cuadrática se utilizó para simular el allosteric inhibición de los músculos PP1 por fosforilados inhibidor-1, dada por

PP1.I donde p es inactiva PP1 y K d es la constante de disociación:

Donde (PP1) t es el total PP1 y f 3 es la inactivada fraccionada PP1 (es decir, (PP1.I p) / (PP1) t). El fraccional libre (activo) de las especies PP1 (es decir, 4 = f (PP1) / (PP1) t) se puede estimar por f 4 = 1 - f 3.

En el presente trabajo, la conexión en cascada de complejos se descuidan. Por ejemplo, los complejos de PK con GP-b y PK con la SG-a se descuidan en el saldo total de PK (detalles en el Apéndice). La ecuación de estado de equilibrio de funcionamiento de los distintos ciclos y modificación covalente allosteric interacción fueron secuencialmente conectado a la salida de evaluar la respuesta de la estructura en cascada es decir fraccional modificación de GP y GS a la entrada principal estímulo, AMPc en el músculo y la glucosa en el hígado (detalles en el Apéndice) . Estas ecuaciones se resolvieron simultáneamente utilizando Matlab (The Mathworks Inc EE.UU.) para obtener las curvas de dosis-respuesta para el estado de equilibrio fraccional de activación de todos los componente de las enzimas en los diversos niveles de entrada estímulo. Dado que la mayoría de los parámetros se toman de los diferentes informes experimentales, se realizó el análisis de sensibilidad en el conjunto de datos completo. Para evaluar la sensibilidad a las variaciones en los distintos parámetros, cada parámetro fue variado a lo largo de 10 veces mientras que la celebración de todos los demás parámetros constantes.

Resultados

El estado de equilibrio se utilizó el modelo para obtener las curvas de dosis-respuesta para la fraccional activaciones de la componente de las enzimas en la síntesis y degradación del glucógeno. Figura 2A muestra fraccional modificación de la GP, GS, PK, y CAPK inhibidor-1 en diversos concentración de AMPc en el músculo esquelético. Las curvas de dosis-respuesta muestran un aumento de la amplificación de la señal y la sensibilidad como la señal se propaga por la cascada. La activación de CAPK fraccionada en varias concentraciones de cAMP (curva 'e' Fig. 2A] muestra una curva de respuesta con un aparente Hill coeficiente ( ), De 1,12 y de la simulación de resultados están de acuerdo con los estudios experimentales in vitro reportados por Beavo et al. [35]. Las modificaciones fraccional de GP y GS demostrar ultrasensitivity con aparente Hill coeficientes de 34 y 7,3, respectivamente (Figura 2A]. Anteriores estudios teóricos y experimentales por Edstrom y compañeros de trabajo sobre la glucógeno fosforilasa informó una cascada Hill coeficiente de 2,3 en ausencia de inhibidor de la acción-1 en el músculo [24]. En trabajos posteriores, se observó que la fosforilasa cascada exhibe una mayor sensibilidad en presencia del inhibidor de la fosfatasa [25]. Para evaluar la contribución de cada uno de los parámetros de salida en la respuesta del sistema, que lleva a cabo el análisis de sensibilidad en el conjunto de parámetros. Los resultados indican que la sensibilidad de GP y GS pantalla-como cambiar los productos en respuesta a la variación en una amplia gama de parámetros (Tabla 1]. Además, cabe señalar que la sensibilidad de los GP de respuesta es siempre mayor que la de GS en el músculo esquelético, independientemente del rango considerado para el conjunto de parámetros. Nuestros resultados muestran que la simulada, en la ausencia de inhibición por PP1 inhibidor-1, la pendiente de las curvas de dosis-respuesta y la disminución de la señal de amplificación (véase la Fig. 2B]. El fraccional activaciones de GP y GS mostrar aparente Hill coeficientes de 3,8 y 1,9 respectivamente, en comparación a una muy sensible respuesta en la presencia del inhibidor de la acción. Esto demuestra que inhibidor ultrasensitivity desempeña un papel importante en la difusión de la sensibilidad a la GP y GS respuestas en el músculo.

El análisis se extendió a la cascada sistema de glucógeno en el hígado. La coordinación de los cambios en la fosforilación de PK, GP y GS están bajo la influencia de cAMP, la glucosa y la glucosa-6-fosfato concentraciones (Figura 1B]. La Figura 3 muestra el rendimiento previsto de la cascada sistema de glucógeno en el hígado a diferentes concentraciones de glucosa, la glucosa-6-fosfato y de cAMP. Los resultados son sorprendentemente diferentes de los obtenidos en el músculo. Figura 3A muestra que la activación de GS fraccional exhibe un fuerte respuesta con un aparente Hill coeficiente de 13,6, mientras que GP demuestra una respuesta con un aparente Hill coeficiente de 6,3 con respecto a la glucosa. La respuesta de sensibilidad GS resultó ser altamente dependientes de la GP-una concentración. Este resultado se parece estar de acuerdo con un reciente estudio que muestra que la síntesis de glucógeno hepático y glucógeno sintasa actividad es muy sensible a la actividad de la fosforilasa [36]. Debido a la fuerte vinculante entre GP y GS-a la fosfatasa, la SG se activa sólo cuando el médico de cabecera-a los niveles de caída por debajo del 1%. Esta conmutación inversa entre la inactivación de los GP de GS y la activación se produce a una concentración de glucosa de ~ 10 mM. Este resultado está de acuerdo con la observación experimental que se activa una vez GS GP-a la inhibición de la fosfatasa GS se convierte en insignificante, y este cambio de actividad se produce después de las comidas, cuando la concentración de glucosa sube por encima de 10 mM [10, 37]. El análisis de sensibilidad del conjunto de parámetros se indica que el fraccional modificaciones de GS y GP para cambiar los niveles de glucosa en pantalla-como los productos (Tabla 1]. Se observó que la sensibilidad de la SG respuesta es siempre mayor que la de GP en el hígado, independientemente del rango considerado para el conjunto de parámetros. La simulación de las curvas de dosis-respuesta para la activación fraccional de GP y GS-a-a en varias concentraciones de cAMP también muestran una respuesta ultrasensibles. El umbral de concentración de cAMP necesaria para activar inactivar GP y GS es mayor en el hígado (~ 1 nM) que en el músculo (~ 0,01 nM). La curva dosis-respuesta para fraccional modificación de las enzimas con respecto a la glucosa-6-fosfato demuestra que la conmutación entre GP y GS se produce a 20 μ M μ M con una respuesta ultrasensibles (Fig. 3C]. Nuestro resultado es coherente con las observaciones anteriores que muestran una correlación inversa entre la actividad de la GP-a y la concentración de glucosa-6-fosfato [33]. Del mismo modo, existe una correlación directa entre la SG-a los niveles y de la glucosa-6-fosfato concentración. El umbral de activación de la sintetasa de glucógeno fosforilasa y se muestra explícitamente en la Fig. 3D trazando la fracción activa de la sintetasa activa en contra de la fracción de fosforilasa. GS se activa sólo cuando se GP mayoría inactivos, lo que demuestra la relación inversa entre la actividad de las dos enzimas.

La inhibición de la fosfatasa GS por GP-a depende de la concentración de glucógeno en el hígado y se ha demostrado que una mínima concentración de glucógeno es esencial para esta inhibición [38, 39]. Para simular ayunas o agotamiento de glucógeno en el hígado estado, el estado de equilibrio análisis se repitió con la constante de inhibición de la GP-a reducirse. Los resultados simulados (Fig 4] muestran que, en una disminución de 1.000 veces (Kd valor de 2 μ M μ M) en la inhibición de fosfatasa por GS GP-a, el hígado puede tener cantidades apreciables (alrededor del 50%) de los dos GP-a Y SG-a en el 4 y el 9 de mM glucosa. Este resultado está de acuerdo con la observación experimental informó por Massillon et al. [38]. Observamos que esta disminución de la pendiente de la curva de respuesta GS se debe a la reducción en la inhibición de fosfatasa GP-a. Una disminución de similar magnitud en la ultrasensitivity de la SG respuesta se observó con respecto a AMPc y la glucosa-6-fosfato (ver Fig. 4B y 4C]. Además, el trazado de la fracción activa de los GP en función de la fracción de activos GS demuestra la ausencia de reciprocidad en la regulación alimentados estado (Fig. 4D].

El porcentaje exacto de reducción en la inhibición de fosfatasa por GS GP-a se desconoce. Cuando el hígado sufre un cambio de metabolismo completamente alimentados estado de hambre, la inhibición de la fosfatasa GS puede variar en una amplia gama. Esto fue simulado mediante el cambio de la constante de inhibición (Kd), de la fosfatasa GS de 0,002 μ M μ M a un valor muy alto para representar Kd no la inhibición. Estos resultados se muestran en la Fig. 5 como una parcela de la fracción activa de los GP en contra de la fracción activa de la SG en diferentes inhibidor constantes. En la total ausencia de inhibición, GS y GP existen en el 100% afirma que indica una activa inútil ciclo (curva de 'g' Fig. 5]. En este estado, las células no se acumulan glucógeno debido a la continua glucogenolisis por GP-a. En el estado alimentado, es decir, en presencia de cantidades apreciables de glucógeno en el hígado, la inhibición de la fosfatasa de la SG-a GP es alta y la reciprocidad de regulación GP y GS actividad se observa (curva a, Fig. 5]. Diferentes proporciones de las fracciones activas de GP y GS-a-a pueden coexistir cuando las condiciones cambian de estado alimenta a los hambrientos, en cifras netas, debido a las diversas concentraciones de glucógeno en el hígado (curvas bf, Fig. 5].

Discusión

La coordinación de la regulación de la glucogenolisis y glucogénesis en el hígado y el músculo esquelético depende de una red de interacción y de las enzimas efectores que determinan la activación de fraccional GP y GS [3 - 6, 9 - 12]. En el presente trabajo, las cascadas que participan en la regulación de la síntesis y degradación del glucógeno se analizaron en el estado de equilibrio para obtener una idea de la concepción inherente principio de la reglamentación cascadas existentes en el músculo y el hígado. El uso de los datos experimentales de la literatura y la tasa de Michaelis-Menten constantes, los resultados de la simulación reveló que, en el músculo, la respuesta del GP de cAMP de entrada es más altamente sensible ( ~ 34) que el de SG ( ~ 6,5), mientras que en el hígado, la SG sensibilidad a la glucosa ( ~ 13,6) y cAMP ( ~ 6.8) son elevados en comparación con la de GP ( ~ 6,3 de la glucosa y ~ 3,2 por AMPc). El análisis de sensibilidad indicó que este diferencial de rendimiento de GS y GP en el hígado y el músculo se debe a la presencia de un distintivo diseño de reglamentación y no a la selección de un conjunto de parámetros. CAPK-activado inhibidor-1 inhibe la PP1, que es una de las principales dephosphorylating enzima en el músculo, mientras que GP-GS inhibe la fosfatasa en el hígado, lo que representa el diseño de este distintivo. Los resultados de la simulación indican que la respuesta de la SG sensibilidad con respecto a la glucosa y cAMP depende en gran medida del GP de concentración en el hígado. Del mismo modo, la sensibilidad de la PK, GP y GS respuestas dependen de la concentración de inhibidor-1 en el músculo. La respuesta ultrasensibles de estas enzimas pueden ser atribuidos al conocido sistema de mecanismos a nivel, es decir, debido a múltiples ultrasensitivity cAMP, inhibidor ultrasensitivity debido a inhibidor de la fosfatasa y cero para los efectos debidos a la relación piramidal en el componente de las concentraciones de la enzima. Sin embargo, la importancia de este cambio-como respuesta de los GP en los músculos y el hígado en la SG no está claro. Cabe afirmar que la ruptura del glucógeno en el músculo tiene que ser sensible a la segunda mensajero cAMP a fin de satisfacer la necesidad urgente de la glucosa durante el ejercicio o huir de la lucha y de respuesta. Del mismo modo, la síntesis de glucógeno en el hígado tiene que ser sensible a la concentración de glucosa en la sangre, de modo que puede comenzar GS sintetizar glucógeno siempre que la concentración de glucosa en la sangre aumenta más allá de un nivel tóxico.

En el músculo, la respuesta ultrasensibles de GP puede atribuirse directamente a la presencia de efectos de orden cero (GP concentración sobre ~ 70 μ M μ M), y agravado por el inhibidor de ultrasensitivity impartidas por inhibidor-1. Ese efecto directo no se observa en el cuadro de servicios generales, debido a su mínimo de cero para efectos (GS concentración sobre μ M ~ 3 μ M). El principal estímulo, cAMP, no sólo aumenta la fosforilación de PK, GP y GS, pero también indirectamente a través de la disminución de sus dephosphorylation inhibidor-1. En el hígado, la respuesta ultrasensibles de GS se puede atribuir principalmente a la causada por ultrasensitivity inhibidor de la GP en la SG modificación ciclo. En este caso, el cero para efecto realmente reside en el GP de cascada, que se transmite a la SG ciclo mediante la inhibición de la reacción dephosphorylation. Además, el efecto estimulante de la glucosa en dephosphorylation de GP-a, el efecto inhibidor de la glucosa-6-fosfato en la fosforilación de GP y GS-b-a, y la estimulación de la SG dephosphorylation por la glucosa-6-fosfato, aumentar la sensibilidad De la SG. Así, el ultrasensitivity de GS en el hígado es provocada por la acción combinada de los múltiples efectos de cAMP, la inhibición de la fosfatasa GS GP por activa y la influencia de la glucosa y la glucosa-6-fosfato concentración.

Es de señalar que, simultáneamente, activación y desactivación de GP y GS, respectivamente, en los músculos y el hígado resultados en la regulación recíproca de estas enzimas por el principal estímulo. Esta regulación recíproca, aunque idénticos en todos los tejidos, aún distintivo imparte una estrategia de adaptación en diferentes tipos de células, debido a las diferencias sutiles en la red. Por ejemplo, la inhibición de la fosfatasa GS por GP en el hígado puede afectar a la regulación de reciprocidad en la ausencia de glucógeno hepático (es decir, el estado de hambre), mientras que en el músculo recíproco reglamento no puede verse comprometida debido a un inhibidor independiente-1. Nuestra simulación del sistema de glucógeno cascada bajo condición de hambre demuestra que la sensibilidad de la SG reduce debido a la reducción de inhibidor ultrasensitivity causados por GP. El porcentaje de reducción en la inhibición de la fosfatasa GS es desconocida. Es posible que cuando el hígado sufre una transición de estado alimenta a los hambrientos, GS fosfatasa pueden experimentar diversos grados de inhibición por GP. Esto resulta en un cambio de un ciclo muy inútil sin inhibición recíproca a la reglamentación en el estado alimentado. Esto causa SG a ser siempre activo, mientras que GP es activa sólo en el estado de hambre en presencia de glucosa elevados (ver Fig. 5].

Hallenbeck y Walsh [40] observó que, si la cantidad de fosforilasa secuestrado en el compartimiento de partículas de glucógeno muscular conejo se tiene en cuenta, entonces la concentración local de GP puede ser muy alta (hasta 2-5 mM). Además, la interacción con el GP de partículas de glucógeno se sabe inferior a la Michaelis-Menten constantes de PK y PP1, promoviendo de este modo la orden cero efectos más [29, 25]. Teniendo en cuenta estas observaciones, y Meinke Edstrom [25] estima que una aparente Hill coeficiente de 51 para la activación del 3,5 mM fosforilasa. Nuestros resultados muestran que la simulación en el 3,5 mM fosforilasa el sistema puede mostrar una respuesta muy ultrasensibles con un aparente Hill coeficiente tan alto como 200 (resultados no presentados). Esta aparente Hill coeficiente de valor es mucho más alto que cualquier sistema conocido o cualquier ultrasensibles de la cooperativa enzimas. Aunque la utilidad de tal respuesta muy sensible in vivo no está clara en la actualidad, diversas observaciones indican que la enzima de la cascada de multi-sistema tiene el potencial de exposición de mayor sensibilidad.

Señalización por hormonas como el glucagón y la epinefrina es conocido que trate de obtener respuestas en una fracción de segundo, la incorporación de la amplificación de la señal de entrada y el aumento de la sensibilidad a la allosteric efectores [2, 3, 27, 41]. También se ha demostrado, en la contracción de los músculos en reposo, que GP-b se convierte en GP-a dentro de un segundo seguido por el inicio inmediato de las glucogenolisis [3]. Esas respuestas rápidas y sensibles se sabe que el comportamiento característico de la enzima cascadas con aumento progresivo de la concentración de enzima en la cascada [2]. Este efecto también puede ser provocada por la acción de oponerse a la misma efector en la modificación de las enzimas y demodifying [18] y la presencia de un inhibidor de stoichiometric [20]. Parece que los sistemas vivos ultrasensibles utilizar estos mecanismos de regulación para coordinar las múltiples señales de entrada, muestran variadas respuestas a diferentes señales, respuestas rápidas exposición a un estímulo invariablemente baja concentración [2, 3, 27] y, lo que es más importante, el uso insignificante cantidad de energía celular [42, 43].

Teórica de la cuantificación de un sistema de regulación tal como se presenta aquí revela visión de nivel de sistema propiedades. Ultrasensitivity, amplificación de la señal, la flexibilidad en el funcionamiento y la señal de la integración a nivel del sistema son todas las propiedades, y no son aparentes en componentes aislados. Estas propiedades pueden ser estudiadas mediante la conexión de diferentes unidades funcionales y la definición de la relación cuantitativa entre los diferentes componentes de un sistema. Nuestros resultados de la simulación reveló que el cambio de médico de cabecera como las respuestas y la SG en el hígado y el músculo son comparables con la de la cascada MAPK en ovocitos de Xenopus [21]. At the metabolic level, GP and GS are also regulated by calcium levels and feedback loops constituted by effectors such as ATP, AMP, cAMP, glucose and glycogen [ 3 - 6 , 9 - 12 ]. Furthermore, GS and PK are known to have multiple phosphorylation sites [ 5 , 9 ]. Regulatory networks made up of multiple feedback loops and multiple phosphorylation cycles, as seen in the activation of maturation-promoting factor and the MAP kinase cascade during oocyte maturation [ 44 , 45 ], can yield multiple steady state responses. Although we have not incorporated the overall regulatory network, our analysis suggests that the enhanced sensitivity observed in the glycogen cascade system may act as a selective pressure in evolution favoring tissue-specific adaptive strategies and compartmental regulatory modules.

The abbreviations used are

GP: Glycogen Phosphorylase;

GS: Glycogen Synthase;

cAMP: cyclic AMP;

PP1: Phosphoprotein Phosphatase-1;

PK: Phosphorylase Kinase;

CAPK: cAMP dependent Protein Kinase;

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

VKM and KVV conceived and designed the experiments. VKM performed the experiments. VKM and KVV analyzed the data. VKM and KVV conceptualized the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript.

Appendix

The following equations were solved in Matlab (The Mathworks Inc. USA) to obtain dose-response curves for fractional steady state activation of component enzymes at various cAMP levels. The steepness of these stimulus dose-response curves can be approximated using the Hill equation. The global output response (fractional modification of phosphorylase and glycogen synthase) can then be quantified in terms of apparent Hill coefficients and half saturation constants, with respect to the input stimulus concentration. Here, the half saturation constant is the amount of input stimulus required for 50% fractional modification of the corresponding protein kinase. Thus, the half saturation constant indicates a mid-point on the unmodified to modified kinase transition curve. The apparent Hill coefficient can also be calculated by estimating the primary input concentration required for 10% to 90% modification of the target enzyme by using the following equation:

where I 0.1 and I 0.9 are the input concentrations required for 10% to 90% modification of target enzyme and is the apparent Hill coefficient. In the following section we detail the solution strategy employed in simulations.

The following equations are derived for the glycogen cascade system schematically shown in Fig 1 .

(I) Activation of cAMP dependent protein kinase (CAPK) by cAMP

Two cAMP molecules bind to each R subunit of CAPK (R 2 C 2 ) through an infinitely cooperative mechanism and this results in stepwise dissociation of the catalytic subunit [ 17 ]

where K 11 and K 22 are the dissociation constants and C is a catalytic subunit.

Mass balance on catalytic subunit yields

[ C t ] = 2 [ R 2 C 2 ] + [ R 2 C ( cAMP ) 2 ] + [ C ]     [A6]

Using equations [A6] and [A7], we obtain a cubic equation for the active catalytic subunit C .

where [R 2 C 2 ] t denotes total CAPK, C is the catalytic subunit, [cAMP] is total cAMP concentration. A valid root was obtained as total catalytic subunit concentration of CAPK using Eq. A8, and is taken to be same in both liver and muscle.

In the current work, the following cascade-connecting complexes were neglected in the total interconvertable balance: complexes between CAPK catalytic subunits and inhibitor-1, phosphorylase kinase and glycogen synthase in the CAPK balance; inhibitor-1 complex with PP1 in the inhibitor-1 balance; PP1 complexes with phosphorylase kinase, phosphorylase and synthase in the PP1 balance; phosphorylase kinase complexes with phosphorylase and synthase in the phosphorylase kinase balance; liver glycogen phosphorylase complex with PP1 in the phosphorylase balance. We have verified the extent of formation of these complexes and they were found to be negligible compared to the corresponding total interconvertable enzymes. This assumption is valid when the dose-response curve of each target enzyme exceeds 90% phosphorylation [ 23 ].

(II) Operating equations for covalent modification cycles [ 14 ] involved in regulation of glycogen synthesis and breakdown in the muscle
(III) Operating equations for covalent modification cycles involved in regulation of glycogen synthesis and breakdown in liver

In this case, glucose is considered to be the primary input to the enzyme cascades. Glucose-6-phosphate levels were estimated from various concentration of glucose using the following relationship:

where g6pt represents physiological (maximum) concentration of glucose-6-phosphate, g6p is the concentration of glucose-6-phosphate in relation to the concentration of glucose and Kg is an activation constant. Glucose concentration regulates intracellular cAMP levels through hormonal signals such as glucagon. The inverse relationship between glucose and cAMP levels is incorporated by the following equation:

where cAMPt represents the physiological (maximum) concentration of cyclic AMP, cAMP is the concentration of cyclic AMP in relation to the concentration of glucose and Ki represents the inhibitor constant. The superscript 2 and the parameters including Ki , kg and kg2 are suitably chosen so that glucose-6-phosphate and cAMP are relatively in the physiological range. cAMP is further taken as an input to CAPK activation. The analytic expression for this interaction is the same as given in Eq. A8.

Sensitivity analysis

The above parameter set was used for simulating the dose-response curves of the glycogen cascade system. To assess the sensitivity to variation in individual parameters, each parameter was varied over a 10-fold change while holding all other parameters constant. The response sensitivity is quantified using a Hill coefficient and is given in Table 1 . The results indicate that at different parameter sets, the output responses of GP and GS are switch-like and display different degrees of signal amplification.

Agradecimientos

KVV acknowledges financial support from the Swarnajayanti fellowship, Department of Science and Technology, India.