Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2005; 3: 4-4 (más artículos en esta revista)

La rápida construcción de una vacuna de células dendríticas a través de la perturbación física y la apoptosis de células T malignas de carga

BioMed Central
Maria Salskov-Iversen (maria@immunology.au.dk) [1], Carole L Berger (carole.berger @ yale.edu) [2], Richard L Edelson (Redeloson@yale.edu) [2]
[1] Departamento de Inmunología de la Universidad de AArhus, Aarhus, Dinamarca
[2] Departamento de Dermatología, Yale University, School of Medicine, New Haven, CT, EE.UU.

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Resumen

Hemos demostrado que la adhesión de monocitos y la liberación de una de sus unidades de superficie de plástico en la diferenciación de células dendríticas inmaduras (DC), que puede madurar más incubación durante la noche a la mañana en la presencia de apoptosis de las células T malignas. Sobre la base de estos resultados, hemos tratado de elaborar un clínicamente, práctico, rápido medio para la producción DC cargados de células malignas.

Una cosecha que contiene la leukapheresis clonal, leucémicas malignas expansión de los linfocitos T CD4 + se obtuvo de la sangre de los pacientes con linfoma cutáneo de células T (LTC). LTC células fueron purificadas con un talón magnetica CD3-CD3 compromiso de la columna, donde dictó la apoptosis de células T malignas. La fracción de los monocitos se activan simultáneamente por la columna de paso, volver a añadirse a la LTC células apoptóticas y co-cultivadas de la noche a la mañana. LTC apoptosis de las células, DC diferenciación y apoptosis de células T malignas ingestión se mide por inmunomarcación.

Los resultados demuestran que, como monocitos pasado por la columna matriz, que se convirtió en activado y diferenciado en semi-maduros DC expresando aumentado significativamente los niveles de la clase II, CD83 y CD86 (marcadores asociados a la maduración DC) y la reducción de la expresión de marcadores de monocitos CD14 y CD36 . Apoptosis de células T malignas se tragó ávidamente por la fagocitosis en la transición DC. La adición de citoquinas de apoyo mejorado aún más la serie de DC que figura apoptosis de células T malignas.

Funcional estudios confirmaron que la columna pasajes de clase II DC aumento de la expresión tal y como se muestra de forma significativa el aumento de la estimulación de leucocitos en la mezcla de la cultura en comparación con el control monocitos. Además, DC cargadas con células apoptóticas LTC estimulado un aumento en el porcentaje y número absoluto de las células T CD8 en comparación con el co-cultivo con no cargado DC. Después de las células T CD8 fueron estimulados por DC cargados de células malignas, que el aumento de la apoptosis mediada por LTC residual de las células y la secreción de TNF-α que indica el desarrollo de una mayor función citolítica.

Se presenta un sencillo paso de un procedimiento donde maduración DC apoptosis malignos contienen células T se pueden preparar rápidamente para su posible uso en la vacuna de inmunoterapia. El fácil acceso a la DC y en apoptosis gracias a este sistema permitirá la extensión a otros tumores malignos a través de la adición de una variedad de tumor de células apoptóticas y maduración estímulos.

Antecedentes

Linfoma cutáneo de células T (LTC) es una maligna expansión de la madurez, un clon de células T CD4 con una afinidad para la localización epidérmica [1]. El tumor de células de la epidermis proliferan en torno a una central de las células de Langerhans (LC), y estudios previos han demostrado que los inmaduros DC desempeñar un papel crucial en el ciclo de vida de la malignidad [2]. Las etapas finales de la LTC se caracteriza por la propagación sistémica, la inmunosupresión y un mal pronóstico. A pesar de la malignidad de la dependencia de los inmaduros DC para apoyar proliferativa, DC inmunoterapia ha sido en beneficio de esta enfermedad [3, 4].

Dos estrategias para el tratamiento de la LTC, fotoféresis extracorpórea (ECP) y transimmunization, se han utilizado con éxito para el tratamiento de esta neoplasia agresiva [4, 5]. El principio básico de estos tratamientos es extracorpórea establecimiento y re-infusión de células T malignas cargadas-DC [6]. En ambos tratamientos, un leukapheresis producto es tratado con la droga 8-methoxypsoralen (8-MOP) y pasó a través de un plástico de la luz ultravioleta (UVA), la exposición placa. El 8-MOP intercalates en el ADN de células nucleadas y es transversal vinculados a bases de pirimidina adyacentes luz de activación por rayos UVA. El vínculo entre la formación es un defecto letal y la reproducción de las células apoptóticas son prestados. Al mismo tiempo, se activan los monocitos y la liberación por la adhesión de la placa de la superficie de exposición de plástico y comenzar a transición en inmaduros DC [6]. En la ECP tratamiento, tanto LTC células apoptóticas y de la transición de DC son re-infunde en el paciente de inmediato y asociación de la DC y la apoptosis de células tumorales in vivo se produce ineficiente.

Transimmunization El procedimiento fue ideado como una mayor eficacia en la modificación de ECP y el nombre para designar el traslado de los antígenos de tumor competentes células presentadoras de antígenos (APC), que podría mostrar la dotación completa de los antígenos tumorales en el contexto de co-estimulantes y moléculas de adhesión. En el transimmunization procedimiento, la apoptosis de células T malignas de la transición y la DC son co-cultivadas de la noche a la mañana que los efectos de adopción de la apoptosis de las células fagocíticas ávidamente inmaduros DC [6]. Los monocitos activados producen citoquinas que integran los componentes de los monocitos acondicionado con lo que los medios de comunicación, potenciando la maduración de las células malignas T-cargado DC [3]. La diferenciación de DC son re-infundido el día siguiente al paciente, donde puede más maduros y tener la posibilidad de migrar a los ganglios linfáticos y de inducir inmunidad anti-tumor.

En el actual estudio, que trata de explorar el papel de la perturbación física de los monocitos a la DC transición mediante el examen de si el paso a través de una separación de la columna que contiene una matriz porosa es suficiente para inducir la diferenciación de la noche a la mañana DC monocitos. [7] Los estudios sugieren que la trans-migración de los monocitos que pasa por los pequeños espacios de una capa de células endoteliales se activan y asumir el fenotipo de inmaduros DC. Este monocitos-to-DC transición puede ser preservado por la fagocitosis de partículas de material, como zymosan [7]. También hemos demostrado que CD3 vinculantes hace antígeno-experimentado LTC proliferan las células apoptóticas [2]. Por lo tanto, trató de aprovechar las observaciones de la doble función de la estimulación física en la DC y la rápida maduración de apoptosis mediada por la muerte de las células CD3 vinculantes para desarrollar en un día a la práctica clínica de vacunas. Se demuestra que un simple paso de un procedimiento utilizando CD3-magnética cuentas que preste la apoptosis de células T malignas, y la separación de la columna matriz simultáneamente activar monocitos resultados en la noche a la mañana la producción de apoptosis de células de carga DC. Estos inmaduros DC generados en la falta de citoquinas podría ser impulsado para diferenciar aún más cuando se agregaron citoquinas exógenas. La evaluación funcional de las células T malignas cargadas DC, desarrollado por esta metodología, demostró una significativa capacidad de estimulantes en la mezcla de la cultura de leucocitos y la capacidad para promover la expansión de células T CD8 y capacidad citolítica.

Por lo tanto, este enfoque de la producción de células malignas cargadas de CC en un plazo rápido sin extensas de cultivo de células, factores exógenos o de aislamiento y manipulación de células. Este método puede proporcionar un medio práctico clínicamente para la producción de inmunógenos DC vacuna terapéutica para el cáncer.

Materiales y métodos
Población de pacientes

Leukapheresis terapéuticas se obtuvieron a partir del 7 de LTC pacientes (de acuerdo con las directrices de la comisión de investigación de Yale humanos). Todos los pacientes con enfermedad avanzada clonal de células T CD4 + poblaciones presentes en la circulación periférica que determine immunophenotyping con anticuerpos a la región clonotypic variable específica de la familia del receptor de la célula T (TCR) o reacción en cadena de polimerasa para detectar reordenamientos de la versión beta o gamma Cadena de la TCR. Todos los pacientes fueron sometidos a tratamiento estándar con ECP.

El aislamiento de células

Células mononucleares (MNC), se aislaron mediante centrifugación en un gradiente de ficoll-hypaque seguido de dos lavados en RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD), que contiene un 10% de suero AB y 2 mM EDTA. MNC (2 × 10 7) se incubaron con 40 μ l Macs α-CD3 humanos microBeads (Miltenyi Bioteck, Auburn CA) raíz de la instrucciones del fabricante. Las células fueron separadas por el paso a través de una columna de separación Macs (Miltenyi Bioteck) que consiste en una matriz de hierro magnetizado. CD3 positivas y negativas de las células fueron contados, re-mezcladas y se incubaron durante la noche. Como control, MNC (2 × 10 7) también fueron incubadas con 40 μ l Macs α-CD4 microBeads humanos. Después del tratamiento, las células fueron incubadas en 3 ml RPMI 1640 que contiene 15% AB 15% suero y plasma autólogo en un pozo de un 12 y placa de cultivo de tejidos (Falcon). En algunos experimentos de la mitad de las partes de las células obtenidas después de la columna CD3 paso la noche a la mañana se incubaron en RPMI con 10% FCS (Gibco), en presencia de las citocinas GM-CSF 800 U / ml y IL4 1000 U / ml (R & D Systems, Minneapolis, MN). Día 0 células basales fueron inmediatamente eliminados por inmunoticción mientras que el día 1 se incubaron células de la noche a la mañana.

Immunophenotyping

Con el fin de supervisar DC diferenciación, las células se tiñeron por inmunofluorescencia de dos colores con un panel de anticuerpos a los monocitos, DC, y en apoptosis. Células (1 × 10 6) se incubaron con 10-20 μ l de fluorocrome anticuerpo monoclonal conjugado durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Los anticuerpos fueron directamente conjugado con fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE), e incluye a: CD14-FITC (monocitos) + CD86-PE (co-estimuladora molécula altamente expresado en DC); HLA-DR-FITC (anti-MHC clase II Molécula) y CD83-PE (DC maduración marcador), y su isotipo controles pareados (Beckman Coulter Immuno-Tech, Hialeah, FL). Las células fueron lavadas una vez y suspendida en PBS y leer en un flujo XL cytometer (Beckman Coulter) dentro de las 24 horas.

Combinado membrana citoplasmática y la tinción se realizó según las instrucciones del fabricante (Intraprep kit, Beckman Coulter). Antibody combinaciones incluyen: membrana CD36-FITC (receptor de las células apoptóticas) + citoplásmica CD83 PE; DR-FITC + citoplásmica CD83-PE, y los controles de isotipo (Beckman Coulter). Para detectar en apoptosis, linfocitos se tiñeron con: membrana HLA-DR-FITC (MHC clase II) + citoplásmica Apo2.7-PE (apoptosis), y los controles de isotipo. Los datos fueron analizados utilizando el software CXP (Beckman Coulter).

Microscopía Confocal

Las células fueron teñidas con doble membrana HLA-DR-FITC + citoplásmica Apo2.7-PE siguiente las instrucciones del fabricante para la combinación y la membrana citoplasmática de tinción (véase immunophenotyping). Además, las células fueron teñidas con doble citoplásmica LAMP-2 FITC (lisosomales marcador, Investigación Diagnóstico) y HLA-DR-PE. Las células se prepararon para microscopía siguiendo las instrucciones de sondas moleculares "Slow Fade Light" kit anti-fader (Molecular Probes Inc, Eugene, OR). Las muestras se mantuvieron en la oscuridad a 4 ° hasta la microscopía se realizó en un microscopio confocal Zeiss.

Mezcla de ensayo de la cultura de leucocitos

La cultura mixta de leucocitos ensayo se realizó mediante el aislamiento de control de leucocitos normales de dos donantes. Control de las células T CD4 se purificaron con perlas magnéticas y de la columna de efluentes que contienen monocitos y células B se γ-irradiados para prevenir la diferenciación y la utiliza como una fuente de estimuladores. DC transición de LTC pacientes se obtuvo un día antes del control normal de las células cultivadas y de la noche a la mañana sin citoquinas, γ-irradiados y utilizados como estimulantes para el control de los linfocitos. Las células se ajustaron a 4 × 10 6 / ml y 50 μ l de las células y la respuesta de 50 μ l de estimular las células cultivadas en co-ronda final microtiter pozos con la adición de 100 μ l de RPMI 1640 que contiene 15% AB 15% suero y plasma autólogo Durante 6 días a 37 º C en el 5% de la atmósfera de CO 2. Los pozos fueron pulsados con 1 μ Ci así 3 [H]-timidina 16 horas antes de la cosecha (cosechadora de doctorado, Cambridge Tech., Cambridge, MA). La incorporación de los isótopos se evaluó en un líquido scintillation counter.

De células T CD8 de purificación y expansión

CD8 células T CD8 se purificaron con piedras-magnética (≥ 96% de pureza) y suspendido en RPMI 1640/15% suero autólogo y IL2, y añadió que a la DC se había eluida de la columna LTC mismo paciente. Las células fueron cultivadas compañeros de la noche a la mañana con 1,1 × 10 6 células T CD8 y CD3 y añadido a la pestaña prestados o células apoptóticas LTC LTC células viables (4 × 10 6 / así). Después de la noche a la mañana la cultura, las células fueron cosechadas, contados, y immunophenotyped de marcadores de células T (CD3, CD4, CD8) y la apoptosis (Apo2.7).

De necrosis tumoral-α (TNF-α) ELISA

La producción de TNF-α se midió en un ensayo ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) esencialmente, tal como se describe por el fabricante.

Evaluación estadística

La expresión de marcadores DC MLC y la respuesta fue evaluada estadísticamente por el test de la t de estudiante o si los datos no se distribuyen normalmente el de Mann-Whitney Rank Sum ensayos utilizando el programa de análisis Sigma Stat.

Resultados
Paso de los monocitos a través de una columna de separación induce a los monocitos DC transición

Monocitos se obtuvieron de un leukapheresis cosecha realizada terapéuticamente sobre LTC pacientes y se cultivaron la noche a la mañana, con y sin pasaje a través de una columna de separación magnética talón. En la diferenciación de los monocitos semi-maduros DC fue supervisado por 2-color de inmunofluorescencia. En un experimento representante, (Fig. 1, con acceso sobre la población como los monocitos identificado por la co-expresión de CD14 y CD86), la pérdida de la membrana de los monocitos marcador CD14 es revelada por una disminución en la media de intensidad de fluorescencia (IMF) de la CD14 Fluorocromo. CD14 expresión disminuido como el grado de manipulación de las células primarias aumentó de aislamiento (Fig. 1a] a la simple cultura de la noche a la mañana el producto leukapheresis (Fig. 1b], en comparación con la adición a la diferenciación de las células DC de la LTC que fueron seleccionadas por la CD4, el anticuerpo, (Fig. 1c] a la reducción máxima expresión CD14 en monocitos encuentra activada la transición cuando la DC se cultivaron con LTC células apoptóticas prestados por anticuerpos CD3 (Fig. 1d]. En total, (Fig. 1e] la expresión de CD14 se redujo en un 54%, pasando de una media de la intensidad de fluorescencia (MFI), de 13 en primaria aislamiento a 5,89, cuando la columna separados monocitos fueron co-cultivadas con el CD3 tratados con células apoptóticas LTC . Como la diferenciación de los monocitos DC perdido marcador, un aumento de 3 veces en la expresión de CD86, una co-molécula estimulante, se encontró que van desde una IFM de 1,98 en el Día de 0 a 6,4 tras el paso por el núcleo magnético-CD3 y la noche a la mañana la columna de incubación (Fig. 1f].

DC transición aumentar su expresión de la maduración marcador, CD83

En la Fig. 2A y 2B, la diferenciación de los monocitos en semi-maduros DC se demuestra por un incremento en el porcentaje de células que muestran la reducción de la intensidad de fluorescencia de membrana CD36 (receptor para los efectos de adopción de la apoptosis, un marcador que se pierde como DC maduras) y el aumento de expresión de CD83 citoplásmico (DC maduración marcador). Fig. 2A-a, demuestra que sólo el 4% de las células co-expresar la membrana citoplasmática CD83 y CD36 en el aislamiento primario. Cuando las células fueron cultivadas de la noche a la mañana, el porcentaje de células que expresan CD36/CD83 co-como el aumento del nivel de manipulación aumentó de 25% en la cultura de la noche a la mañana leukapheresis (Fig. 2A-b] y en las células separadas por un CD4-magnética Talón de control y re-anticuerpo añadido a la columna de efluentes (Fig. 2A-c] a la máxima diferencia de 34% cuando se encontró CD3-apoptóticos tratan LTC células fueron re-activado añadido a la transición DC (Fig. 2A-d]. En la Fig 2A-e, la reducción de CD36 por las IFM se muestra una disminución de un IFM de 34 en primaria aislamiento a 7,7 (77% de reducción) en los monocitos / DC población activa por el paso por la columna de separación y recombinado de la noche a la mañana en la cultura LTC la presencia de células apoptóticas prestados con anticuerpos CD3.

El aumento de la expresión CD83 citoplásmico se muestra en la Fig. 2B. Como se esperaba sólo un pequeño porcentaje de células que expresan el marcador de diferenciación DC, CD83 en el aislamiento primario (0,5%, Fig. 2B-a]. Incubación de la noche a la mañana leukapheresis (Fig 2B-b] aumenta la expresión de CD83 de un título equivalente como expresión CD83 después de detectado el paso a través de un talón CD4-magnética de columna (Fig. 2B-c]. Más de una tercera parte de los monocitos en la transición semi-maduros DC como lo demuestra el incremento en la expresión de CD83 citoplásmico (Fig. 2B-d] que se encuentran separados cuando CD3-LTC células apoptóticas se agregaron a la columna de monocitos activados.

La inducción de la diferenciación y la simultánea DC LTC apoptosis de las células y engulfment

Además la confirmación de una mayor diferenciación de los monocitos a la DC se encontró cuando membrana expresión de clase II (HLA-DR) se midió y hasta de tomar la apoptosis de las células se evaluó LTC. En la figura 3A, el porcentaje de positivos DR-monocitos que contiene la transición en apoptosis fue determinada por la medición de la expresión citoplásmica de los primeros marcadores de apoptosis APO2-PE. El aislamiento primario (Fig. 3A-a], o después de la incubación de la noche a la mañana sin más transformación leukapheresis (Fig. 3A-b], sólo un pequeño porcentaje de la población de monocitos-DC apoptosis material que figura en el citoplasma. CD4 tratos y la columna dañada paso suficiente de células para aumentar el número de células apoptóticas LTC ingeridas por los monocitos activados-DC población (Fig. 3A-c]. Como se ha informado anteriormente [2], CD3 vinculante LTC células prestados a la apoptosis de células T malignas y material de los daños y las células mueren LTC puede ser detectado en el interior de la DC el desarrollo de la población (Fig. 3A-d]. Si bien sólo el 19% de la transición DC se reactiva con DR/APO2-PE, esto probablemente sólo representa un nivel mínimo de células apoptóticas sumido desde la transformación y la degradación de la apoptosis vesículas incubación durante la noche a la mañana podría haber reducido la expresión detectable de APO2-PE positiva Material.

La diferenciación de la población de CC también fue demostrado por el aumento de la expresión de la membrana de las moléculas MHC de clase II. Física manipulación no aumentó clase II expresión de la principal valor obtenido en el aislamiento inicial (Fig. 3B-a], cuando las células se cultivaron leukapheresis noche a la mañana (Fig. 3B-b]. No aumento de la expresión de clase II se observó incluso cuando la columna monocitos activados fueron co-cultivadas de la noche a la mañana con CD4 de las células talón separados LTC (Fig. 3B-c]. Sin embargo, la noche a la mañana además de las células apoptóticas LTC, obtenidas a partir de CD3 vinculante, a la transición DC aumento de la expresión de clase II de 55% (Día 0, Fig. 3B-a] al 72% (Fig. 3B-d].

Evaluación estadística de la mayor expresión de marcadores de diferenciación DC

Se evaluó el aumento global de los marcadores de la diferenciación de los monocitos DC en leucocitos obtenidos de siete pacientes LTC. Aunque sustancial variación en la expresión de varios antígenos impidió el análisis, los resultados mostraron que, en general, la expresión de antígenos MHC clase II fue significativamente hasta reguladas en la diferenciación de DC obtenidos después de la columna con el paso (P ≤ 0.005) y sin (P ≤ 0.002) la adición LTC apoptosis de las células (Fig. 4a]. Además, CD86 (P ≤ 0,025) fue significativamente mayor expresión cuando LTC células fueron co-cultivadas con columna de la transición DC pasajes cargados de células apoptóticas LTC y CD83 (P ≤ 0.001) fue mayor independientemente de la presencia de células apoptóticas LTC (Fig. 4b y 4c]. Estos resultados confirman que la perturbación física encontradas tras el paso por los pequeños espacios de separación de la columna mejora significativamente la entrada de monocitos en la vía de CC.

Demostración de carga DC con células apoptóticas por microscopía confocal

En la Fig. 5A, LTC células apoptóticas se dictaron con CD3-magnética talón conjugado de anticuerpos (Fig. 5A a-c] o como un control tratados con CD4-magnética talón conjugado de anticuerpos (Fig. 5A d-f], ejecute a través de la separación Columna y co-cultivadas con la diferenciación simultáneamente activado DC. El activan los monocitos / DC población es doble manchadas de manifestaciones de la membrana de clase II (verde) y el marcador temprano de células apoptóticas, intracelular APO-2 (rojo). Representante de clase II-positivas células (fluorescencia verde) se observan en las figuras 5A y 5A-a-c. En la Figura 5A-b, tres células apoptóticas que se dictaron después de CD3 vinculante, se identificaron (flechas blancas) y de material de una de estas células está contenido en una clase II de células positivas (fusión, Fig. 5A-c]. En la Figura 5A-e (CD4-tratamiento), sólo una pequeña cantidad de material de apoptosis se encuentra, y ninguno de este material se asocia con la clase II de células positivas (Fig. 5A-f, fusión).

Para confirmar que las moléculas de clase II co-localizada en compartimentos lisosomales en un patrón que se encuentra en semi-maduros DC [8], las células fueron teñidas con un marcador lisosomal LAMP2 y un anticuerpo a las moléculas MHC de clase II (Fig. 5B]. En la Fig. 5B-a, una célula que ha sido activado por el paso por la columna de separación y co-cultiva la noche a la mañana con LTC células apoptóticas prestados por CD3-magnéticos vinculantes talón teñido con un anti-anticuerpo de la clase II (rojo). En la Fig. 4B-b compartimentos lisosomales se visualiza con un anticuerpo que se une a la membrana lisosomal (LAMP2, verde). La fusión de los 2 fluorocromos (Fig. 5B-c, amarillo) demuestra colocalización de moléculas MHC de clase II en compartimentos lisosomales. Cuando la tinción de clase II se vigila en la columna activan las células de transición que se había co-incubadas con control LTC células CD4-seleccionados por la separación magnética talón (Fig. 5B-d, rojo), la tinción de membrana fuerte se encontró. Lisosomales débil tinción fue localizado debajo de la membrana plasmática (Fig. 5B-e, verde). Cuando las imágenes se fusionaron, las moléculas MHC de clase II no exhibió entrada en el compartimento lisosomal (Fig. 5B-f]. La presencia de las moléculas MHC de clase II en lisosomas es coherente con la diferenciación en semi-maduros DC [8], y sugiere que las moléculas de clase II han emigrado a lisosomales compartimentos donde tendrían la oportunidad de cargar con péptidos derivados de la apoptosis material procesado.

La adición de citoquinas de apoyo aumenta la diferenciación de los monocitos a la DC

Se buscó maximizar la inducción de la maduración DC cargados de apoptosis de células T malignas a través de la adición de citoquinas exógenas que se sabe que son importantes para la diferenciación DC [9]. Para estudiar el efecto de las citoquinas de apoyo sobre el fenotipo de la DC en desarrollo, hemos dividido la columna separados en la mitad de las células y co-incubadas con ellos la noche a la mañana-CD3 talón prestados LTC células apoptóticas con y sin GM-CSF e IL-4.

La adición de citoquinas a la co-cultivaron células apoptóticas LTC y columna activado transición monocitos aumento general de la maduración de la DC. En la Figura 6, el nivel de expresión de CD14 se reduce como se demuestra por un incremento en el CD14 negativo de la población (Puerta AA1) de 4,8% al inicio del estudio (Fig. 6 bis] a un 10% cuando la transición DC se incubaron con células apoptóticas sin citoquinas ( Fig. 6b]. La adición de citoquinas aumento de la pérdida resultante de la expresión CD14 en el 36% de las células CD14-negativos convirtiendo en la noche a la mañana después de la cultura (Fig. 6c]. Como la diferenciación de los monocitos perdido expresión CD14, un incremento en la expresión CD86 se observó. CD86 expresión aumentó de un nivel básico de 61% (Fig. 6d] a más del 80% CD86-positivo DC después de la transición de la columna de separación y co-cultivo con CD3-prestados en apoptosis sin citoquinas (Fig. 6e] o en presencia de Exógenos citoquinas (Fig. 6f].

Citocinas mejorar DC maduración

El porcentaje de semi-maduros diferenciados DC después de la noche a la mañana co-co-la cultura que expresó intracitoplasmática de membrana CD36 y CD83 se vio reforzada por la adición de citoquinas. En la Fig. 7a, en la primaria de aislamiento monocitos expresó niveles intermedios de CD36 y no contenía cytoplamic CD83 (Fig. 7]. Co-expresión de CD36/CD83 (Fig. 7b] se elevó a 50%, después de la noche a la mañana la cultura en la ausencia de citoquinas, en la distinción DC que han pasado por la separación de la columna y se recombinó con CD3 prestados LTC células apoptóticas. Este incremento en la expresión de un receptor de apoptosis puede haberse visto impulsado por la presencia de niveles muy altos de material apoptótico en el co-culturas (Fig. 8]. Además la maduración se observó en presencia de citocinas (Fig. 7c] que conduzca a un 53% de expresión CD36 en la transición de la DC y la identificación de 7% negativas células CD36-CD83 que figura en el citoplasma. El porcentaje de diferenciación de DC que expresaron CD83 citoplásmico pasó del 0% al inicio del estudio (Fig. 7d] a 49% después de la columna de separación y co-incubación con LTC células apoptóticas prestados por CD3-magnéticos vinculantes talón (Fig. 7e] al 59% cuando Citocinas se añadieron a la células cultivadas (Fig. 7f].

Clase II expresión y efectos de adopción de apoptosis material es mayor en presencia de citocinas

La base de referencia expresión de las moléculas MHC de clase II en la membrana celular de monocitos en el aislamiento primario se muestra en la Fig. 8a. Recién aisladas monocitos expresar una reducción de la intensidad de la clase II y la expresión contiene un pequeño porcentaje del material citoplásmico apoptosis. Después de la columna de separación y co-incubación con CD3-magnética talón tratados en apoptosis, la membrana de clase II expresión es mayor (Fig. 8b], y grandes cantidades de material de apoptosis se puede detectar en el citoplasma de la transición DC. Exógenos citoquinas aumentar aún más el porcentaje de la clase II-positivas las células que contienen el material de apoptosis (Fig. 8c]. Por lo tanto, la adición de citoquinas exógenas aumenta tanto la diferenciación de inmaduros DC y de la ingestión de material apoptótico mejorar el rendimiento de la noche a la mañana maduración apoptosis de células T cargado DC.

Análisis funcional de la diferenciación de DC paso obtenido después de la columna

DC obtenido después de la transición de la columna pasaje fueron evaluados por su capacidad de estímulo en MLC (Fig. 9]. Los resultados demuestran que la DC inducida por la columna de paso de los leucocitos de dos controles normales fueron significativamente mejores estimuladores (P ≤ P ≤ 0,034 y 0,036) en el que el MLC monocitos autólogo de células apoptóticas independientemente de la carga. Estos resultados confirman que la columna de activación de los monocitos y de la noche a la mañana la cultura aumenta la expresión de membrana de las moléculas MHC de clase II alloresponsive reconocido por las células T CD4. Por lo tanto, DC cosechados después de la activación física y la cultura de la noche a la mañana podrían ampliar las células T CD4 y potencialmente proporcionar la ayuda necesaria para la concesión de licencias de la lucha contra el tumor de células T CD8 respuestas [10].

Hemos comenzado a investigar la capacidad de la DC cosechados después de la columna de perturbación y apoptosis de células T malignas de carga para inducir y ampliar un anti-tumor de células T CD8 respuesta. En estos estudios iniciales (Fig. 10A], hemos encontrado que el porcentaje de células T CD8 (células T CD8 purificado ≥ 96% positivos, obtenidos de la leukapheresis de un paciente que responda a ECP) aumentó un 38% en presencia de la DC Alimentados LTC células apoptóticas (Fig. 10A-a] en comparación con el porcentaje de células T CD8 encontrado la noche a la mañana después de la incubación con DC expuestos a células viables LTC (Fig. 10A-b]. Además, el número absoluto de las células T CD8 recuperado de la cultura de la diferenciación de la noche a la mañana la columna DC pasajes cargados de apoptosis de células T malignas aumentó un 22% en comparación con el número inicial de las células T CD8 mientras que el número absoluto de las células T CD8 en la actualidad DC y de las culturas viables de células T CD4 disminuyeron en un 12% (Fig. 10A-c]. Por lo tanto, la exposición de las células T CD8 de las células T malignas cargadas DC aumenta el porcentaje y número absoluto de potencial antitumoral de respuesta de células T.

El nivel de la apoptosis cuando encontraron células T CD8 se cultivaron la noche a la mañana con la columna activado DC-cargado con LTC células duplicado (56%, Fig. 10B-a], en comparación con el nivel actual de la apoptosis cuando las células T CD8 se añadieron a la no-cargado DC que se han cultivado con células viables LTC (27%, Fig. 10B-b]. El nivel básico de la apoptosis fue de 24% cuando las células T malignas cargadas DC (Fig. 10B-c], o no cargados DC (Fig. 10B-d] se cultivaron en ausencia de células T CD8. Estos resultados indican que las células residuales LTC puede ser lisadas en la presencia de células T CD8 estimulado con DC que han ingerido apoptosis de células T malignas.

Por último, un mayor apoyo a la afirmación de que las células T CD8 funcionales fueron ampliadas por la noche a la mañana la exposición a la columna-activado DC cargados de células T malignas se obtuvo mediante la evaluación de los niveles de TNF-α encuentra en la cultura sobrenadantes. En la Figura 10B-e, sobrenadantes de las células T CD8 cultivadas de la noche a la mañana sola figura mínimos niveles de TNF-α. CD8 células T estimuladas con columna diferenciada DC cargados de CD3-talón prestados apoptosis de células T malignas o no cargar tanto significativamente (P ≤ 0,001 & P ≤ 0,014) estimuló la liberación de TNF-α. Sin embargo, DC que se había abatido en apoptosis causado la liberación de tres veces más que el TNF-α no cargado DC, lo que indica que la activación de células T CD8 se habían producido y la liberación de una molécula que promueve el tumor cytolysis estuvo presente.

Discusión

Desarrollo de la DC eficaz vacuna contra el cáncer basadas en la tecnología se ha visto limitado por la amplia manipulación y largo período de cultivo in vitro para la generación madura de DC cargado con los antígenos tumorales. Hemos eludido algunas de estas limitaciones a través de la modificación de un éxito de la tecnología que permite la diferenciación de ambos DC monocitos periféricos y simultánea de carga de DC con apoptosis de células T malignas que contiene la dotación completa de los posibles antígenos tumorales [6]. DC son los más potentes de la APC muestra cuando madura altos niveles de co-estimuladora, la adhesión de las moléculas MHC y que se puede presentar péptidos derivados de las células apoptóticas con el sistema inmunológico [9]. Por lo tanto, el desarrollo de un simple medio de la generación rápida de células malignas cargadas de DC podría avanzar en la inmunoterapia de LTC y quizás otros tumores malignos.

La inmunoterapia ha desempeñado un papel importante en el tratamiento de LTC desde la introducción de la ECP por Edelson y colegas, en 1987 [5]. El mecanismo subyacente del éxito de ECP tratamiento fue definido por la demostración de que la introducción simultánea de las células T malignas apoptosis y la diferenciación de los monocitos en DC resultado en los pacientes que recibieron células LTC-cargado DC que tienen la capacidad de presentar antígenos, derivados de la LTC Células, a los linfocitos citotóxicos e iniciar una respuesta inmune hacia la maligno de células T CD4. Estudios anteriores han demostrado que, a pesar de la expansión clonal de las células CD4 + T malignas de las células de la sangre periférica de pacientes LTC, que circulan las poblaciones de células T CD8 que mantienen la capacidad de lyse autólogo de células T malignas [11], se pudo identificar. Un antígeno, que sirvió como inmunógeno reconocido por las células T citotóxicas en LTC está decidido a ser péptidos derivados de la cadena beta del TCR que se muestra en la clonotypically malignas las células T [12, 13]. Por lo tanto, el potencial para el desarrollo de una lucha contra el maligno de células T en la respuesta inmune existe LTC pacientes inmunoterapéuticos y enfoques tendientes a la expansión anti-tumor de las células T CD8 puede ser eficaz en esta enfermedad.

Hemos tratado de aprovechar nuestro conocimiento del mecanismo de ECP para desarrollar más eficiente, rápida, clínicamente medios prácticos para la producción de células T malignas cargadas de DC. In the current study, we demonstrate that DC loaded with apoptotic cells can be produced in one day without extensive manipulation or the use of exogenous cytokines. The use of CD3-antibody to render CTCL cells apoptotic and passage of the treated MNC through the small pores of the iron matrix of a separation column followed by overnight co-incubation resulted in the generation of DC containing material derived from apoptotic CTCL cells. DC differentiation was demonstrated by both the reduction in monocyte markers and the significant increase in class II MHC molecules and co-stimulatory molecules, as well as the increase in CD83, a marker of maturing DC. The internalization of apoptotic blebs was confirmed by localization of the apoptotic material in the cytoplasm, indicating that processing of the apoptotic CTCL-derived material could make peptides available for MHC loading and transport to the cell membrane [ 14 ]. The ability to increase the number of maturing CTCL cell-loaded DC by the addition of exogenous cytokines demonstrates that this technique can produce cell populations that can be manipulated to maximize the production of DC that contain apoptotic material thereby providing access to a spectrum of CTCL cell -derived epitopes, without the requirement for identification or isolation of individual peptides that may be relevant for induction of an anti-CTCL cell immune response.

Furthermore, we show that DC produced in this fashion are effective stimulators of alloproliferation in MLC confirming the significant up-regulation of class II MHC molecules. The malignant T cell loaded DC stimulated CD8 T cell expansion and an increase in apoptotic cell death and the significantly enhanced release of TNF-α. These results indicate that CD8 T cells that have been stimulated by malignant T cell loaded DC, produced by this methodology, may develop the ability to mediate tumor cell cytolysis.

The current studies support our previous results demonstrating that monocyte differentiation into DC could be driven by increasing levels of physical perturbation [ 6 ]. We confirm that leukapheresis alone generates modest monocyte activation and conversion into immature DC that can be enhanced by further manipulation and the addition of apoptotic cells. We also demonstrate that CD3-binding is a potent means of rendering CTCL cells apoptotic [ 2 ] even when the CTCL cells are not cultured but directly isolated from the patients. The current study combines and extends these two previous observations into a format for simple, rapid, clinically practical DC vaccine generation.

Current approaches to DC vaccine technology include peptide pulsing [ 15 ], one week or longer of culture with cytokines [ 16 ], cell fusion with tumor cell partners [ 17 ], and the use of a variety of vectors designed to introduce tumor antigens into the DC [ 18 ]. These methods are generally cumbersome, require extensive in vitro manipulation, and are limited to a small set of known tumor epitopes that may be lost from the patient's tumor, due to immuoselective pressures. Clinical results with these techniques have been variable and seldom provide long-term responses [ 19 ]. In contradistinction, treatment of CTCL patients with ECP has demonstrated an excellent safety profile and in multiple studies in the literature an overall response rate for all stages of the disease of 55.7% and a complete response rate of 17.6% [ 20 ]. Pilot studies using transimmunization to enhance the interaction of apoptotic tumor cells and differentiating DC through simple overnight incubation has demonstrated encouraging results in some patients [ 4 ], that suggest that the therapy retains the safety profile of ECP but may be more potent and effective in a shorter time course.

The technology proposed in this study is likely to be as safe as transimmunization and ECP since it retains the same features of limited cellular manipulation and culture. The replacement of 8-MOP with CD3 antibody should not lead to significant apoptotic cell death and potential tumor lysis syndrome since CD3-binding renders only 30% of the CTCL cell population apoptotic [ 2 ]. Since the CD3 antibody is conjugated to the magnetic beads any free antibody could be removed by a second passage through the magnet prior to re-infusion, thereby, limiting the induction of anti-CD3 antibodies. However, presentation of portions of the CD3 antibody after DC ingestion may provoke an immune response that could prevent further therapy. These potential safety issues will require careful monitoring in future clinical trials.

The current results demonstrate that further development of this technology through passage over a column that permits the one-step apoptotic cell death of CTCL cells, sparing of normal cells and activation of monocytes into the DC pathway may further improve the immunogenicity of the reinfusate. Since only proliferating tumor cells are rendered apoptotic by the CD3 antibody, normal resting lymphocytes will not be impacted which is in contrast to the use of 8-MOP/UVA that targets the DNA of all nucleated cells. This preservation of normal T cells may serve to improve the induction of anti-CTCL immune responses to the re-infused apoptotic cell-loaded DC by preventing damage to by-stander normal cells and precluding their uptake that could lead to tolerance induction [ 21 ] .

Using a peristaltic pump it should be possible to rapidly flow a leukapheresis product through a magnetic separation column. Due to the concentration of MNC obtained with the leukapheresis procedure, high yields of monocytes approaching 10 8 cells could be obtained and activated by this procedure [ 6 ]. Since CTCL patients have large populations of circulating malignant T cells (approaching >90% of the lymphocyte population), CD3-treatment would provide substantial apoptotic tumor cells for DC loading. Because both activated monocytes and apoptotic malignant T cells are obtained individually and can be re-added after treatment, the optimal conditions for apoptotic T cell and DC co-cultivation can be determined empirically. This access to both cell populations would permit the opportunity for loading DC with other tumor antigens, including solid tumors rendered apoptotic by irradiation or other methods.

Other studies have determined that physical separation of DC clusters by simple pipetting [ 22 ] or cell transfer [ 8 , 23 ] is among the most potent means of inducing DC maturation. Furthermore, even semi-mature DC are effective at cross-priming peptide [ 22 ] derived from exogenous material into the class I pathway for presentation to CD8 T cells. Our simple approach to rapid DC vaccine construction takes advantage of both physical stimulation and production of apoptotic material providing access to a broad spectrum of CTCL antigens for cross-priming into the class I pathway.

Further studies to determine the functional ability of the CTCL cell-loaded DC produced by this methodology will be required to confirm the immunogenicity of the proposed vaccine components. We have already demonstrated that DC loaded with apoptotic malignant T cells are potent immunostimulators in mixed leukocyte culture [ 6 ], can provoke positive clinical results in treated patients [ 4 ] and that responsive patients treated by standard ECP develop increased levels of circulating CD8 T cells [ 24 ]. The current results indicate that the development of DC loaded with apoptotic cells for use in immunotherapy can be performed in a rapid, simple, clinically practical manner that provides ready access to the major cell types so that additional strategies to optimize the vaccine components can be implemented and monitored prior to re-infusion.

Conflicto de intereses

Drs Berger, Edelson and Yale University hold patents pertaining to the transimmunization procedure.

Contribuciones de los autores

Maria Salskov-Iverson has performed the majority of the experiments presented in this manuscript and prepared the primary draft of the paper. Drs Berger and Edelson have defined the preliminary observations upon which this manuscript is based and provided intellectual guidance and supervision for the reported work and manuscript.

Agradecimientos

The authors wish to acknowledge research support from: The Danish Cancer Society, MS-I. and the NY Cardiac Association, CLB & RLE