Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 13-13 (más artículos en esta revista)

Soluble HLA medición en la saliva y líquido cefalorraquídeo en los pacientes caucásicos con esclerosis múltiple: un estudio preliminar

BioMed Central
Irena Adamashvili (IAdama@lsuhsc.edu) [1], Alireza Minagar (aminag@lsuhsc.edu) [1], Eduardo González-Toledo (egonz1@lsuhsc.edu) [2], Liubov Featherston (lfeath@lsuhsc.edu) [1], Roger E Kelley (rkelly@lsuhsc.edu) [1]
[1] Departamento de Neurología, Centro de Ciencias de la Salud LSU, 1501 Kings Highway, Shreveport, LA 71130 EE.UU.
[2] Departamento de Radiología, Centro de Ciencias de la Salud LSU, 1501 Kings Highway, Shreveport, LA 71130 EE.UU.

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Medición de la HLA soluble en los fluidos del cuerpo tiene un papel potencial en la evaluación de la actividad de la enfermedad en los desórdenes autoinmunes.

Métodos

Hemos aplicado una fase sólida, vinculada a inmunoensayo enzimático para medir soluble HLA clase I (sHLA-I) y de clase II (sHLA-II) de las moléculas en la saliva y líquido cefalorraquídeo (LCR) en 13 pacientes no tratados con recaída-remisión forma de múltiples Esclerosis (EM). A efectos de comparación, también se estudió la saliva de 53 individuos sanos.

Resultados

La saliva normal de los controles ha sHLA-I detectable en 41 niveles de los 53 individuos estudiados, con valores que van de 9-100 ng / ml (media = 41 ± 2,8 ng / ml). SHLA-yo era indetectable en la saliva, en 11 de 13 pacientes con EM, y en ninguno de los especímenes MCA. Por el contrario, significa sHLA-II concentración en la saliva de pacientes con EM fue significativamente mayor en comparación con los controles (386 ± 52 unidades / ml vs 222 ± 18,4 unidades / ml, t = 8,68, P <0,005). La media MCA sHLA-nivel II (369 ± 16 unidades / ml) fue equivalente a la media sHLA-II concentración se mide en la saliva (media = 386 ± 52 unidades / ml) (P = 0,7). En los pacientes con cerebro de resonancia magnetica (MRI) el aumento de las lesiones (n = 5), más reflexiva de la enfermedad activa, MCA sHLA-II promedio de 356 ± 26 unidades / ml frente a 380 ± 51 en la saliva. Del mismo modo, en pacientes con lesiones no mejorar (n = 8), MCA sHLA-II promedio de 377 ± 18 unidades / ml en comparación con 390 ± 77 unidades / ml en saliva. Así, la media sHLA-II concentración en la saliva y la peste porcina clásica es esencialmente equivalente para los pacientes con EM con o sin aumento de placas.

Conclusión

Nuestros datos sugieren que la medición de HLA solubles en la saliva, específicamente sHLA-II, se correlaciona con el nivel constatado en el MCA. Por lo tanto, si sHLA se correlaciona con la actividad de la enfermedad en la EM, como se ha propuesto, la saliva mediciones proporcionan una correlación no invasivo de medición de la PPC.

Antecedentes

La humanos principales antígenos de histocompatibilidad, HLA, son por lo general de células obligado, pero existen rastros en forma soluble [1 - 3]. Estos soluble HLA (sHLA) moléculas pueden tener una función inmunomoduladora [4 - 6]. El conocido vínculo entre dysequilibrium clase Iy clase II antígenos en la superficie de la célula puede tener importancia fisiopatológica [7]. Se ha informado de que la presencia de HLA soluble puede explicarse, al menos en parte, por el derramamiento de células HLA obligados [8]. Hemos observado ninguna correlación entre sHLA-I y-II sHLA niveles en el suero de individuos normales [9]. SHLA-yo estaba bien no detectables, o presentes sólo en muy pequeñas cantidades, en la orina, el sudor, la saliva y las lágrimas de las personas normales. SHLA-I es muy elevada en la saliva de pacientes con enfermedades reumáticas autoinmunes [2, 10]. SHLA-II es habitualmente detectable en la orina, las lágrimas, el sudor y la saliva de los sujetos sanos, pero las concentraciones de sHLA-II no se observan a ser elevados en enfermedades reumatológicas [10, 11].

En el ámbito neurológico, existe una posible alteración de sHLA-Iy / o II niveles sHLA-como un reflejo de la actividad de la enfermedad en la esclerosis múltiple (EM). Clínica y cerebrales de resonancia magnética (MRI), la actividad de la enfermedad en la EM se asocia a las fluctuaciones de sHLA-I y-II sHLA niveles en el suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EM [12 - 14]. Sin embargo, los informes publicados son algo en el conflicto. Se ha informado elevación de suero sHLA-II, pero no de suero sHLA-I, y un aumento de la CSF sHLA-I, pero no sHLA MCA-II, en pacientes con EM [12, 13]. Sin embargo, una elevación de MCA sHLA II y yo, así como un aumento en el suero sHLA-I, pero no en el suero de los niveles de HLA-II, en la EM ha informado [14]. Fainardi et al [15] informaron de una disminución en las concentraciones de sHLA-I durante las exacerbaciones de la EM, pero un aumento de la CSF sHLA-I se observó en pacientes con lesional por resonancia magnética la actividad cerebral de exploración. La variabilidad en los estudios, hasta la fecha, podría ser explicado por la variabilidad en la expresión fenotípica en individuos susceptibles genéticamente, así como en la metodología de ensayo. Estudios recientes han demostrado que las variaciones en las concentraciones sHLA se deben, al menos en parte, a la allospecificities HLA [16 - 18]. Étnico-racial factores también pueden tener una influencia en los niveles sHLA [18, 19]. Así pues, parece ser ventajosa para evaluar sHLA mediciones en sujetos con el mismo origen étnico-racial.

En teoría, cabría esperar que en la medición de sHLA MCA sería más probable que reflejen sistema nervioso central (SNC) la actividad de la enfermedad si es que tal medida podría servir como un monitor de un trastorno como la MS. No obstante, MCA exámenes no son invasivos y sin complicaciones potenciales. Por lo tanto, tratamos de determinar si más fácil acceso fluido corporal, específicamente la saliva, podría proporcionar correlativo sHLA mediciones en un autoinmune mediada CNS enfermedades como la EM.

Métodos

Se analizó la saliva de MCA y trece de raza caucásica pacientes con recaída-remisión forma de EM (EMRR) definido por el McDonald criterios [20]. Ninguno de estos pacientes fue de la terapia inmunomoduladora por lo menos seis meses antes de la entrada en el estudio. También estudiamos la saliva de cincuenta y tres sujetos sanos sin antecedentes de enfermedad autoinmune con fines de comparación. Porque hay un alto grado de variación racial en frecuencias de los genes HLA [7], estamos limitados a estudiar la participación de los caucásicos nacidos en Estados Unidos y que residen en Louisiana.

Se recogieron muestras de saliva a través de la expectoración precedida de enjuague de la boca con agua estéril. El resultado, se recogieron muestras de saliva en tubos de ensayo y se almacena a -20 ° C hasta posterior ensayo. MCA fue recogido por la norma técnica estéril punción lumbar después de que el consentimiento informado fue examinado con el paciente y firmado.

Brain MRI se realizó con un 1,5 T con una máquina estándar de cabeza de bobina de cuadratura. El protocolo incluyó la imagen sagital T1, axial T1, T2 ponderado, y la recuperación de la inversión de líquido atenuado (FLAIR) imágenes. Todos MRI se realizaron antes y después (Gd-DTPA) perfusión. Axial ponderada en T2 y pre-y post-contraste T1 ponderado imágenes se utilizaron para la evaluación de la EM placas. Las imágenes interpretadas de forma independiente utilizando la inspección y con ayuda de computadora por un neuroradiologist técnicas. Detección de lesiones, compatible con MS, hizo una inspección visual como es la determinación de la ausencia o la presencia de lesión, el aumento de contraste. Basado en el software de ordenador permite la comparación de las lesiones entre los diferentes grupos. Se han realizado comparaciones entre los 13 pacientes con EM, que se dividieron en subgrupos en cualquiera de los que tienen y los que carecen de placas en la mejora de su cerebro MRI.

Hibridoma líneas celulares W6/32 (anti-HLA-A, B, C), L368 (anti-humano B 2-microglobulina), Ab2.06, IVA y L203-12 (anti-HLA-DR) se obtuvieron a partir de la Americana Tipo de Cultura de la recogida ® (Rockville, MD). Estas líneas se ampliaron y la mAbs se produjeron en ratones BALB / c, tal como se describe anteriormente [21]. Anti-clase I HLA-anticuerpo monoclonal W6/32 detecta un determinado sobre la a la cadena de todas las moléculas HLA de clase I. Anticuerpo monoclonal L368 detecta B 2-microglobulina, que es un elemento constitutivo de todas las moléculas HLA de clase I [22, 23]. Anti-HLA clase II-anticuerpos monoclonales Ab2.06, L203 y el IVA-12 no reaccionar con epítopos que compiten en el constante dominio de las moléculas HLA-DR [24 - 26].

La fase sólida para sHLA ELISA-I se ha descrito anteriormente [3, 10, 16, 21]. Los niveles de sHLA-II se determinó mediante un ensayo anteriormente descrito [9, 11], con modificaciones menores. Brevemente, las muestras de ensayo que se han añadido a los pozos que contienen apropiado de la lucha contra la clase I (W6/32) o anti-clase II (Ab2.06) anticuerpo monoclonal (AM) recubiertos cuentas. La reacción procedió durante 30 minutos para sHLA-I y dos horas para sHLA-II a 45 ° C. Las cuentas fueron luego × 3 lavados con agua destilada y 200 l ν de la etiqueta-peroxidasa anti-B 2 M anticuerpo monoclonal (L368) para sHLA-I o L 2,03 Mab para sHLA-II se han añadido a cada cuenta y se incubaron para una hora adicional A 45 ° C. Después se lava más, la reacción de color se inició añadiendo el sustrato apropiado. Se midió la absorbancia a 492 nm.

Cada ensayo incluyó una curva estándar derivados de los controles positivos y negativos. Controles negativos consistió en el 2% de BSA y suero humano, libre de sHLA-I y-II sHLA. Control positivo normas fueron preparadas por cromatografía de suero agruparon más de un CL-6B Sepharosa Mab W6/32 columna de gel. El sHLA-I AM capturados por la columna se eluye con buffer glicina HCL (0,1 M glicina, pH 2.5). Las fracciones ricas en sHLA-I fueron neutralizados de inmediato con sódico dibásico agrupados y dializados contra salina. Proteínas totales se cuantificaron con el kit ® BCA Pierce (Rockford, IL), que se supone que debe ser pura sHLA-I. En cada ensayo, una curva estándar fue creado mediante la inclusión, en doble ejemplar, siete normas sHLA-I (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1 y 0 ng / ml), de puro sHLA-I proteína. El ensayo se calcularon los valores de la curva descrita por estas normas. Todos los ensayos de sHLA-I fueron normalizados con diluciones de suero patrón en bancos. Las mediciones fueron reproducibles.

Por sHLA-II valores, la amplia gama de sHLA-II informó de los estudios de suero de individuos normales [3, 9, 17, 26 - 30] parece probable que reflejen la utilización de diversas normas o de las diferentes características de la monoclonales Los anticuerpos utilizados en las técnicas descritas. A pesar de la normalización inicial de la sHLA-II de ensayo se ha hecho anteriormente y denunciados por nosotros [9], en este estudio, para una mayor precisión de los análisis, la cantidad de sHLA-II es deducido directamente de la ELISA valor de absorbancia (DO) de cada Muestra de fluido corporal a prueba. La OD de las muestras estudiadas corresponden a los valores sHLA-II se compararon con los valores de DO de 5% de BSA que ha sido utilizada como factor de dilución y control negativo dentro de cada procedimiento.

La comparación de los valores medios para sHLA en los sujetos de estudio y los controles se hicieron con el dos colas t-test en el medio de muestras independientes. Sin embargo, esto sólo se aplica para las mediciones sHLA-II en nuestro estudio. Los valores de p <0,05 se consideró significativo.

Resultados

Todos los individuos normales había probado cantidades mensurables de sHLA-II en la saliva con un rango de 186-362 unidades / ml y una media de 222 ± 18 unidades / ml (tabla-1]. En la saliva, sHLA-I niveles varió de 0,86 a 100 ng / ml. En cinco temas, las mismas estuvieron por debajo de la sensibilidad del ensayo y, por tanto, no eran detectables. Estos resultados están de acuerdo con nuestras mediciones anteriores de sHLA normal de la saliva en donde se encontró que siete de treinta y siete materias no tenían niveles detectables de sHLA-I en este líquido corporal [11]. Sin embargo, en este estudio se ha planteado la cuestión de si estas personas representan una población sin sHLA-I. Este es, al parecer, no es el caso, ya que todas las muestras de saliva (n = 13) que se aprobaron más de un anticuerpo monoclonal w6/32 columna arrojado la presencia sHLA-I, independientemente de la detectabilidad de ensayo. Así, sHLA-I está presente en la saliva de algunas cantidades, sin embargo estos valores son demasiado bajos para distinguirse de cero en el sistema de prueba.

A los 13 pacientes con EMRR, dos tenían una relativamente baja concentración de sHLA-II (172 unidades / ml y 276 unidades / ml, respectivamente) en la saliva, mientras que los once restantes habían relativamente altas cantidades de sHLA-II, que van desde la unidad 329 / Ml a 470 unidades / ml, con un valor medio de 386 ± 52 unidades / mL (tabla-1]. Este valor es muy significativo si se compara con los de las normales (t = 8,68, P <.0005) (Figura 1]. De interés, cada uno de los pacientes con EMRR había niveles elevados de sHLA-II en el LCR, con una media de 369 unidades / ml, y este es esencialmente equivalente a la media sHLA-II concentración en la saliva (media = 386 unidades / ml, t -. = 70, P = 0,5). Además, se señaló que la CSF y saliva sHLA-II curvas de distribución son bastante equivalente, excepto por dos atípicos (Figura 2]. SHLA-II concentraciones en el LCR y saliva de pacientes con EM fueron analizados por el subgrupo más en la mejora de las personas con lesiones frente a los que, sin el aumento de lesiones en la RM cerebral, en el entendimiento de que el aumento del contraste tiende a reflejar la actividad de la enfermedad. Comparación de sHLA-II en los pacientes con el aumento de lesiones (N = 5) a los pacientes con lesiones no mejorar (N = 8), no reveló importantes MCA (356 frente a 377 unidades / ml, t = 1,49, P = 0,16) o saliva (380 frente a 390 unidades / ml, t = 0,2, P = 0,84) diferencias.

Las mediciones de la saliva y el MCA HLA-I de manifiesto lo siguiente: sHLA yo era muy elevado en el LCR y saliva de los dos únicos pacientes con EMRR, durante una exacerbación (media = 854 ng / ml), mientras que los once restantes pacientes tenían No detectables sHLA-I en la PPC o la saliva. Esto también fue cierto en el caso de aquellos pacientes con o sin aumento del contraste por resonancia magnética del cerebro de exploración.

Discusión

Hay considerable interés en la aparente capacidad del complejo HLA para liberar moléculas, identificadas como sHLA proteínas, en torno a los líquidos, ya que esto puede traducirse en un monitor biológico de la actividad de la enfermedad autoinmune. Sin embargo, el responsable de las vías, y la posible importancia fisiopatológica, de sHLA material en diferentes fluidos corporales no se han determinado. Activa la secreción de sHLA-I por las células del hígado y las células inmunocompetentes activadas [31, 32] se sugieren fuentes para su producción en el suero. Un pequeño número de estudios han demostrado que sHLA-I moléculas que aparecen en el suero son heterogéneos en masa molecular y múltiples formas moleculares de sHLA pueden tener diferentes funciones fisiológicas [33 - 35]. Se ha propuesto que sHLA-I pueden aparecer en el suero como consecuencia de derramamiento de las membranas celulares, pueden ser un producto de la proteólisis, o puede ser una alternativa secretada por vía de empalme [8, 33, 36]. Es posible que el suero HLA-II puede ser derivado de procesos similares. Sin embargo, no hay datos que avalan la hipótesis de esta.

Estudios bioquímicos de sHLA-II en el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide reveló una preferenciales liberación de alto peso molecular (1000 kDa) sHLA-II en la inflamación sinovial, pero no en el suero [27]. Además, los intentos de inducir la producción de material similar de una línea de células que expresan HLA-II sobre una superficie de células no han cumplido, lo que indica que la liberación de sHLA-II es un proceso activo. De interés, el sudor se ha demostrado que poseen polimórficos estructuras idénticas a las de suero HLA-I. Sin embargo, la excreción de sHLA-I en el sudor ha resultado ser notablemente inferior en cantidades que en el suero [11, 38]. Nos informó de la aparición de 39 kDa sHLA-I en la saliva, así como en el suero durante la actividad de la enfermedad de Sjögren y el lupus eritematoso sistémico, y la presencia de 35-37 kDa HLA-I en los dos fluidos corporales cuando la enfermedad es relativamente inactivas [10, 35]. En conjunto, parece que la presencia de sHLA en diferentes fluidos corporales tiene relevancia fisiológica. Sin embargo, queda por determinar en el que los fluidos corporales sHLA inmunoreactividad producción refleja, de hecho, si este es el caso.

Nos informaron de una sustancial elevación de la saliva sHLA-I en pacientes con enfermedades reumáticas autoinmunes, cuando la saliva sHLA-II se en el rango normal [10]. SHLA-I concentraciones en la saliva se observaron a estar relacionado con la actividad o el curso clínico de enfermedades reumatológicas. El presente estudio indica correlativa elevación de sHLA-II en la saliva y LCR de los pacientes con EMRR. De particular interés, la gran mayoría de sHLA-II equivalente mediciones fueron distribuidos en los dos fluidos corporales. En cambio, sHLA-yo era indetectable en la mayoría de los especímenes, con sólo ocasionales elevación, posiblemente asociados con algunos sub-episodios clínicos de la enfermedad. Es posible que sHLA-I y-II sHLA selectiva son alteradas por el proceso inmunológico y son preferentemente afectados por diferentes mecanismos patológicos.

La expresión diferencial de sHLA concentraciones observadas en este estudio requiere de más investigación para determinar si esta está directamente relacionada con la respuesta inmune o es un epifenómeno de la patogenético proceso. En un reciente estudio, un aumento en el suero sHLA-I en pacientes con EM tratados con interferón beta 1b se informó, y la elevación correlación con la respuesta al tratamiento [39]. Sin embargo, si sHLA de otros fluidos corporales sigue un patrón similar queda por determinar como pone de manifiesto la relación recíproca entre la PPC y el suero sHLA-I en MS niveles reportados por estos mismos investigadores [15].

Si se deduce de este estudio preliminar que sHLA-II es la predominante clase de sHLA moléculas presentes en el LCR y saliva de pacientes con EM. Esto es en contraste con LCR y saliva sHLA-I, que hemos considerado que no detectables cantidades. La reducción de sHLA-I y-II sHLA aumentada observada en estos fluidos corporales puede reflejar la etapa activa de EMRR, provocada por la estimulación del sistema inmune en ausencia de terapia inmunosupresora. Nuestros resultados indican que la medición de la saliva sHLA-II puede ser un posible marcador biológico no invasiva de la actividad de la enfermedad en una de las principales CNS enfermedad como la EM.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Dr Adamashvili ha contribuido a este manuscrito por la prestación de servicios especializados de laboratorio para la medición de los soluble HLA-I y-II soluble HAL.

Drs. Minagar y Kelley han contribuido a este manuscrito por la contratación de la esclerosis múltiple y el examen de los pacientes, la interpretación de los datos y preparación del manuscrito.

Dr Gonzalez-Toledo ha contribuido a este manuscrito por la interpretación de la neuro-radiología y la generación de estudios de neuro-radiología datos.

Dr Featherston ha contribuido a este manuscrito por hacer el análisis estadístico y la generación de las cifras.

Agradecimientos

Este estudio se apoyó con una donación de Serono, Inc, Rockland, MA (EE.UU.). Queremos dar las gracias al Dr Stephen Jaffe para la revisión crítica de este manuscrito y de la remisión de pacientes.