Journal of Nanobiotechnology, 2005; 3: 8-8 (más artículos en esta revista)

Mecanicista aspectos de la biosíntesis de las nanopartículas de plata por varias cepas de Fusarium oxysporum

BioMed Central
Nelson Durán (duran@iqm.unicamp.br) [1], Priscyla D MARCATO (priscyla@iqm.unicamp.br) [1], Oswaldo L Alves (oalves@iqm.unicamp.br) [3], Gabriel De IH Souza (gabrinacio@yahoo.com.br) [2], Elisa Esposito (elisa@umc.br) [2]
[1] Biological Chemistry Laboratory, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CEP 13084862, Caixa Postal 6154, Campinas, S.P., Brazil
[2] Química Biológica y Laboratorio de Biotecnología, Centro de Ciencias Ambientales, Universidad de Mogi das Cruzes, Mogi das Cruzes, SP, Brasil
[3] Solid State Chemistry Laboratory, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CEP 13084862, Caixa Postal 6154, Campinas, S.P., Brazil

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Resumen

Extracelular producción de nanopartículas de metal por varias cepas del hongo Fusarium oxysporum se llevó a cabo. Se encontró que los iones de plata acuoso cuando se expone a varias cepas de Fusarium oxysporum se reducen en solución, lo que llevaría a la formación de plata hydrosol. Las nanopartículas de plata fueron en el rango de 20-50 nm en dimensiones. La reducción de los iones metálicos se produce por una nitrato reductasa y que dependen de un servicio de quinona extracelular proceso. Las potencialidades de este nanotecnológico fugal diseño basado en la biosíntesis de las nanopartículas para varias aplicaciones técnicas son importantes, incluyendo su alto potencial como material antibacteriano.

Antecedentes

El dissimilatory férrico reductasa, que se encuentran en las bacterias son una parte esencial de los ciclos de hierro [1] y, fundamentalmente, son intracelulares, pero uno extracelular uno fue aislado de Mycobacterium paratuberculosis [2]. Otro posible mecanismo que se activa en este proceso desde que se descubrió que algunas bacterias reducir los óxidos de Fe 3 + por producir y secretar pequeñas, difusible redox de compuestos que puedan servir como lanzadera de electrones entre el microbio y el sustrato insoluble hierro [3]. El papel de los compuestos excreta en la transferencia de electrones extracelular fue revisado recientemente [4].

La presencia de hidrogenasa en el hongo Fusarium oxysporum, como se demostró con el lavado de células suspensiones que se han crecido aeróbicas y anaeróbicas en un medio con glucosa y sales con nitrato modificada [5]. El nitrato reductasa fue aparentemente esenciales para la reducción del hierro férrico [6]. Muchos hongos que presentan estas propiedades características, en general, son capaces de reducir Au (III) o Ag (I) [7]. Además de estas enzimas extracelulares, varios naphthoquinones [8 - 10] y [11] antraquinonas con excelentes propiedades redox, se informó en F. Oxysporum que podrían actuar como lanzadera de electrones en el metal reducciones [3].

Aunque se sabe que los microorganismos como las bacterias, levaduras y hongos ahora desempeñar un papel importante en la rehabilitación de metales tóxicos a través de la reducción de los iones metálicos, esto se consideró como interesante nanofactories muy recientemente [12]. El uso de estas dissimilatory propiedades de los hongos, la biosíntesis de los nanomateriales inorgánicos utilizando organismos eucarióticos como los hongos pueden ser utilizadas para el cultivo de las nanopartículas de oro [13] y [14] de plata intracelularmente en células de los hongos Verticillium [15]. Recientemente, se encontró que los iones acuosos chloroaurate extracelular puede reducirse utilizando el hongo F. Oxysporum, para generar una gran estabilidad de oro [16] o las nanopartículas de plata en el agua [17]. Otros proceso, que fue descrito en la literatura, se relaciona con la producción de plata a través de nanopartículas oligopeptides catálisis, la precipitación de las partículas con diversas formas (hexagonal, triangular y esférico) [18]. Sin embargo, en la reducción de hongos de los iones Ag llevado suspensión coloidal, diferente que en el caso oligopeptides. Luego, el mecanicista aspectos son todavía una cuestión abierta, sin embargo este proceso se producen en el caso de hongos, probablemente, ya sea por acción o por reductasa lanzadera de electrones quinonas o ambos. Nuestros objetivos en esta investigación son diferentes para comparar las cepas de F. Oxysporum, a fin de comprender si la eficacia de la reducción de iones de plata que guarda relación con una quinona reductasa o de la acción.

Resultados y Discusión

Los frascos erlenmeyer con la F. Oxysporum biomasa son una de color amarillo pálido antes de la adición de Ag + iones y esto cambió a un color marrón sobre la finalización de la reacción con los iones Ag + durante 28 h. La aparición de un color marrón-amarillento en la solución que contiene la biomasa sugiere la formación de nanopartículas de plata [21]. Los espectros UV-Vis registrada de la F. Oxysporum 07SD cepa recipientes de reacción (método A) en diferentes momentos de la reacción se presenta en la figura 1. El fuerte resonancia de plasmones superficiales centradas en ca. 415-420 nm claramente aumenta en intensidad con el tiempo. La solución es muy estable, sin evidencia de floculación de las partículas, incluso varias semanas después de la reacción. La inserción de la figura 1 se muestran los espectros UV-Vis en la región de longitud de onda baja registrada desde el medio de reacción exhibido una banda de absorción en ca. 265 nm y se le han atribuido a aminoácidos aromáticos de las proteínas. Es bien sabido que la banda de absorción en ca. 265 nm surge debido a la electrónica excitations en residuos de tirosina y triptófano en las proteínas. Esta observación indica la liberación de las proteínas en solución de F. Oxysporum, y sugiere un posible mecanismo para la reducción de los iones metálicos presentes en la solución [17].

La Figura 2 muestra los espectros de emisión de fluorescencia de hongos filtrado de una de las cepas (07SD). Una banda de emisión centrado en 340 nm se observó. La naturaleza de la banda de emisión indica que las proteínas vinculadas a la superficie de nanopartículas y los presentes en la solución existe en la forma nativa [22]. Los resultados similares fueron observados para todas las cepas estudiadas como se muestra en la Tabla 1. En la Tabla 1, la cepa 07SD apareció como el más eficiente en la producción de nanopartículas de plata. Al parecer, las diferentes eficiencias están relacionados con la reductasa y / o para la generación de quinona y se discutirá más adelante. Una desestabilización de las nanopartículas es evidente en el caso de F. Oxysporum 534, 9114 y 91248 cepas a los 28 horas, según lo indicado por una disminución en la absorción de 420 nm.

Del mismo modo, cuando la biomasa fue sumergido en el agua y sólo los hongos filtrado (Método B) se añadió a un 10 -3 M AgNO 3 solución, la solución acuosa inicialmente color cambió a un color amarillo-marrón pálido dentro de 28 h de reacción (datos no Muestra), lo que indica claramente que la reducción de los iones produce extracelular a través de la reducción de los agentes liberados en la solución de F. Oxysporum como lo muestra el espectro UV-Vis de la cepa 07SD (Fig. 3].

Figuras 4 y 5 se muestra la SEM micrograph registrada de la nanopartículas de plata (método A). Esta imagen muestra los agregados de nanopartículas de plata. En este micrograph, las nanopartículas esféricas en el rango de tamaño 20-50 nm se observaron. Las nanopartículas no están en contacto directo, incluso dentro de los agregados, lo que indica la estabilización de las nanopartículas por un ph. Esto corrobora con la observación anterior por Ahmad et al. [17] en su estudio sobre F. Oxysporum. El mismo micrograph en el Método B se observó (no reveló). En el análisis por espectroscopia de energía dispersiva (EDS) de las nanopartículas de plata se confirmó la presencia de plata elemental señal (Figura 6].

El TLC (Cromatography de Thin Layer) en el análisis de 60 placas de gel de sílice utilizando cloroformo-metanol-ácido acético (195:5:1) mostraron un terreno con valor de Rf de 0,65, y la utilización de benceno-nitromethane-ácido acético (75:25: 2) mostraron un terreno con valor de Rf de 0,85, que corresponde al 2-acetil-3 ,8-dihidroxi-6-metoxi anthraquinone o sus isómeros en el 2-acetil-2 ,8-dihidroxi-6-metoxi anthraquinone (Esquema 1). Esto fue corroborado por el espectro de fluorescencia del filtrado (método A), que indica un anthraquinone fluorescencia fracción [11]. Los espectros de excitación a la máxima de emisión (550 nm) encaja muy bien con el espectro de absorción de la anthraquinone en la Figura 7.

La figura 8 muestra la nitrato reductasa a través de la reacción de nitrito con 2,3-diaminophthalene. El espectro de emisión exhibe dos grandes picos de intensidad de fluorescencia a 405 y 490 nm, correspondientes a las emisiones y la máxima de 2,3-diaminonapthotriazole, DAN (exceso), respectivamente. La intensidad de estas dos bandas se incrementaron con la adición de un 0,1% KNO 3 solución, lo que confirma la presencia de nitrato reductasa.

Parece que la reductasa es responsable de la reducción de los iones Ag + y la subsiguiente formación de nanopartículas de plata. La misma observación se comunicó con otra cepa de F. Oxysporum y se señaló que esta fue reductasa específicas de F. Oxysporum. Sin embargo, Fusarium moniliforme, no dio lugar a la formación de nanopartículas de plata, ni intracelularmente ni extracellularlybut figura intra y extra celular reductases de manera similar como F. Oxysporum [17, 23]. Esta es una indicación de que probablemente el reductases en este tipo de Fusarium son importantes para el Fe (III) a Fe (II), pero no a Ag (I) y Ag (0). Además, en F. Moniliforme antraquinonas derivados no se detectaron a diferencia del caso de F. Oxysporum. Ambos fusarium eran semejantes en la producción de naphthaquinones [8], pero difieren en la producción de antraquinonas. Probablemente, en nuestro caso, Ag (0) reducción se debió principalmente a la conjugación entre la lanzadera de electrones con la reductasa de la participación como se muestra en la Figura 9.

Conclusión

Aunque el oro / plata nanopartículas se han sintetizado utilizando procariotas como las bacterias [24, 25] y eucariotas, como los hongos [13, 14], las nanopartículas crecer intracelularmente, excepto en el caso de un reciente informe en el que F. Oxysporum fue utilizado. En el caso de que las nanopartículas creció extracelular [17]. En nuestro caso, todos los F. Oxysporum cepas estudiadas exhiben la capacidad de producción de nanopartículas de plata, sin embargo, en función de la reductasa / lanzadera de electrones relaciones en estas condiciones. Sintetizado biológicamente nanopartículas de plata podrían tener muchas aplicaciones, en áreas tales como la óptica no lineal, espectralmente selectivo de revestimiento para absorción de la energía solar y la intercalación de materiales eléctricos de baterías, como los receptores ópticos, en la catálisis de reacciones químicas, biolabelling [26], y como antibacterianos capacidad [27].

Métodos

La F. Oxysporum cepas utilizadas fueron las siguientes: O6 SD, SD 07, 534, 9114 y 91248 de ESALQ-USP Genética y Biología Molecular Laboratorio de Piracicaba, SP, Brasil. Los hongos inocula se prepararon en un 2% de extracto de malta y extracto de levadura 0,5% a los 28 ° C en placas de Petri. El líquido del hongo se llevó a cabo en presencia de extracto de levadura 0,5% a los 28 ° C durante 6 días. La biomasa fue filtrada y resuspendido en agua estéril.

Reducción de Plata y su caracterización

Método A: En la reducción de la plata, la metodología descrita anteriormente fue seguido [17]. En breve, de aproximadamente 10 g de F. Oxysporum biomasa se tomó en un erlenmeyer con 100 ml de agua destilada. AgNO 3 solución (10 -3 M) se añadió al matraz erlenmeyer y la reacción se llevó a cabo en la oscuridad. Periódicamente, alícuotas de la solución de reacción y se eliminaron las absorciones fueron medidos usando un espectrofotómetro UV-Vis (Agilent 8453 - fila de diodos).

Método B: Otra prueba también se llevó a cabo de la siguiente forma: aproximadamente 10 g de F. Oxysporum biomasa se tomó en un erlenmeyer con 100 ml de agua destilada, mantuvo durante 72 horas a 28 ° C y, a continuación, la solución acuosa componentes fueron separados por filtración. Para esta solución, AgNO 3 (10 -3 M) fue agregado y se mantuvo durante varias horas a 28 ° C.

Las nanopartículas de plata se caracterizaron por microscopía electrónica de barrido (SEM) y la espectroscopia de energía dispersiva (EDS), con una tensión de 20 kV (JEOL - JSM-6360LV) y previamente recubierto de oro al vacío.

Determinación de los compuestos de electrones-shuttling

Liberación de los compuestos de electrones-shuttling siguió la metodología descrita anteriormente [11]: A fin de determinar la quinonas soluble en el agua que podrían funcionar como una lanzadera de electrones, las culturas se han filtrado de 4-6 semanas, y el filtrado ajustada a pH 3 con HCl 1 M. acidificadas La solución fue transmitido a través de una columna con resina de intercambio iónico (Amberlita ®) para la absorción de los pigmentos. Compuestos fueron eliminados de la columna por elución con acetona, la acetona eliminado usando una Buchi rotativo de evaporación y de la fase acuosa extrae 3 veces con acetato de etilo. Todas las extracciones de acetato de etilo se combinaron y la reducción de uso de la rotativa evaporador. Después de eso, 2 μ L repetidamente muestras fueron avistados en un gel de sílice 60 placa hasta un lugar era visible a la luz ultravioleta a 254 nm. Las muestras fueron resueltas mediante un cloroformo-metanol-ácido acético (195:5:1) y el benceno-nitromethane-ácido acético (75:25:2) sistema diseñado para movilizar polar pigmentos. Las placas fueron aire seco, y lugares visualizan a la luz ultravioleta [19].

Nitrato reductasa ensayo

Reducción de nitratos se demostró en el mismo medio (Método A y B) de la misma el crecimiento de caldo F. Oxysporum con la adición de 0,1% de KNO 3 [6]. El nitrato reductasa prueba se realizó después de 2 días por fluorométricos método [20]. En resumen, 100 μ l de hongos filtrado y 200 μ l de agua dionized. Con este, 10 μ l de recién preparada 2,3-diaminonaphtalene (DAN) (0,05 mg / mL en HCl 1 M), se añade de inmediato y mixtos. Después de 10 min de incubación a 20 ° C, la reacción se detuvo con 5 μ l de 0,1 M de NaOH. La intensidad de la señal fluorescente producida por el producto ha sido aprovechado al máximo por la adición de base. El 2,3-diaminonapthotriazole formación se midió utilizando un Perkin-Elmer (LS-55) con espectrofotómetro de luminiscencia y excitación a 375 nm de longitud de onda y la banda de emisión medido a 550 nm [20].

Determinación del triptófano / residuos de tirosina

Presencia de triptófano y tirosina residuos en la liberación de proteínas de hongos en la filtrada y se analizó por fluorescencia [17]. La fluorescencia de las mediciones se llevaron a cabo en un Perkin-Elmer (LS-55) espectrofotómetro de luminiscencia. El exitation fue 260 nm de longitud de onda, cerca de las transiciones óptica máxima de la tirosina y triptófano.

Contribuciones de los autores

ND concebido en el estudio, junto con la Oficina de Asuntos Jurídicos y EE y participó en su diseño y coordinación y recogieron todos los datos y escribió el documento. PDM SEM obtenido todos los puntos de vista, realicen los métodos enzimáticos, el electrón shuttling y debatieron aspectos relacionados con las tres partes en el manuscrito. GIHS de realizar todas las pruebas de hongos y evaluar toda la espectroscópicos variaciones de la resonancia de plasmones de las nanopartículas de plata bajo la supervisión de EE. OLA también supervisó todos los aspectos de las nanopartículas en este trabajo. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Apoya de Red Brasileña de nanobiotecnología, CNPq / MCT y FAPESP son reconocidas. Reconocemos Fernando de Oliveira de NCA-UMC para el análisis de la radiación UV-Vis.