La alergia a las partículas de efecto adyuvante - factores genéticos influyen en las respuestas de anticuerpos y citoquinas

Numerosos estudios epidemiológicos realizados en diferentes partes del mundo han demostrado una asociación entre los niveles de partículas del aire ambiente y los diversos resultados de salud, incluida la mortalidad, enfermedad cardiopulmonar, la reducción de la función pulmonar, y la exacerbación del asma y síntomas relacionados con la alergia (revisado en [1 , 2]]. Algunas poblaciones parecen estar particularmente en riesgo, como los ancianos, los niños o los pacientes con diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma [1, 3]. Además, el fondo genético se ha asociado con diferencias en la susceptibilidad humana a los agentes ambientales incluidos los plaguicidas y agentes infecciosos [4], y puede ser también de importancia en relación con los efectos biológicos de las partículas.

Apoyar una relación causal entre las partículas y el aumento de los síntomas, las partículas han demostrado aumentar las respuestas alérgicas en los seres humanos y en modelos animales (revisado en [5, 6]]. En modelos de roedores, muy diferentes partículas han demostrado aumentar alérgeno-específicas de IgE tanto después de la inhalación, intratraqueal, intranasal, intraperitoneal y subcutánea exposición [7 - 12]. Partículas características como tamaño de las partículas, composición de partículas y sustancias químicas adsorbido a la superficie de partículas se ha demostrado que influyen en el efecto adyuvante de sensibilización alérgica y la inflamación de las vías aéreas y la hiperreactividad en ratones [11 - 18]. Para partículas de combustión, el núcleo de partículas insolubles parece desempeñar un papel importante en el efecto adyuvante de las partículas en varios modelos de ratones [18 - 23]. Ratón cepa diferencias en la inflamación de las vías respiratorias y alérgicas alérgeno-específicas de los niveles de anticuerpos se han reportado después de la instilación intratraqueal de partículas de los motores diesel (DEP) y el alergeno [24, 25]. También con "limpiar" las partículas de poliestireno (PSP, 0,1 μ m de diámetro) como sustituto de la combustión de partículas insolubles básico, Granum et al. [26] llegó a la conclusión de que el efecto adyuvante de partículas difiere cualitativamente con respecto a Th1 y Th2-de las respuestas de anticuerpos asociados, en función de los antecedentes genéticos o inducidos por el estado inmune de los ratones.

El objetivo general del presente estudio fue investigar la manera en que la genética influye en las respuestas de fondo a los alergenos y partículas solo y en combinación. Por tanto, nuestro estudio de anticuerpos y respuestas de los ganglios linfáticos en diversas cepas puras de ratones espera para mostrar diferentes respuestas a los OVA y partículas. BALB / cA ratones son considerados como de alta tensión de respuesta de IgE a OVA [27, 28]. NIH ratones, ya que se incluyeron en un modelo intraperitoneal respondido de manera diferente BALB / cA ratones para PSP y OVA [26]. Además, hemos incluido C3H/HeN ratones, que han demostrado ser IgE baja respondedores a OVA [28]. BALB / cJ ratones fueron incluidos en el anticuerpo experimentos porque esta sub-cepa ha informado de responder con más fuerza a OVA que BALB / cA subcutánea en ratones modelo [29].

El ganglio linfático es un sitio clave en el cebado de los linfocitos T y de la producción de IgE por los linfocitos B [11, 30, 31]. Por lo tanto, además de los niveles séricos de anticuerpos, se examinaron los principales respuesta celular en el ganglio linfático de drenaje poplítea (PLN) footpad después de la inyección de partículas de poliestireno (PSP) y el alergeno ovoalbúmina (OVA), solos y en combinación. El PLN es el único ganglios linfáticos que drenan el footpad [32], y es por lo tanto muy adecuado para estudios de las respuestas en las células de los ganglios linfáticos. Estamos investigando la forma en que el seleccionado puras cepas de ratones difieren en calidad y cantidad en sus Th1 y Th2-asociada a anticuerpos séricos y la respuesta celular PLN pautas para PSP + OVA. Además, estamos investigando si el fondo (es decir, la respuesta de citoquinas ex vivo en las células de los ratones inyectados con buffer únicamente), OVA-, PSP y PSP + OVA inducida por citoquinas patrones diferentes en las distintas cepas de ratón, y si los patrones de citoquinas podría Explicar las diferencias en las respuestas de anticuerpos a OVA + PSP. Se encontró que la susceptibilidad al efecto adyuvante de las partículas secundarias en ambas respuestas de anticuerpos y respuestas celulares primarias fue influido por factores genéticos (es decir, la cepa de ratón). El ex vivo de citoquinas respuesta de los patrones de no predecir la respuesta de anticuerpos in vivo.

Para examinar la relación dosis-respuesta y la OVA de PSP con respecto a la producción de anticuerpos, BALB / cA NIH y ratones fueron inmunizados con diferentes combinaciones de dosis de OVA (100, 50 y 10 μ g) y PSP (100, 40, 10 y 0 μ g ). Después de una dosis de refuerzo de OVA en el día 21, la OVA-IgE específica, IgG1 y IgG2a niveles de anticuerpos en suero se determinó en el día 26. En BALB / cA ratones, PSP OVA dado con firmeza el aumento de los niveles de los Th2 asociada a anticuerpos IgE e IgG1 frente a OVA solo (Figura 1A, B]. En cambio, el asociado Th1-IgG2a niveles no difirió entre los grupos OVA dado en la presencia o ausencia de PSP (Figura 1C]. En general, existe una relación inversa entre la dosis y la OVA tanto los niveles de IgE e IgG1, con 10 μ g de OVA de dar la más alta de anticuerpos para todos los niveles de partículas de dosis. Los análisis del diseño factorial demostró que la dosis de 10 μ g OVA, independientemente de la dosis de PSP, inducida por IgE significativamente mayor que la otra OVA dosis, y el aumento de los niveles de IgG1 de 100 μ g OVA (p <0,001). Independientemente de OVA dosis, la respuesta IgG1 aumentado considerablemente con cada aumento de la dosis de PSP (p <0,001). Una tendencia dosis-respuesta para las partículas era tan claro para IgE debido a la ausencia de una diferencia entre 40 y 100 μ g de PSP.

En ratones NIH, PSP también ejerce un adyuvante efecto en la respuesta de anticuerpos a la OVA, sin embargo NIH respondieron diferente a los ratones BALB / cA ratones de dos maneras. En primer lugar, el NIH ratones que recibieron la dosis más alta combinaciones de OVA y PSP experimentado reacciones anafilácticas y murió en cuestión de minutos después de la inyección de refuerzo OVA (que se indican con una cruz en la figura 1D, E, F]. En segundo lugar, también la OVA específicos IgG2a se aumentaron los niveles de PSP en ratones NIH, en contraste con BALB / cA ratones. Sin embargo, las respuestas en los ratones supervivientes (es decir, 10 μ g OVA) sugieren que la IgE e IgG1 respuestas fueron similares en los NIH y BALB / cA ratones con respecto a la relación dosis-respuesta para las partículas. También la IgG2a niveles fueron significativamente mayores para la OVA de partículas con todas las dosis que para los OVA solo, y de manera significativa los niveles de anticuerpos se observaron con 40 μ g de PSP que con 10 μ g de PSP.

Como 10 μ g OVA y 40 μ g PSP dio un medio, pero aún pronuncia la respuesta, estas dosis se utilizaron en nuevos experimentos. A continuación, se compararon los alérgenos específicos de respuestas de anticuerpos después de la vacunación con OVA + PSP, OVA y PSP en BALB / cA, BALB / cJ, NIH y ratones C3H/HeN. Como se muestra en la Figura 2, la respuesta de los patrones de BALB / cA NIH y ratones fueron similares a los que se muestra en la Figura 1, con un aumento de la producción de IgE en ambas cepas, mientras que se incrementó la producción de IgG2a sólo en ratones NIH. Además, en nuestro sistema, BALB / cJ ratones tenían IgE específica y IgG2a respuestas similares a BALB / cA ratones, sin embargo los niveles de IgG2a tendían a ser ligeramente aumentado en un OVA + PSP en BALB / cJ ratones (estadísticamente significativo en uno de los dos experimentos) . Similar a la respuesta en ratones NIH, PSP tenía un efecto adyuvante en ambos IgG2a IgE y respuestas en ratones C3H/HeN, aunque las respuestas parece más débil en C3H/HeN que en NIH y ratones BALB / c.

La inmunización con OVA IgE por sí solo dio respuestas en algunos BALB / cA, BALB / cJ y C3H/HeN ratones, pero no en ratones NIH (Figura 1 y 2]. Como era de esperar, PSP y HBSS sin alergeno no afectará los niveles de anticuerpos en ninguna de las cepas.

Para examinar la forma en que la principal respuesta celular a OVA y PSP, solos o en combinación, en variadas BALB / cA, NIH y ratones C3H/HeN, estudiamos el número de células ex vivo y de la secreción de citoquinas por el poplítea los ganglios linfáticos (PLN) de las células . Cinco días después de la inyección de OVA + PSP, OVA, PSP y de amortiguación (HBSS) en el footpad, el PLN se determinó el número de células, y la cantidad de IL-4, IFN-γ e IL-10 PLN liberados de las células después de la Con A Estimulación ex vivo se determinó.

Para las tres cepas, el número de células PLN estaban significativamente aumentados por OVA + PSP en comparación con los tres grupos de control (Figura 3A]. Curiosamente, el número de células respuesta a OVA solo y PSP solo (en comparación con HBSS) varió entre los tres cepas. En BALB / cA ratones, OVA aumentó significativamente el número de células, mientras que PSP aumentó significativamente el número de células en ratones NIH. Ratones C3H/HeN tomó una posición intermedia, ya que ambos OVA y PSP débilmente, pero aumentó significativamente el número de células en comparación con HBSS.

Con respecto a las citocinas (Figura 3 B, C y 3D], OVA + PSP firmemente el aumento de los niveles de IL-4 e IL-10 en comparación con los tres grupos de control en BALB / cA ratones (p <0,006), mientras que el IFN - Γ niveles fueron sólo marginalmente afectados (p <0.035). Además, tienden a débilmente OVA (ns) aumentar la IL-4 en los niveles BALB / cA ratones. La IL-4 para el BALB / cA grupos control fueron relativamente bajos en comparación con los niveles en los ratones NIH. En ratones NIH, OVA inducida por citoquinas sin cambios o en el número de células, mientras que PSP aumentó significativamente el IL-4 e IL-10 (p <0.007) y la OVA + PSP también el aumento de estos "sensible" citoquinas (p < 0,005, en comparación con el OVA). El IFN-γ niveles en ratones NIH no fueron alteradas por la PSP. Una vez más, los ratones C3H/HeN respondió a los dos OVA y PSP. Todas las citocinas fueron significativamente aumentado en OVA y aumentar aún más por OVA + PSP en ratones C3H/HeN, aunque más pronunciada de IFN-γ que para IL-4 e IL-10. PSP solos también aumentó significativamente los niveles de IFN-γ e IL-10 en ratones C3H/HeN. Los niveles de IL-4 e IL-10 eran bajos y los niveles de IFN-γ se ratones C3H/HeN alto en comparación con los niveles en las otras cepas. Los niveles de fondo (buffer de los animales tratados), de IL-4 e IFN-γ fueron relativamente bajas en BALB / cA y relativamente alta en ratones NIH, mientras que los niveles en los ratones C3H/HeN apareció bajo de IL-4 y de alto para IFN-γ , Respectivamente.

El fondo genético que parece influir mucho si una persona alérgica se desarrolla la respuesta inmune a un alergeno [33]. En ratones, esto queda ilustrado por los informes de la cepa diferencias en las respuestas alérgicas a alergenos [28, 34 - 36]. De acuerdo con Granum et al. [26], nuestros datos también indican que el aumento de la capacidad de los anticuerpos de la "limpia" de partículas insolubles está influenciada por la genética de fondo. Esto es coherente con los informes de ratón cepa diferencias en la inflamación de las vías respiratorias y alérgicas específicas de los niveles de anticuerpos después de la instilación intratraqueal de DEP alergeno y [24, 25]. También los efectos de partículas en la inflamación de las vías respiratorias, la permeabilidad del epitelio alveolar y la actividad fagocitaria de macrófagos se ha demostrado que varían entre las cepas de ratón [37].

La relación dosis-respuesta para las partículas parecían similares para BALB / cA NIH y ratones, como la OVA de baja dosis (10 μ g), y la alta dosis de partículas (40 y 100 μ g PSP) inducida por los más fuertes de anticuerpos IgE e IgG1 respuestas. Sin embargo, el NIH ratones inmunizados con una alta concentración de las dos OVA y PSP se perdieron debido a shock anafiláctico tras la inyección de refuerzo. Altas concentraciones de antígeno de refuerzo han sido anteriormente demostrado inducir shock anafiláctico después de la inyección subcutánea en ratones caballo cebado con gamma globulina covalentemente a partículas de celulosa [38]. En ratones, IgG (1) ha sugerido a ser tan efectiva como la IgE en el desencadenamiento de reacciones anafilácticas [39, 40]. El inducido niveles de OVA-IgG1 específico parece ser unas 10 veces mayor en los sobrevivientes NIH que en ratones BALB / cA ratones (Figura 1B y 1E]. Así, NIH ratones pueden ser más susceptibles que los BALB / cA ratones para experimentar el shock anafiláctico, ya sea a causa de una fuerte respuesta de IgG1, o de otra forma a causa de una mayor susceptibilidad a shock anafiláctico.

En el presente estudio, el anticuerpo efecto adyuvante de PSP diferían entre las distintas cepas de ratones, tanto con respecto a la magnitud y si un Th2 o mixto Th1 y Th2-asociada a una mayor respuesta de anticuerpos fue. Considerando que las Th1-asociados IgG2a respuesta fue notablemente aumentado en PSP sólo en NIH y ratones C3H/HeN, PSP mejorada Th2 asociada a la respuesta IgE en todas las cepas de ratón examinados. PSP parece también aumentar las respuestas de IgE en estudios experimentales con ratones C57BL/6J y C3H/HeJ (datos no presentados). También en relación con el efecto adyuvante de PSP, la BALB / cA ratones que parecía ser un alto IgE-responder, mientras que los ratones C3H/HeN parece ser relativamente bajo de respuesta para las dos OVA-IgE específica y los niveles de anticuerpos IgG2a. Este estado de respuesta es de acuerdo con otros estudios de la respuesta de IgE a OVA en estas cepas de ratones [27, 28].

También con respecto a la primaria de las respuestas celulares en los ganglios linfáticos, aumento de la PSP respuesta a OVA en ambos BALB / cA, NIH y ratones C3H/HeN (Figura 3]. Sin embargo, mientras que la IL-4 e IL-10 de citoquinas respuestas fueron significativamente aumentado en un OVA + PSP en las tres cepas, en ratones C3H/HeN los niveles eran bajos y los aumentos no pueden ser biológicamente significativo. Por otra parte, OVA + PSP aumentado notablemente el IFN-γ en los niveles C3H/HeN ratones, y marginalmente en BALB / cA ratones. IL-4 e IFN-γ citoquinas se utilizan con frecuencia como indicadores de una respuesta Th2 y Thl, respectivamente [41]. En este sentido, la respuesta de citoquinas a OVA + PSP podría caracterizarse como Th2-, Th1 y Th2-parciales-de BALB / cA, NIH y ratones C3H/HeN, respectivamente, que no, sin embargo, predecir el equilibrio entre Th2 - Th1 y asociada a respuestas de anticuerpos (Figura 1 y 2, véase más abajo). Tampoco podría el fondo (control de amortiguación) las respuestas de IL-4 e IFN-γ en las diferentes cepas de explicar el equilibrio entre Th1 y Th2-de las respuestas de anticuerpos asociados a OVA + PSP.

La complejidad de las interacciones entre genes y medio ambiente fueron ilustrados por el muy diferentes de respuesta a OVA y PSP dada por separado en las tres cepas examinadas. BALB / cA ratones respondió con una no significativa pero constante aumento de la IL-4 liberación de citoquinas en ratones tratados con OVA, mientras que los ratones NIH respondió con un aumento significativo del sesgo de Th2 (IL-4 e IL-10) en la liberación de citoquinas PSP - Los animales tratados. C3H/HeN ratones respondieron con ambos-Th1 y Th2 de la secreción de citoquinas tipo, aunque aparentemente Th1 asimétricos, debido a los bajos de IL-4 e IL-10, después de ambos tratamientos OVA o PSP. Esto sugiere que la base genética influye fuertemente en la susceptibilidad a inmunógenos y estímulos irritativos como las partículas, también con respecto a la de citoquinas Th1 y Th2 balance de la respuesta. Curiosamente, el aumento de la PSP sola Th2-asociados, pero no el asociado-Th1, la respuesta de citoquinas en ratones NIH. Si las partículas por sí mismas son capaces de inducir la producción de IL-4 en los ganglios linfáticos también in vivo, esto puede promover una respuesta alérgica a los alergenos presentes.

En su conjunto, PSP ejercida adyuvante efecto sobre OVA inducida por IgE y los niveles de IL-4 en las tres cepas, mientras que no hay asociación entre las Th1-parámetros asociados IgG2a e IFN-γ. Así, por las cepas de ratones utilizados, el principal patrón de citoquinas ex vivo no puede predecir el Th1 y Th2-asociada a anticuerpos patrón. Una de las razones podría ser que la Con A de la estimulación in vitro no es una óptima manera de describir la realidad in vivo en la secreción de citoquinas por las células PLN. Sin embargo, in vitro OVA-PLN estimulación de las células de OVA + PSP tratados BALB / cA ratones fueron similares, IL-4 e IFN-γ patrón de respuesta como la Con A-estimulación (datos no presentados). Nuestros resultados son consistentes con estudios anteriores que muestran que la expresión de citoquinas se correlaciona sólo en parte con las vías respiratorias y las enfermedades IgE respuestas [35, 42], y nuestros datos demuestran que la interpretación y la extrapolación de los datos in vitro debe hacerse con cautela. La descripción de la Th2/Th1 balance puede explicar parte de una respuesta inmune, sin embargo la regulación inmune es más complejo, con la participación de otras citoquinas, moléculas de superficie celular y las células T reguladoras. IL-10 parece jugar un papel importante en el desarrollo y la función de ciertas células T reguladoras (revisado en [43, 44]]. Sin embargo, en el presente estudio, la secreción de IL-10 por el grupo de células PLN fue altamente correlacionado con la secreción de IL-4 (r _s = 0,86). Aunque la contribución de las células T reguladoras no pueden ser excluidos, lo que indica que la IL-10, que son secretadas a un mayor grado por las células Th1 que Th2 [45], en el PLN en este momento es producida principalmente por las células Th2.

De acuerdo con Randolph et al. [46], ya hemos demostrado que tanto PSP, DEP y partículas del aire ambiente en el ganglio linfático de drenaje se encuentra dentro de la fosfatasa ácida-, MHC clase II y las células CD86-positivo, muy probablemente, células presentadoras de antígeno (APC) [23 , 47]. Es notable que PSP, en la ausencia de alergenos, los ganglios linfáticos afectados, en tanto las células NIH y ratones C3H/HeN. En contraste, nuestro presente y la anterior los datos de BALB / cA ratones indican que, aunque las partículas de mayor sinérgicamente respuestas celulares a la OVA, el modelo de partículas (PSP, DEP) no tuvo efectos detectables ni en el número de células PLN, la expresión de moléculas de superficie de linfocitos ni en Ex vivo la secreción de citocinas por las células del PLN [23, 47]. Tomados en conjunto, nuestros datos de BALB / cA ratones sugieren, por tanto, un papel para partículas sólidas como alergeno transportistas [48] en el efecto adyuvante de sensibilización alérgica. Nuestros datos actuales sugieren que las partículas, en cepas sensibles, además, influir en la respuesta inmune en los ganglios linfáticos. En nuestro modelo parece que las partículas que respuestas celulares, inducidas en ausencia de alergeno (es decir, partículas en el aire ambiente BALB / cA ratones [47], así como en PSP NIH y ratones C3H/HeN (presente estudio)) mejora tanto Th2 - Th1 y asociada a respuestas de anticuerpos, mientras que las partículas de reformular Th2-dominado respuesta de anticuerpos (es decir, PSP y DEP en BALB / cA ratones) no indujo cambios celulares detectables. Esto sugiere que las partículas insolubles en el acto principal por el aumento de la respuesta inherente al alergeno (actúa como un "motor en general" [6]], y que los antecedentes genéticos de partículas y propiedades de determinar si un adicional asociada a la respuesta Th1 se suscitó. La presencia de una respuesta Th1 ha sugerido para ampliar Th2 impulsado por la inflamación [49 - 52]. Nuestros resultados sugieren que, por lo tanto, ambas partículas pueden aumentar la sensibilización IgE y, en función de la susceptibilidad genéticamente determinada, agravan aún más la inflamación alérgica y con ello aumentar los síntomas de la alergia en algunas personas.

PSP aumento de la OVA-respuestas de anticuerpos específicos IgE en todas las cepas de ratones examinados, mientras que la respuesta IgG2a se incrementó en diversos grados, y sólo en algunas cepas. Los factores genéticos (es decir, la cepa de ratones) influyó en la respuesta al efecto adyuvante de PSP respuestas de anticuerpos en la secundaria y la primaria de las respuestas celulares a la OVA. Además, los factores genéticos también influyó en el ganglio linfático de células de respuesta a las dos OVA y PSP dado por separado. Curiosamente, PSP solos inducida diferentes respuestas de citoquinas en el ganglio linfático en algunas de las cepas de ratón. Por otra parte, encontramos que el ex vivo de citoquinas patrones no pueden predecir la in vivo Th1 y Th2-asociada a los patrones de respuesta de anticuerpos en las diferentes cepas de ratón. Los resultados indican que el núcleo de partículas insolubles por el aumento de los actos inherentes a la respuesta al alergeno, y que el fondo genético puede determinar si un nuevo componente asociado Th1-se añade.

Mujeres puras BALB / cABomTac y BALB / cJBomTac ratones (Taconic M & B A / S, Ry, Dinamarca) y NIH / OlaHsd y C3H/HeNHsd ratones (Harlan UK Ltd, Oxon, Reino Unido) se han utilizado. Los ratones fueron alojados, 5-8 animales por jaula, en la ropa de cama BeeKay (B & K Universal AS, Nittedal, Noruega) en jaulas tipo III macrolon filtro en armarios (Scantainers). Los animales se les permitió descansar durante al menos una semana antes de entrar en los experimentos de 6-7 semanas de edad. Los ratones fueron expuestos a un 12-hr/12-hr claro / oscuro ciclo (30-60 lux en jaulas), la temperatura ambiente (20 ± 2 ° C) y 40-60% de humedad relativa. Los animales se les dio alimentos pildoradas (RM1, SDS, Essex, Reino Unido) y el agua del grifo ad libitum. El estudio fue realizado de conformidad con las leyes y reglamentos de los experimentos con animales vivos en Noruega, y que fueron aprobadas por la Junta en virtud Experimental Animal del Ministerio de Agricultura de Noruega.

Como un sustituto para el núcleo de partículas insolubles de las partículas de combustión, las partículas de poliestireno (PSP) con un diámetro de 0,1 μ m se utilizaron (Polybead poliestireno Microesferas; Polysciences Europa GmbH, Eppelheim, Alemania). Como alergeno, la ovoalbúmina (OVA, Gal d 2; albúmina de huevo de pollo, de la categoría VII, Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) se utilizó. En los experimentos dosis-respuesta, utilizamos la partícula dosis de 100, 40 y 10 μ g por inyección (14,9, 5,94 y 1,49 × ^{10 10} partículas, respectivamente), así como OVA dosis de 100, 50 y 10 μ g por inyección. Para todos los nuevos estudios, la dosis de 40 μ g PSP (5,94 × ^{10 10} partículas) y 10 μ g OVA por inyección se utilizó. Todos los preparativos se hicieron en Hank equilibrado de solución de sal (HBSS; PAA Laboratories GmbH, Linz, Austria). 20 μ l de los diferentes preparados se inyecta por vía subcutánea en la posterior footpad (curar-tep dirección) con un 100 μ l jeringa Hamilton (Hamilton Bonaduz AG, Suiza) con una aguja estéril de 30 G (BD Medical Systems, Irlanda).

Dosis respuesta experimentos se realizaron en grupos de ocho BALB / cA NIH o ratones, con todas las combinaciones de 100, 40, 10 y 0 μ g de PSP y 100, 50 y 10 μ g OVA. Las suspensiones se inyecta en el derecho footpad posterior en el día 0, y un refuerzo con la misma dosis de OVA se dio en el día 21. El día 26, los ratones fueron exsanguinated corazón por punción bajo anestesia CO _2. Suero se almacenó a -20 ° C hasta el análisis. Los niveles séricos de IgE específica OVA-, IgG1 y IgG2a se midió por ensayo inmunoenzimático (ELISA). A continuación, para examinar más a fondo las diferencias cualitativas en el efecto adyuvante de las partículas, las respuestas de anticuerpos después de la inyección de OVA + PSP, OVA, PSP y de amortiguación (HBSS) fueron determinadas cepas de ratón en el NIH, BALB / cA y BALB / cJ, y en Un experimento en C3H/HeN. Estos experimentos fueron realizados en dos ocasiones, con ocho ratones por grupo.

En un modelo descrito anteriormente [23], se estudió la primaria de la respuesta celular en el ganglio linfático de drenaje en BALB / cA, NIH y ratones C3H/HeN (quince ratones por grupo). Los ganglios linfáticos poplíteo (PLN) se extirparon cinco días después de la inyección en ambos posterior footpads de OVA y PSP, por separado o en combinación. Después de la puesta en común de la PLN desde el mismo animal, el número total de células se determinó por PLN (Coulter Counter). Posteriormente, las células PLN de cinco animales se agruparon para conseguir suficiente número de células por pocillo ex vivo de la cultura con la Con A, y las concentraciones de citoquinas en sobrenadantes de cultivo de células se determinó por pruebas ELISA sándwich. En una serie de experimentos, las respuestas de las células de OVA y OVA + PSP animales tratados de todas las cepas se determinó, y los ratones no tratados fueron estudiados en un experimento. Un conjunto de experimentos que confirman Posteriormente se llevó a cabo, esta vez realizado en experimentos separados para cada cepa de ratones (los resultados se muestra en la Figura 3].

IgE, IgG1 y IgG2a anti-OVA anticuerpos fueron detectados en un ELISA de captura que se describió anteriormente [19, 53], modificado en [54]. En resumen, placas microtiter cubierta de una rata monoclonales anti-IgE ratón, rata, ratón IgG1 anti-anti-rata o ratón de anticuerpos IgG2a fueron incubadas con el ratón sueros por triplicado, diluido 1:10, 1:20 y 1:20, respectivamente . Después de la incubación con biotina OVA, seguida de la pre-incubación con los complejos formados de streptavidina y biotina fosfatasa alcalina, p-nitrofenol disodiumhexahydrat diluido en un tampón dietanolamina se añadió como sustrato. Diluciones de un ratón OVA-piscina suero inmune fueron incluidos en cada plato estándar de la curva de producción. OD fue medida a 405 nm en un lector de microplacas MRX (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, EE.UU.), conectado a un PC mediante el software BioLinx (Dynatech Laboratories), y las concentraciones de anticuerpos se dan en unidades arbitrarias (AU) por ml.

Cinco días después de la inyección, la poplítea se extirparon los ganglios linfáticos y única célula suspensiones preparadas a lo descrito previamente [23]. Después de la puesta en común de los dos PLN suspensiones de células del mismo animal, la célula de concentración se midió con un Coulter Counter Z1 (Beckman Coulter Incorporated, FL, EE.UU.), y presentado como el número total de células (10 ⁶⁾ por PLN. Posteriormente, tal como se describe en otro lugar [23], el PLN células fueron cultivadas con 5 μ g / ml Concanavalina A (Con A, Sigma, MO, EE.UU.), y ex vivo IL-4, IFN-γ e IL-10 en la secreción de citoquinas Cultura sobrenadantes se determinó por ELISA DuoSets Mouse (R & D Systems Inc, MN, EE.UU.). El óptimo de los tiempos de incubación para la medición de IL-4, IFN-γ e IL-10 con BALB / cA ratones antes se encontró que 24, 48 y 24 horas, respectivamente [23], y los datos de estos puntos se presentan a tiempo.

El análisis estadístico se realizó con SigmaStat ^® Sistema de Análisis Estadístico para Windows, versión 2.03 (Jandel Científico, Erkrath, Alemania). Niveles de anticuerpos, el número de células y de los niveles de citoquinas fueron log _{10-transformado} para conseguir datos distribuidos normalmente con la igualdad de las diferencias. En los experimentos de dosis-respuesta en BALB / cA ratones, los datos fueron analizados en un ANOVA de dos vías, utilizando el "OVA dosis", como factor 1 y "PSP dosis", como factor de 2. Debido a la pérdida de los animales en el experimento con ratones NIH, análisis similares no pudo realizarse, y un ANOVA de una manera sólo se ha ejecutado en los datos con 10 μ g OVA. En ambas cepas, la pareja comparaciones se realizaron con el post-hoc de Tukey test. En todos los demás experimentos, para garantizar la igualdad de criterios para todas las cepas experimentales independientes de tamaño y configuración, los datos de cada cepa de ratones se analizaron por separado, utilizando un ANOVA de una forma paramétrica. Si el ANOVAs mostraron diferencias estadísticas con una significación de p ≤ 0,05, en pareja comparaciones de todos los grupos dentro de cada cepa de ratón se realiza la post-hoc de Tukey test. Grupos experimentales fueron considerados estadísticamente diferente si p ≤ 0,05, y encontraron diferencias estadísticamente significativas en los dos experimentos se indican en las cifras.

UCN llevó a cabo el trabajo experimental, análisis estadísticos y escribió el manuscrito. ML iniciado el proyecto y de obtener financiación. UCN, ML y AA participó en el diseño del estudio y la interpretación de los datos, y editado el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.