La clonación y caracterización funcional de los receptores de quimioquinas CC conejo 2

Receptores de quimioquinas son siete transmembrana G-receptores acoplados a proteínas que dirigen la migración de células inmunes a los diversos sitios de la inflamación, además de su papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis inmune celular en varios compartimentos linfoides [1, 2]. Quimiocinas (8-14 kDa de peso molecular), los ligandos de los receptores de quimioquinas, son clasificadas en general basado en el posicionamiento de los dos cysteines conservadas en el CC, CEC, C o C ₃ CX familia [3]. Encuadernación de quimiocinas afines a sus receptores sobre las células inmunitarias desencadena una cascada de señalización mediada principalmente por el G _{α i} familia de las proteínas G que conduzca a una variedad de funciones de células efectoras incluyendo quimiotaxis, degranulación, y la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, como el TNF α [4 ].

CC La familia de receptores de quimioquinas 2 (CCR2) está principalmente expresado en la mayoría de los monocitos circulantes. CCR2 se cree para mediar extravasación de los monocitos de sangre a los sitios de la inflamación [5 - 7], y está implicada en la patogenia de varias enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y la aterosclerosis [8, 9]. MCP subfamilia miembros, a saber, MCP-1, -2, -3 y -4, obligar a CCR2 con gran afinidad [7, 10, 11]. Varios estudios genéticos supresión de la participación de CCR2 o MCP-1, y los estudios de anticuerpos de neutralización de MCP-1 se han establecido con claridad la función esencial de los CCR2/MCP-1 eje clave en la mediación de varios eventos patogénicos en modelos animales de esclerosis múltiple y de la aterosclerosis.

El principal desafío en el desarrollo de las pequeñas moléculas antagonistas de los receptores de quimioquinas es la falta de la cooperación transfronteriza, especies a la actividad del receptor en la preclínicos especies. Por ejemplo, BX-471, una pequeña molécula antagonista de CCR1, exposiciones nano-molar baja afinidad por el receptor humano, pero ha sub-micromolar a micromolar alta afinidad a la rata y el ratón receptores CCR1, respectivamente [12]. Es importante destacar que, BX-471 ha intermedio afinidad a los receptores CCR1 el conejo [13]. Esto impone importantes desafíos a los compuestos en ensayos de eficacia y de los estudios toxicológicos en modelos preclínicos de la.

En los últimos años, los conejos se han utilizado para el estudio de la patogénesis de la enfermedad inflamatoria modelo. Se ha demostrado recientemente que el potencial terapéutico de tiazolidinadionas conejo en globo modelo de la lesión y volver a endothelialization se asocia con una disminución de la MCP-1 de expresión [14]. Además, la eficacia de un antagonista CXCR2 se ha demostrado con éxito en una crónica antígeno modelo de artritis inducida [15]. Por otra parte, los antagonistas han CCR1 beneficio terapéutico en un modelo de conejo rechazo [13]. En el presente estudio se informe de la clonación y caracterización funcional de los conejo CCR2. También demuestran que la informó recientemente CCR2/CCR5 doble antagonista, TAK-779, exposiciones de alto nivel de potencia contra conejo CCR2 en los dos ensayos de quimiotaxis y vinculante.

CDNA de longitud completa secuencia de conejo CCR2 fue clonado de bazo ARN total de Nueva Zelandia conejos blancos utilizando un método basado en la PCR. La secuencia de aminoácidos deducida de conejo CCR2 codifican una proteína de 369 aminoácidos (Fig. 1], que comparten el 80% de la identidad del receptor CCR2b humanos. La secuencia de alineación con el ratón, rata y mono rhesus CCR2 también está representado en la Fig. 2. De rata y ratón CCR2 figuran otros 13 aminoácidos en el N-terminal en comparación con el humano, el mono y el conejo CCR2. Además, un aminoácido en la supresión de conejo CCR2 se observó en la posición 18 (Fig. 2]. Cysteines que son esenciales para la formación de disulfuro de bonos también se conservan en conejo CCR2. Basado en el modelo SS y 2SS [16], cisteína pares (Cys-72/Cys-119 y Cys-31/Cys-276) en el conejo CCR2 fueron altamente conservadas en comparación con sus homólogos de todas las especies conocidas. Los niveles de expresión de CCR2 conejo se determinó también en diversos tejidos de conejo utilizando Taqman análisis. Conejo CCR2 fue abundantemente expresado en los pulmones y el bazo, en comparación con los bajos niveles de expresión en el cerebro, corazón, hígado y testículo (Fig. 3].

La estabilidad de las líneas celulares que expresan conejo CCR2 en U-937 células fueron generados para caracterizar las propiedades aglutinantes de la radiomarcada humanos MCP-1 o el ratón a JE conejo CCR2. La afinidad de radiomarcada humanos MCP-1 o el ratón JE se midió utilizando un ensayo de la competencia obligatoria de los respectivos ligandos fría. Como se muestra en la Figs. 4, ¹²⁵ I-JE ratón mostraron gran afinidad con un calculado K _d de 0,95 ± 0,02 nM y B _max de 18829 ± 1555 dpm. En contraste, ¹²⁵ I-MCP-1 humano tiene menos afinidad al conejo CCR2 con falta de saturable vinculante tan alta como de 6 nM caliente ligando (datos no presentados). Examen detallado de las características obligatorias de radiomarcada humanos MCP-1 a conejo CCR2 será necesario para resolver esta discrepancia. Para abordar el punto, son necesarios futuros estudios para comprender conejo CCR2 vinculante características y farmacología con ¹²⁵ I-conejo-MCP-1.

Farmacología de conejo receptor CCR2 se estudió con una variedad de ligandos que pertenecían a la subfamilia MCP irrelevante y ligandos como RANTES, MIP-1 α y β MIP-1. Como era de esperar, la MCP-1, -2 y -4 diferencialmente compitió la unión de ratón radiomarcado con JE K _i valores de 8,4, 13,5 y 0,44 nM, respectivamente. En contraste, el frío MCP-3 no vinculante para competir JE conejo CCR2 cuando se utiliza a concentraciones tan altas como 30 nM (Fig. 5A]. Además, carece de pertinencia ligandos que se unen con gran afinidad por CCR1 o CCR5 no están en condiciones de competir vinculante de ratón radiomarcado a JE conejo CCR2, mientras que el frío JE compitieron Ki vinculante con un valor de 0,116 nM (Fig. 5B]. TAK-779 es una pequeña molécula antagonista caracteriza tanto de CCR2 y CCR5, y tiene un 27 nM contra la afinidad del receptor CCR2b humanos [17]. Hemos probado la actividad de TAK-779 en conejo CCR2 utilizando células transfectadas radiomarcada JE ratón en una norma de competencia vinculante ensayo. Como se muestra en la Fig. 5C, TAK-779 es también muy potente contra el conejo CCR2 con una CI ₅₀ de 2,3 nM.

Con el fin de confirmar si conejo CCR2 expresado en células U-937 es funcionalmente junto a G _{α i} familia de las proteínas G, quimiotaxis ensayos se realizaron tanto con los padres de U-937 y U-937/rabbit CCR2 estable transfectants. Las células fueron incubadas en la parte superior de cámara, en presencia de un aumento de la concentración de ligando en la cámara baja. Parental U-937 no migrar a cualquiera de MCP-1 humano o ratón JE. En cambio, U-937/rabbit CCR2 estable transfectants eficazmente a la migración, ya sea humano o MCP-1 ratón JE (Fig. 6A y 6B]. La migración máxima se observó en aproximadamente 4 nM de ligando y osciló entre el 20-40% en comparación con el total de entrada de 0.5-1% de la migración de las células en ausencia de ligando. Una típica forma de campana se observó en la curva de la quimiotaxis respuesta humana, ya sea con MCP-1 o el ratón JE. Como era de esperar, tanto los padres y la de conejo CCR2 líneas celulares estables emigrado así a la CXCR4 ligando SDF-1 α (Fig. 6C]. El efecto antagonista de TAK-779 fue examinado también en contra de conejo CCR2 en la presencia de cualquiera de concentración definido ratón o hMCP JE-1 (4 nM). Preincubación de las células de conejo CCR2 expresando con TAK-779 bloqueado la migración, ya sea de ratón o hMCP EJ-1 con una CI ₅₀ de 98 nM y 4 nM, respectivamente (Fig. 6D y 6E]. Como era de esperar, TAK-779 MCP-1 inhibe la migración dependen de las células U-937/hCCR2b estable con una CI ₅₀ de 3,8 nM (Fig. 6F]

En resumen, hemos clonado a la escuela para pedir conejo CCR2 cDNA y demostrado que el receptor es funcional expresando conejo CCR2 en células U-937. La secuencia de conejo se CCR2 información más detallada sobre la evolución molecular de los receptores de quimioquinas en diferentes especies. Más importante aún, los datos obtenidos en materia de transmisión de especies de la actividad antagonista de CCR2 proporcionará valiosas herramientas para realizar estudios de toxicología y eficacia en el modelo del conejo.

Recombinante humana quimiocinas (MCP-1, -2, -3, -4, RANTES, MIP-1 α, β MIP-1) fueron adquiridos de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ). Mouse JE humanos y SDF-1 α se obtuvieron a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN). Radiomarcada ligandos ⁽¹²⁵ I-humanos MCP-1 y ^125-I de ratón JE) fueron adquiridos de Perkin Elmer (Boston, MA). RPMI 1640, la albúmina sérica bovina (BSA) y 4 - (2-hidroxietil)-1-ácido piperazineethanesulfonic (HEPES) fueron adquiridos a Sigma (Gaithersburgh, MD). Polimérica reacción en cadena (PCR) y Taqman se compraron los cebos de Qiagen (Valencia, CA). El CCR5/CCR2 doble antagonista de TAK-779 fue sintetizada como se describe en otro lugar [14].

Total RNA fue preparado desde el bazo de conejos blancos de Nueva Zelandia por el método de Trizol y el cDNA se transcribe utilizando SuperScript ™ primer capítulo de síntesis del sistema de RT-PCR (Invitrogen, Carlson, CA). Entonces el cDNA fue amplificado por PCR usando primers conservadas (ejemplo 1: 5'-GTATTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATG-3 'y primer 2: 5'-CAAAGGTAACTGTCCTGGCTTTTAAAGCAA-3'). El fragmento resultante de PCR fue secuenciado y esta información se utilizó para el diseño de conejo CCR2 genes específicos. Conejo CCR2 genes específicos se utilizaron para ampliar dos fragmentos de cDNA de conejo por 5'-y 3'-rápida amplificación de cDNA extremos (RACE) utilizando SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clonetech, Palo Alto, CA). La secuencia de la información y 3'-5'-RACE productos se utilizan para diseñar dos primers (5'-GGTTGCTGAGAAGCCTGACACGC-3 'y 5'-CAGGTCTGTATTCTTCAACAAGCCCTCG-3'), de inicio y de los codones de parada, y de larga duración de conejo CCR2 cDNA fue clonado utilizando amplificación de PCR. El producto final de PCR con el tamaño correspondiente fue clonado a PCRII-TAPO (Invitrogen) y secuenciados.

Conejo cDNA de cerebro, corazón, hígado, pulmón, bazo y testículos se cuantificaron los niveles de expresión de CCR2 y glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) por Taqman método. TaqMan primers y sondas fueron diseñados utilizando el Primer Express Computer Program (Applied Biosystems, Foster City, CA). El avance y retroceso primers y sondas seleccionadas para conejo CCR2 son: 5'-catgacacactgctgcatcaac-3 ', 5'-gagaggtagctccggaacttctc-3' y 5'-[6-FAM]-ccgtggtctacgccttcgtcgg-[TAMRA-6-FAM] -3 ' . La adelante, inversión de primers y sondas seleccionadas para GAPDH conejo son: 5'-ggatttggccgcattgg-3 ', 5'-caacatccactttgccagagttaa-3' y 5'-[6-FAM]-cgcctggtcaccagggctgct-[TAMRA-6-FAM] -3 ' . Amplificación mezcla contenía un volumen total de 10 μ l con 6 μ l de PCR TaqMan universal maestro de la mezcla (300 nM adelante cartilla, 300 nM primer invertir, y 900 nM sonda) y 4 μ l de las muestras diluidas. Taqman amplificación se realizó en un ABI PRISM 7900HT Sequence Detector System (Applied Biosystems, Foster City, CA) con el siguiente perfil térmico: 1 de cada ciclo de 50 ° C durante 2 minutos y 95 ° C durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de cada uno de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Los datos se analizaron mediante un incorporada en el método estándar de la curva.

Conejo cDNA descrito anteriormente fue amplificado por PCR con primers 11: 5'-ggaggcagatctcgaacaggcagctggcgg ggaggcagatctcgaacaggcagctggcgg ggaggcagatctcgaacaggcagctggcgg-3 'y primer 12: 5'-ttattggaattccaagccgacggctgtcca ttattggaattccaagccgacggctgtcca ttattggaattccaagccgacggctgtcca-3' (nucleótidos se destacó la división de los sitios Bgl II y EcoR I, respectivamente) . El resultado fragmento de la PCR fue digerido con Bgl II y EcoR I, y luego subcloned en el sitio correspondiente de pMSCV _puro expresión de vectores retrovirales (BD Biosciences, CA). Lipofectamine mediada transfección se llevó a cabo en el AmphoPack 293 envases línea celular (BD Biosciences, CA), con una longitud total de cDNA conejo CCR2 en la expresión de vectores retrovirales pMSCV _puro, que contiene una selección de la resistencia puromycin marcador. Treinta y seis horas después de transfección, de la piscina viral sobrenadante fue recuperado de los envases células, centrifugada, y polybreen se añadió a una concentración final de 8 μ g / ml. El sobrenadante viral se añade a los padres U-937 células en un cultivo de tejidos tratados frasco y la infección se le permitió proceder a 7 horas. En este momento, medio adicional se añadió a la de envases para generar células más virus. Después de 7 horas, el segundo grupo de sobrenadante viral se preparó como la primera, con excepción de 4 μ g / ml polybreen. U-937 células se resuspendió en este sobrenadante viral y la infección se le permitió proceder a la noche a la mañana. Luego, el U-937 células fueron colocadas en medio fresco sin ningún tipo de selección. Después de 18 horas, el medio se cambió a la selección soporte de 0,4 μ g / ml puromycin. La piscina de transfectadas establemente clones se propagó por la unión y ensayos de quimiotaxis.

Equilibrium vinculante ensayo se llevó a cabo en medio RPMI 1640 con 10 mM HEPES y el 0,2% de BSA en la temperatura ambiente con agitación constante por 2 horas. Mezcla de reacción contenía un volumen total de 100 μ l con varias concentraciones de ¹²⁵ I-etiquetados ligandos ⁽¹²⁵ I-humanos MCP-1 o ^I-125 del ratón JE), U-937/rabbit CCR2 estable transfectants (10 ⁵ células / así para ¹²⁵ I-humanos MCP-1 y 10 ⁴ células / así para ¹²⁵ I-JE ratón) en la presencia o ausencia de ligando correspondiente fría. Inespecíficos vinculante fue determinado por 100 veces el exceso de frío ligando. Las reacciones fueron detenidos por la separación utilizando el filtro de fibra de vidrio (Wallac Impreso Filtermat A) en un Tomtec Recolector 96-2 (Hamden, CT). Los filtros fueron lavados 5 veces con buffer de lavado (10 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 7,4) para eliminar el radioligand sin encuadernar. Por último, es obligado radioligand cuantificación utilizando un líquido scintillation counter (Wallac 1205 Betaplate, Perkin Elmer). Constante de disociación (K _d) y el máximo vinculante (B _max) se calcularon por regresión no lineal con Graphpad Prism 4.01 (San Diego, CA).

El ensayo se realizó en el marco del idénticas condiciones que la saturación vinculante ensayo descrito anteriormente con la radiomarcada ligando concentración fijo (0,11 nM ¹²⁵ I-ratón JE), en presencia de varias concentraciones de quimiocinas o sin etiqueta TAK-779. Los valores de CI ₅₀ fueron calculadas por el ajuste de curvas de la competencia con Graphpad Prism 4,01.

Quimiotaxis ensayo se realizó como se describe en otro lugar [18] con algunas modificaciones. Parental U-937 o U-937/rabbit CCR2 estable transfectants han sido recolectados, y contó resuspendido en una final densidad celular, de 5 × 10 ⁶ / ml en la quimiotaxis de amortiguación (medio RPMI 1640, que contiene 0,3% de BSA y 1 mM HEPES). Quimiocinas se diluye a 1000 ng / ml y un balance de serie diluido (1:3) en la migración de amortiguación en una placa bien Costar 96 (Cat # 3790, Costar, Corning, NY). Treinta microlitros de cada dilución de quimioquinas fueron trasladados a los correspondientes así en la parte inferior de una cámara de ChemoTX 96 así la migración de placas (5 μ M tamaño de poro; Neuroprobe, Gaithersburg, MD). El filtro ChemoTX unidad fue montado y 50 μ l de las células se han añadido a la parte superior de cámara e incubados durante 2,5 horas. Las placas fueron removidos y luego las células se fuera el filtro de aspiración superior. Las células que habían emigrado a la parte inferior de cámara fueron pulsados con 5 μ l de una solución acuosa (Promega, Madison, WI) y se incubaron por un período adicional de 30-60 minutos a 37 ° C. Las placas fueron sacudidos suavemente para permitir la mezcla uniforme y leer a 490 nm en un lector de Spectra _max Plus (Molecular Dynamics, Piscataway, NJ). Célula de las curvas de calibración se incorporaron en la parte inferior de la placa con el número de células va desde 0-150000 células /. Los resultados se expresaron como porcentaje de quimioquinas frente a la migración de células de concentración. Por complejo de las pruebas, TAK-779 se diluyó en DMSO en diversas concentraciones, y añadió que tanto la parte superior e inferior y cámaras de quimiotaxis ensayo se realizó en presencia de 4 nM de ratón JE, tal como se describe más arriba.

CCR2, los receptores de quimioquinas CC 2; MCP, monocitos chemoattactant proteína; RANTES, reguladas en la activación regulado de quimioquinas; MIP, la proteína inflamatoria de macrófagos; GAPDH, glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa; RACE, la rápida amplificación de cDNA fines, HEPES, 4 - ( 2-hidroxietil)-1-ácido piperazineethanesulfonic; BSA, albúmina sérica bovina; PCR, reacción en cadena de polimerasa.

DL diseñado experimentos, supervisó la investigación y escribió el documento. X-JY realizaron los experimentos. RJE realizaron los experimentos. ATP realizaron los experimentos. HW sistema de alerta temprana y participó en la secuencia de alineaciones. CH sintetizó el compuesto. CV concibe el estudio, diseñado experimentos, supervisó la investigación y escribió el documento.