Journal of Nanobiotechnology, 2005; 3: 5-5 (más artículos en esta revista)

Dedo de zinc de síntesis química como moléculas nano-sondas direccionables de doble varados AND

BioMed Central
Markus von Nickisch-Rosenegk (markus.nickisch @ ibmt.fhg.de) [1], Eva Ehrentreich-Forster (eva.ehrentreich @ ibmt.fhg.de) [1], Rothin Strehlow (rothin.strehlow @ ibmt.fhg. De) [1], Alexander Christmann (alexander.christmann @ ibmt.fhg.de) [1], Frank F Bier (frank.bier @ ibmt.fhg.de) [1]
[1] Instituto Fraunhofer de Ingeniería Biomédica (IBMT), Dpto. Bioanalytics Molecular y Bioelectronics, Arthur-Scheunert-Allee 114-116, 14558 Nuthetal, Alemania

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Resumen

Nuestros experimentos describir un método alternativo de dsADN reconocimiento utilizando dedo de zinc (ZF) que unen a las moléculas de ADN específica y con alta afinidad. Nuestro objetivo era desarrollar sondas dedo de zinc que son capaces de unirse a las moléculas de dsADN en lugares predeterminados. En nuestro enfoque básico que utilizan pares de oligonucleótidos complementarios a dsDNAs forma, que contiene una de las tres SP1-factor de transcripción motivos dedo de zinc como un reconocimiento del sitio. Dos sondas dedo de zinc de la SP1 motivo de síntesis química y fueron modificados con una Dy-633 fluoróforo. El SP1 péptidos se incorporarían funcional de los dedos de zinc utilizando cloruro de zinc. El direccionables dsDNAs fueron inmovilizados sobre fibras ópticas, y la cinética y vinculante de las tasas de zinc dedo de la mano artificial, sondas fueron medidos por un dispositivo de detección de fluorescencia (photomultiplying tubo). Los dos dedos de zinc y sus correspondientes lugares de reconocimiento de ADN sirvió como sondas específicas y los controles de la adecuación del sitio, y viceversa. Nuestros experimentos muestran que una variedad de dsADN vinculante sondas pueden ser creadas por la modificación de la secuencia de aminoácidos de las proteínas naturales de zinc dedo de la mano. Nuestros resultados ofrecen un enfoque alternativo de abordar dsADN moléculas, por ejemplo para su utilización en un nanoarray dispositivo.

Antecedentes

Nanoestructuras basadas en el ADN se ha informado previamente. En general se trata de un requisito indispensable para generar único varados ADN (ssDNA) moléculas de abrir la posibilidad de sondaje con oligonucleótidos. Sin embargo, la producción de largo ssDNA puede no ser una tarea fácil. SsDNAs son más sensibles a la manipulación física, tienden a formar estructuras secundarias estables y requieren un esfuerzo considerable para obtener cantidades suficientes de moléculas intactas. Un enfoque alternativo se basa en el uso de péptidos, los ácidos nucleicos (PNAs), que son capaces de reconocer dsDNAs. Los informes recientes han demostrado que este enfoque no siempre es práctico y vinculante PNA no es siempre fiable [1]. Otro posible enfoque es de utilizar los mecanismos celulares implicados en el control de la producción de proteínas en el nivel de los ácidos nucleicos. Factores de transcripción que se unen a secuencias son dsADN objetivo de conmutación genes específicos "sobre" o "fuera" a través del reconocimiento y unión a corto fragmentos específicos de ADN. Zinc dedo proteínas son factores de transcripción que tienen estructura simple y conciso [2], se puede hacer sintéticamente y, por lo tanto, podría proporcionar alternativas para sondas dsADN reconocimiento [3].

Resultados y discusión

En nuestros experimentos hemos utilizado uno de los tres motivos dedo de zinc de la SP1-zinc-dedo de la mano como una plantilla para nuestro dedo de zinc de síntesis química sondas, que son de la C2H2 tipo (Figura 1]. El ADN vinculante región fue alterada en dos lugares para que el plegado de zinc de obligar a dedo de la mano ya sea en la "AAA"-secuencia de ADN o en el sitio "GCG"-secuencia de ADN sitio (véase el M & M, negrita y subrayado) . Los hechos de forma péptidos se modificaron con un fluoróforo (Dye633) en su amino-terminales para permitir la detección cuantitativa. El ADN de doble varados objetivos se hicieron de hechos de forma complementaria oligonucleótidos el desempeño adecuado reconocimiento de la secuencia de ADN y un fosfato modificación en el 5'-final de uno de los oligonucleótidos complementarios para su inmovilización.

La detección fue realizada por fluorescencia de una fibra óptica-dispositivo desarrollado en nuestro instituto (Figura 2], que fue impulsada por el en-casa construida software. El ADN de doble varados objetivos fueron inmovilizados en una silanized fibra de vidrio y se incubaron con los dedos de zinc en una cámara de flujo-a través de (Figura 2]. La unión y disociación eventos se mide en tiempo real las curvas y vinculante (obligatorio señal vs tiempo) se obtuvieron (Figuras 3 y 4]. Las curvas se ajustaron utilizando en la casa construida montaje de rutina. La tasa resultante disociación (D k) en un rango millimolar se obtuvieron, con indicación de las altas tasas de liquidación de las moléculas de zinc dedo de la mano (ver Figuras 3 y 4]. Sin embargo, estos son suficientes para nuestros experimentos. Hemos medido por primera vez la unión de la sintéticos específicos único motivo dedo de zinc péptidos a sus sitios de unión en tiempo real in vitro.

La Figura 3 muestra un típico resultado obtenido usando fibra de la cubierta de ADN que contiene la "GCG" motivo (el motivo reconocido por ZF1). El negro representa la curva de ZF1 vinculante, que se caracteriza por la rápida asociación cinética. Una pequeña cantidad de ZF1 permanece asociado con el ADN de más de 1,5 horas en la etapa de disociación. Un posterior incubación de la misma fibra con ZF2 (Figura 3, la curva roja) mostró más rápido disociación cinética. Del mismo modo, el motivo obligado ZF2 la "AAA" secuencia firmemente y cantidad significativa de ZF2 sigue vinculado a la ADN irreversible (Figura 4, curva de negro], mientras que ZF1 disociarse completamente (Figura 4, curva roja).

Conclusión

En este trabajo hemos demostrado que los dedos de zinc sintéticas obligar expresamente a sus sitios de unión, que se componen de ácido nucleico trillizos. Una ventaja adicional de la SP1 sistema es que ofrece la oportunidad de utilizar múltiples único motivo de los dedos de zinc [4, 5], de forma similar a la nativa factor de transcripción SP1 motivos. El uso de múltiples dominios ZF debería dar como resultado vinculante afinidades en un rango nanomolar y también permitirá el reconocimiento de secuencias más específicos. Prevemos que nano-direccionables zinc dedo motivo basado en sondas para dsDNAs empleará múltiples motivos vinculados ZF y poseen afinidades vinculante en el rango nanomolar.

Materiales y métodos
Los ácidos nucleicos

Oligonucleótidos complementarios (Carl Roth, Karlsruhe) con ADN-zinc-dedo-reconocimiento lugares fueron:

GCM-motivo

5 '-Phosphat-TgACTgACTgACTgACTgACgCgTgACTgACTgAC TgACTgACTgACTgACTgACgCgTgACTgACTgAC TgACTgACTgACTgACTgACgCgTgACTgACTgAC -3' (sentido)

5 '-gTCAgTCAgTCACgCgTCAgTCAgTCAgTCAgTCA gTCAgTCAgTCACgCgTCAgTCAgTCAgTCAgTCA gTCAgTCAgTCACgCgTCAgTCAgTCAgTCAgTCA-3' (antisentido)

AAA-motivo

5 '-Phosphat-TgACTgACTgACTgACTgACAAATgACTgACTgAC TgACTgACTgACTgACTgACAAATgACTgACTgAC TgACTgACTgACTgACTgACAAATgACTgACTgAC-3' (sentido)

5 '- gTCAgTCAgTCATTTgTCAgTCAgTCAgTCAgTCA gTCAgTCAgTCATTTgTCAgTCAgTCAgTCAgTCA gTCAgTCAgTCATTTgTCAgTCAgTCAgTCAgTCA -3' (antisentido)

Correspondientes pares de los oligonucleótidos antisentido y sentido fueron recocidos a dar dsADN fragmentos, que se utilizaron para la inmovilización (véase más adelante)

Los péptidos sintéticos (en dedos de zinc "de una carta de código")

Los hechos de forma péptidos se modificaron con un fluoróforo (Dye633, Dyomics) en el amino-terminal para la detección. Los péptidos se ZF1 (GCM-motivo): N-Dy633-GFMCTWSYCGKRFTRSDELQRHKRTH GFMCTWSYCGKRFTRSDELQRHKRTH GFMCTWSYCGKRFTRSDELQRHKRTH-COOH (Biosynthan, Berlín) y ZF2 (AAA-motivo):

N-Dy633-GFMCTWSYCGKRFTQSSNLQTHKRTH GFMCTWSYCGKRFTQSSNLQTHKRTH GFMCTWSYCGKRFTQSSNLQTHKRTH-COOH (péptidos y elefantes, Nuthetal).

Almacenamiento de amortiguación figura 10 mM Tris / HCl (pH 7,5), 90 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 90 μ M ZnCl 2, 5 mM TDT; funcionamiento de amortiguación se hizo mediante la adición de BSA acetilado (Aurion, Wageningen NL) a la de almacenamiento De amortiguación a una concentración final de 1-2%. Los péptidos se disuelve en la gestión de amortiguación (en la concentración de la péptido 0,5 μ g / 500 μ l de buffer) y se incubaron durante 15 minutos para permitir que los péptidos a veces para formar los dedos de zinc antes de la incubación con ADN (Asociación etapa). Para medir la cinética de disociación, la amortiguación se cambió al "funcionamiento" de amortiguación (sin ZF).

Detección

La detección se utilizan en el seno construido de fibra óptica dispositivo "Horst" (véase la figura 2], impulsada por la propia software.

Silanized fibras de vidrio

Fibras de vidrio se limpian con recién preparada caliente "Pirañas" de solución (1:2 mezcla de 30% de peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico al 97%) por 1 minuto y enjuagarse a fondo con agua destilada. Las fibras son más incubadas en recién preparada 10N NaOH caliente durante 2 h. Las fibras activadas se sumergieron en un 10%-aminopropil triethoxysilane solución (APTES), ajustada a pH 3,5 y se calienta a 80 º C en un baño de agua por 2 h. Finalmente las fibras fueron lavadas con agua grado HPLC y de nuevo al horno a 110 ° C durante 1 h. Los aminoácidos modificados superficie es estable durante varios meses.

Inmovilización de ADN

Una solución de 5'-fosforilados oligonucleótido fue diluida con 30 mM 1-methylimidazole a una concentración final de 5 μ M. Luego de 10 mg / ml EDC se añadió a cada oligonucleótido y mezclado durante 1 minuto. El oligonucleótido se utilizaron soluciones de inmediato a cubrir la activado partes de la fibras de vidrio (véase más arriba).

Agradecimientos

Los autores agradecen a Berit Umann y Alexandra Grychta por su excelente asistencia técnica. Esta labor fue apoyada por el ministerio alemán de educación e investigación (BMBF: Az. 0311842 y 0311842A) y la Comunidad Europea (UE) en el 5 º programa marco (5PM, Nanocell: QLK3-CT-2001-00278)