Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 26-26 (más artículos en esta revista)

In vivo efecto de la interleucina-1beta y la interleucina-1RA sobre citoplásmica maduración de ovocitos, la ovulación y desarrollo embrionario temprano en la yegua

BioMed Central
Maud Caillaud (caillaud@tours.inra.fr) [1], Guy Duchamp (guy.duchamp @ tours.inra.fr) [1], Nadine Gérard (gerard@tours.inra.fr) [1]
[1] Physiologie de la Reproduction et des Comportements. INRA-CNRS-Université de Tours-Haras Nacionales, IFR135, 37380 Nouzilly Francia

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Resumen

Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que la interleucina-1 está implicado en el sistema de periovulatory eventos. Trabajos anteriores de nuestro laboratorio demostraron que en la yegua, la interleucina-1beta (IL-1beta), mejora la tasa ovulatoria de ovocitos metafase II. El presente estudio fue realizado para analizar in vivo el efecto de la IL-1 frente al citoplasma de los ovocitos en maduración, la ovulación y la tasa de embarazo. En el presente trabajo, la IL-1beta (el experimento 1, n = 13; experimento 2, n = 25) y la interleucina-1RA (IL-1RA; el experimento 1, n = 25) fueron inyectados intrafollicularly mediante el uso de la ecografía transvaginal guiada por inyección Método. Las inyecciones se realizaron en yeguas cíclica cuando el diámetro de la creciente folículo dominante alcanzó 30-34 mm. En el experimento 1, yeguas fueron inseminadas el día del tratamiento y todos los demás días hasta la ovulación. El momento de la ovulación se determinó y un diagnóstico de preñez se realizó 14 días después de la ovulación del folículo inyectado. En el experimento 2, el complejo cumulus-ovocito de cada folículo se inyecta recogidos por ultrasonido transvaginal guiada por aspiración 38 h intrafollicular después de la inyección. Ovocito etapa nucleares y citoplasmáticas de maduración de ovocitos fueron evaluados mediante el análisis de la configuración de la cromatina, la migración cortical gránulos de las mitocondrias y distribución bajo un microscopio confocal. Los resultados del experimento 1 confirmar que un intrafollicular inyección de 1 microgramo IL-1beta induce la ovulación en la yegua mientras que la IL-1RA no tiene efecto en la dosis utilizada en el presente estudio. Además, hemos demostrado, que en condiciones experimentales, IL-1beta e IL-1RA inducida por una disminución en el desarrollo del embrión. Experimento 2, nos lleva a observar que la IL-1beta no es capaz de inducir la migración cortical gránulos y remodelación de las mitocondrias, que comúnmente ocurre durante la maduración de ovocitos, que actúa en la maduración nuclear. Este resultado puede explicar la disminución en el desarrollo del embrión se observó después de la IL-1beta intrafollicular inyección. En conclusión, el presente estudio tiende a demostrar que la IL-1beta desempeña un papel en el proceso ovulatorio y puede actúa en la maduración de ovocitos en la yegua, pero otros factores son necesarios para completar la maduración citoplásmica equina ovocito para permitir el desarrollo del embrión.

Antecedentes

En los últimos años, ha acumulado pruebas que sugieren que las citoquinas son importantes reguladores de la función ovárica. Interleucina-1 (IL-1), una de las principales citoquinas, así como de los receptores (IL-1R1 y de la IL-1R2) y el antagonista (IL-1RA) se han demostrado que se producen en el ovario de varias especies [1, para su revisión ]. Recientemente, hemos demostrado la presencia de IL-1 β mRNA equina en los complejos cumulus-ovocitos y células de la granulosa, que inmunorreactivas IL-1 β se ha observado en los fluidos equina folicular [2, 3].

Los estudios in vitro han demostrado que la IL-1 β regula algunas actividades celulares de células de la granulosa y de teca, como la esteroidogénesis [4, 5], así como síntesis de proteasas [6 - 8] y de las prostaglandinas [9, 10]. Además, se ha demostrado que la IL-1 β promueve el proceso de la ovulación en la rata [11], el conejo [12] y la yegua [13]. IL-1 β aumenta in vitro la vesícula germinal desglose de los ovocitos en el modelo del conejo [12], así como in vivo en la yegua [13], lo que demuestra un papel beneficioso de la IL-1 β en la maduración de ovocitos nuclear. Estas observaciones llevaron a la conclusión de que la IL-1 puede ser un factor que es paracrinos involucrados en la ovulación y en la maduración de ovocitos nuclear. En 1994, Takehara et al., Demostró que la IL-1 β puede facilitar la fertilización in vitro en el conejo, lo que sugiere que la IL-1 pueden participar en la maduración de ovocitos citoplasmáticas y podría mejorar la fertilización. En la yegua, no hay datos disponibles sobre el efecto de la IL-1 β frente al citoplasma de los ovocitos en la fecundación o de las tasas de maduración. Sin embargo, un mejor conocimiento de los factores que intervienen en la regulación de estos procesos ayudaría a mejorar la producción de embriones en esta especie.

En este contexto, los objetivos del presente trabajo fueron a investigar in vivo en la yegua, el posible papel de la IL-1 β frente al citoplasma de los ovocitos en maduración, la ovulación y el desarrollo del embrión.

Materiales y métodos
Animales y Tratamientos

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Agencia Agraria y la Agencia de Investigación Científica (número A37801) y llevarse a cabo de conformidad con las directrices para el Cuidado y Uso de Animales en Agrícola Agrícola de Investigación y Docencia.

Adultos cíclico caballo yeguas en buena condición corporal, vivir en lugares cerrados y alimentados con concentrados, se utilizaron. Mares recibido un análogo de la prostaglandina F2 α (Cloprostenol [estrumate], 125 μ g / im yegua; Scherring-Plough, Levallois-Peret, Francia) durante la fase midluteal para inducir luteólisis. La actividad ovárica fue evaluada por la ecografía de rutina rectal. Intrafollicular inyecciones se realizaron en el folículo dominante, entre 30-34 mm de diámetro, al final de la fase folicular (véase más adelante). Antes de intrafollicular inyecciones o punciones, las yeguas fueron sedados con detomidine (0,6 mg/100 kg de peso corporal [BW] iv, Domosedan; Pfizer, Amboise, Francia) y propantheline bromuro (3 mg/100 kg iv BW; Sigma, St Louis , MO), se administró rectal para lograr la relajación. Intrafollicular Después de la inyección o pinchazos, yeguas fueron tratados con un antibiótico (Intramicine, 1600000 UI penicillin/100 BW kg y 1,3 g kg BW dihydrostreptomycin/100 im; Sanofi, Libourne, Francia).

Equinos bruta de gonadotropina (CEG) se ha preparado a partir de pituitaries caballo que se suministra comercialmente. La consiguiente preparación de CEG figura aproximadamente un 6% de caballos de LH y FSH 2-4% caballo. Iv una inyección de 15 mg CEG se realizó cuando el diámetro del folículo dominante alcanzó 30-34 mm con el fin de inducir la ovulación. La ovulación ocurre entre 35-40 horas después de la inyección [14]

Intrafollicular procedimiento de inyección

La inyección se realiza mediante un ultrasonido transvaginal guiada sistema. A 60 cm de largo solo lumen de la aguja de 1,1 mm de diámetro exterior se insertó en el folículo dominante el día en que llegó a 30-34 mm de diámetro. Líquido folicular (2,5 ml) fue aspirada en una jeringa conectada directamente a la aguja. La molécula se estudió diluida en 2 ml de PBS (Dulbecco 'A'; Unipath, Dardilly, Francia) y mantenido a 37 ° C. El 2 ml fueron inyectados en el folículo utilizando una jeringa conectada directamente a la aguja. Líquido folicular (0,5 ml) de la primera jeringa se inyecta de nuevo en el folículo a rince la aguja y restablecer el volumen inicial folicular.

Diseños Experimentales

En el experimento 1, 61 yeguas cíclico se utilizaron. Ellos se dividieron en cinco grupos. Mares del primer grupo (grupo control negativo, n = 12) recibió una inyección intrafollicular (si), de 2 ml de PBS y una inyección yugular (iv) de 5 ml de solución salina. Mares del segundo grupo (IL-1RA grupo; n = 12) recibió una inyección de 2 si ml humana recombinante de la interleukina-1RA (2,5 μ g / ml en PBS, rhIL-1RA; Sistema de I + D, Abingdon, Reino Unido) y un iv La inyección de 5 ml de solución salina. Mares del tercer grupo (IL-1 β grupo; n = 13) recibió una inyección de 2 si ml humana recombinante de IL-1 β (0,5 μ g / ml en PBS, rhIL-1 β; Sistema de I + D) y una inyección iv de 5 ml De la solución salina. Mares del cuarto grupo (grupo control positivo; n = 12) recibió una inyección en caso de 2 ml de PBS y una inyección iv CEG, de 15 mg en 5 ml de solución salina. Mares del último grupo (IL-1RA/CEG grupo; n = 13) recibió una inyección de 2 si ml humana recombinante de la interleukina-1RA (2,5 μ g / ml en PBS, rhIL-1RA) y una inyección iv de 15 mg CEG En 5 ml de solución salina.

En el experimento 2, 63 yeguas cíclico se utilizaron. Ellos se dividieron en tres grupos. Mares del primer grupo (grupo control positivo; n = 23) recibió una inyección en caso de 2 ml de PBS y una inyección iv CEG, de 15 mg en 5 ml de solución salina. Mares del segundo grupo (IL-1 β grupo; n = 25) recibió una inyección de 2 si ml humana recombinante de IL-1 β (0,5 μ g / ml en PBS, rhIL-1 β; Sistema de I + D) y una inyección iv de 5 ml De la solución salina. Mares del último grupo (grupo control negativo, n = 15) recibió una inyección en caso de 2 ml de PBS y una inyección iv de 5 ml de solución salina.

Inseminación artificial, detección de la ovulación y el embarazo Diagnóstico

Mares de experimento 1 fueron inseminadas con semen fresco extraído de una fértil semental, con 200 × 10 6 espermatozoides por inseminación. Inseminaciones se realizaron en el día de la inyección intrafollicular, en el día después y cada 2 días hasta la ovulación del folículo inyectado. La ovulación se evaluó ultrasonographically dos veces al día desde las 8 h después de la ovulación hasta intrafollicular inyección (es decir, la ausencia de un gran folículo dominante y la presencia de un cuerpo lúteo). Catorce días después de la ovulación, diagnóstico de preñez fue realizado por ecografía de rutina del útero.

Cumulus Oocyte Complejo (COC) de Recuperación y Análisis

AOC se obtuvieron de inyectado folículos de experimento 2. Ecografía transvaginal guiada por aspiración se utilizó 38 h después de la inyección intrafollicular, como ha sido descrito previamente [15]. En pocas palabras, un solo lumen aguja (1,8 mm de diámetro exterior) se utilizó para el aspirado de líquido folicular. El folículo es entonces enjuagarse varias veces con PBS que contenía heparina (2,5 UI / ml; LEO SA, St Quentin Yvelines, Francia) a 37 ° C y raspó con la aguja, a fin de recoger el ovocito. Todos los fluidos de aspiración se examinaron con estereoscópica para la recuperación de los ovocitos. Células del cumulus fueron eliminados de la ovocitos por repetido pipeteo y posterior tratamiento con 1% hialuronidasa (tipo III, 875IU/mg; Sigma, La Verpillère, Francia). Los ovocitos fueron incubados durante 30 min a 37 ° C en PBS que contenía 3% de BSA y 280 nM MitoTracker Orange CMTM Ros (Molecular Probes, Oregon, EE.UU.) para la detección de las mitocondrias. Luego, los ovocitos fueron lavados tres veces en el pre-calentado PBS sin BSA. Los ovocitos fueron fijados por 20 min a 37 ° C utilizando recién preparada 2,5% paraformaldehido en PBS. Después de la fijación, los ovocitos fueron lavados tres veces en PBS. Los ovocitos fueron permeabilized en Triton X-100 (Sigma), 0,1% en PBS, durante 5 minutos a temperatura ambiente y se lavan en PBS. Los ovocitos fueron incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente en 100 μ g / ml de isotiocianato de fluoresceína conjugado maní crioaglutininas en la solución de lavado (PBS conteniendo 0,05% NaN 3 y 1 mM PMSF) para detectar la distribución de los gránulos corticales. Después de lavado, los ovocitos fueron manchadas de 1 μ g / ml bis-benzimide (Hoechst 33342; Sigma) en PBS durante 6 minutos a temperatura ambiente para la detección de ADN. Posteriormente fueron montadas entre diapositiva y diapositiva cubrir, en una mezcla de Moviol V4-88 (133 mg / ml; Hoechst, Frankfurt, Alemania) y de n-propilo galato (5 mg / ml, Sigma). Las diapositivas se mantuvieron a 4 ° C en la oscuridad hasta la observación. Los ovocitos fueron observadas bajo un microscopio de escaneo láser confocal (Olympus, Francia). Mitocondrias y gránulos corticales etiquetado se visualizan en el modo confocal, mientras que Hoechst se detectó por tinción convencional epifluorescence. Por fluoresceína, un láser de iones de argón ajustar en la emisión de 525 nm de longitud de onda se utilizó; para MitoTracker Orange CMTM Ros, una de iones de helio-neón láser ajustado a 576-nm se utilizó.

Análisis estadístico

Con técnicas de las pruebas de Kruskal-Wallis y Wilcoxon-Mann-Withney se realizaron mediante el software StatXact 5 (CYTEL, Cambridge, MA http://www.cytel.com] con el fin de comparar el tiempo de la ovulación y el porcentaje de embriones. El corregida prueba de chi-cuadrado se utilizó para comparar los ovocitos in vivo tasas de maduración.

Resultados
Experimento 1: Efecto de la IL-1 β e IL-1RA intrafollicular inyección en la ovulación y el desarrollo del embrión

Durante este experimento, 61 folículos fueron inyectados. Doce a trece yeguas fueron utilizados por grupo, en 5 grupos.

Experimento 2: Efecto de la IL-1 β sobre ovocitos nucleares y citoplasmáticas de maduración

Cumulus Oocyte Complejo recuperación y Oocyte nuclear en fase de recuperación

En este experimento, se constituyeron 3 grupos: grupo control positivo, la IL-1 β grupo, el grupo control negativo. Veinte tres a 25 yeguas fueron utilizados en los 2 primeros grupos y 15 yeguas se utilizaron en el tercer grupo. De los sesenta y tres inyectado folículos que se perforan, 52 ovocitos fueron recogidos y analizados. Esto corresponde a 82,5% de tasa de recaudación. La tasa de recaudación fue similar en cada grupo (cuadro 2]. Todos aspirado AOC ha ampliado cumuli.

Como se muestra en el Cuadro 2, la tasa de ovocitos que muestran reanudación de la meiosis fue significativamente mayor en el grupo control positivo (PBS si, CEG iv) que en el grupo control negativo (PBS si, salina iv, p <0.04). Los otros eran o bien ovocitos inmaduros o degenerado. Además, el 60% de los ovocitos de la IL-1 β grupo pantalla reanudación de la meiosis, que tiende (p <0,1) a ser más elevado que en el grupo control negativo.

Discusión

El objetivo del presente trabajo fue analizar in vivo el efecto de la IL-1 β e IL-1RA, intrafollicular después de su inyección en el folículo preovulatorio. En el experimento 1, la ovulación y el desarrollo del embrión se estudiaron. En el experimento 2, el efecto de la IL-1 β sobre ovocitos nucleares y citoplasmáticas de maduración se investigó.

Intrafollicular La técnica de inyección es una alternativa interesante para estudiar el efecto de un factor en la maduración de ovocitos y folículo. Se ha utilizado en diferentes especies como conejo [16], [17] oveja, de vaca [18], el mono rhesus, [19], y yeguas [13, 15, 20, 21]. En la yegua, este método no requiere de la cirugía debido a que el gran tamaño del folículo preovulatorio y la presencia de una túnica albugínea, que permite la inyección de folículos con fugas limitado por el uso de la ecografía transvaginal eco-guiada método. En el presente trabajo, 103 preovulatorio folículos fueron inyectados con éxito y sólo el 5 sufrido graves daños.

En nuestro estudio, 1 μ g IL-1 β se inyectó en el folículo. Esta dosis se ha elegido en relación con un estudio dependiente de la dosis que se han realizado in vitro [22], y puesto a prueba in vivo [13]. Del mismo modo, la dosis de IL-1RA hemos utilizado en el presente estudio (5 μ g) se eligió de acuerdo a un previo estudio in vivo [13], donde 1 μ g IL-1RA no tuvo ningún efecto.

Hemos demostrado en el presente trabajo, que la intrafollicular inyección de IL-1 β sincronizada ovulación inducida. De hecho, la IL-1 β dio el mismo resultado, en términos de distribución de la ovulación, como la inyección iv de CEG [14]. Esta observación está de acuerdo con el reciente trabajo realizado por Martoriati et al. [13]. CEG es un extracto de pituitaria utiliza para inducir la ovulación en la yegua. Por su actividad LH, CEG se utiliza para dar un momento preciso de la ovulación. Es utilizado preferentemente en esta especie en lugar de hCG, que se sabe que inducen immunoreaction después de las sucesivas inyecciones. Si bien, los mecanismos por los que la IL-1 regula la maduración folicular no es clara, nuestras observaciones sugieren que el sistema de la IL-1 podría participar en eventos periovulatory. Así, el mecanismo de acción de la IL-1 β aún no se ha dilucidado, pero podemos hipótesis de que el aumento de la IL-1 β intrafollicular nivel después de la inyección local de Mayo imita la preovulatorio eventos que preceden a la ovulación.

Hipótesis que explica la razón por la que constituye la IL-1RA-CEG grupo, en la que el intrafollicular inyección de IL-1RA sería capaz de bloquear el efecto CEG. Después de ese tratamiento (IL-1RA si CEG y iv), se observó que la mitad de yeguas ovularon más de 47 horas después de las inyecciones. En tales yeguas, podemos concluir que o bien CEG no tuvo ningún efecto (que es poco probable en este tipo de cambio), o que el intrafollicular inyección de IL-1RA en que la dosis utilizada, inhibe la ovulación efecto de la CEG. Otras yeguas de este grupo ovularon entre 31 y 47 h después de la inyección. En esos mares y en nuestras condiciones experimentales, IL-1RA no inhibió el efecto CEG ovulatoria. Estas yeguas probablemente tuvo el proceso de la ovulación participan (es decir, aumento en la concentración plasmática endógenos de LH) antes de la IL-1RA y CEG inyecciones. Los datos que hemos obtenido de la IL-1RA-CEG grupo están de acuerdo con un estudio anterior realizado en la rata, lo que demuestra una vez dependen de la inhibición de la ovulación inducida por hCG por IL-1RA [23].

Como se demuestra en el presente trabajo, el 60% de los ovocitos recogidos 38 h después de la IL-1 β intrafollicular inyección mostradas reanudación de la meiosis. Esta tasa sólo tiende a ser más elevada que la del grupo control negativo (p <0,1). Este resultado es consistente con nuestros resultados anteriores obtenidos en la yegua (57%) [13]. En conjunto, ambos estudios implican un efecto positivo de la IL-1 β equina en la maduración de ovocitos nuclear.

Teniendo en cuenta este resultado, es cuestionable si luego ovularon equina ovocitos maduros obtenidos después de un intrafollicular inyección de IL-1 β fueron capaces de ser fertilizados. La muy baja tasa de desarrollo del embrión que se observó en nuestro estudio después de la IL-1 β intrafollicular la inyección (25%) nos lleva a la hipótesis que la IL-1 β puede tener un efecto negativo sobre la calidad de los ovocitos.

Pusimos a prueba esta hipótesis a través del análisis de metafase II (MII) de los ovocitos de gránulos corticales de localización y distribución de las mitocondrias como criterios para la maduración citoplásmica. A nuestro entender, este es el primer estudio del efecto de la IL-1 β frente al citoplasma de los ovocitos en maduración que se ha realizado in vivo en cualquiera de las especies. En varios mamíferos, se ha informado de que los gránulos corticales son principalmente el revestimiento oolemma de ovocitos en el momento de la ovulación (en ovejas [24]; en bovinos [25 - 27]; equina en [28]]. En nuestro estudio, la migración cortical gránulos se logró o en curso en la mayoría de los ovocitos MII positiva grupo de control (grupo CEG). En cambio, los gránulos corticales no oolemma la línea en la mayoría de los ovocitos MII de la IL-1 β inyectado folículo, pero se mantuvo homogéneamente distribuidos en el citoplasma. Estos datos sugieren que en nuestro estudio, la IL-1 β no pudo inducir a la migración cortical granulado, y por lo tanto, a participar plenamente en la maduración de ovocitos citoplásmica. Los factores adicionales pueden ser necesarios para la migración cortical gránulos.

La distribución de las mitocondrias en ovocitos MII fue estudiada como un segundo criterio de maduración citoplásmica. Dos mitocondrial se observaron pautas de distribución de los ovocitos en equinos. Los ovocitos de los del grupo control positivo (CEG grupo) mostraron una agrupación de alrededor de las mitocondrias vacuolas citoplasmáticas (patrón heterogéneo), que es la observación de acuerdo con estudios anteriores (bovina [29]; humanos [30, 33, 34]; porcina [31 , 32]]. El segundo patrón de distribución mitocondrial que se observó principalmente de los ovocitos de la IL-1 β grupo. En estos ovocitos, mitocondrias muestras de una distribución homogénea. Ese patrón homogéneo de la mitocondria ha sido previamente observado en ovocitos inmaduros porcina [32]. Estos datos sugieren que en condiciones experimentales, la IL-1 β no es capaz de inducir la remodelación de la mitocondria, que ocurre durante la maduración de los ovocitos.

En total, mientras que la IL-1 β parece ser capaz de actuar sobre la reanudación de la meiosis, no es suficiente para completar la maduración de ovocitos citoplásmica, por lo menos en la yegua.

Para ser fecundado, un óvulo tiene que ser madura hasta su núcleo y su citoplasma. Por lo tanto, se podría proponer que el bajo número de embriones concebidos después de la IL-1 β intrafollicular inyección podría ser probablemente debido a un anormal citoplásmica maduración de los ovocitos. Este resultado está en agudo contraste con un estudio anterior realizado en conejo perfundidos ovario, en el que la IL-1 β facilitado la fertilización [12]. Sin embargo, estos autores informaron que la mayoría de ovocitos fecundados fueron detenidos en la etapa de cuatro células. En cuanto a los resultados de este trabajo, dos hipótesis pueden ser propuestos para explicar nuestros resultados. La primera es que la IL-1 β es capaz de actuar sobre la reanudación de la meiosis, pero no puede lograr la maduración citoplásmica. La consecuencia es que los ovocitos no son adecuados para la fertilización. La segunda hipótesis es que la IL-1 β Mayo ejercer un efecto tóxico sobre los ovocitos, que permita la fecundación, pero impedir posterior desarrollo embrionario. En nuestro estudio, el diagnóstico de preñez se realizó 14 días después de la ovulación, que no permiten verificar una de estas dos hipótesis. Para aliviar este problema, la fertilización in vitro (FIV) puede ser realizada en la IL-1 β-inducida ovocito madurado.

Conclusión

En conclusión, el mecanismo por el cual la IL-1 β actos en el nivel de ovario no es clara, y los datos actuales tienden a demostrar que la IL-1 β por sí sola no es capaz de promover la maduración citoplasmática de los ovocitos equina, y, por tanto, para permitir el desarrollo del embrión. Sin embargo, la IL-1 β pueden desempeñar un papel fundamental en la fisiología de equina ovocitos por meiosis que actúe en la reanudación, así como en la función ovárica mediante la inducción de la ovulación.

Contribuciones de los autores

MC participó en la concepción del estudio, coordinado y participado en el procedimiento experimental, analizó los resultados y redactó el manuscrito. GD llevado a cabo y coordinado de los procedimientos experimentales. NG concibe el estudio, participaron en su diseño y al procedimiento experimental. NG participado en el análisis final de los resultados y corregir el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

El apoyo financiero

Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones del Institut National de la Recherche Agronomique, Francia, y el Haras Nacionales, Francia. Maud Caillaud fue apoyado por una beca de la Región Centro, Francia y el Haras Nacionales, Francia.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Cécile Lahuec, Carine Rouchez, Ophélie Dhumez, Bernard Bruneau y el personal de los estudios experimentales para la asistencia técnica. Damos las gracias a Jean-Marie Michèle Dr Yvon y Magistrini preparación de los espermatozoides para la inseminación artificial, al Sr Pierre-Yves Sizaret, que nos enseñó la manipulación de la microscopio confocal, al Dr H. Torner (de Dummerstorf, Alemania), quien dio Nosotros, el protocolo de etiquetado de las mitocondrias.