Cancer Cell International, 2005; 5: 22-22 (más artículos en esta revista)

La resistencia multidroga-Associated Protein 1 (MRP1) mediada vincristina resistencia: efectos de la N-acetilcisteína y Buthionine Sulfoximine

BioMed Central
Ilhan akan (ilhan@temple.edu) [1], Selma akan (selmayenisoy@yahoo.com) [1], Hakan Akca (hakanakca@yahoo.com) [2], Burhan Savas (savasb@akdeniz.edu.tr) [3], Tomris Ozben (ozben@akdeniz.edu.tr) [1]
[1] Akdeniz University, Faculty of Medicine, Department of Biochemistry, 07070 Antalya, Turkey
[2] Pamukkale Universidad, la Facultad de Arte y Ciencias, Departamento de Biología, Denizli, Turquía
[3] Akdeniz University, Faculty of Medicine, Department of Internal Medicine, Division of Oncology, 07070 Antalya, Turkey

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Resumen
Antecedentes

La multirresistencia mediación de la multirresistencia proteína asociada a 1 (MRP1) disminuye la acumulación celular de drogas. El mecanismo exacto de MRP1 participan multirresistencia no se ha aclarado todavía, aunque glutatión reducido (GSH) es probable que tenga un papel de la resistencia a ocurrir. N-acetilcisteína (NAC) es una pro-droga glutatión. DL-Buthionine (S, R)-sulfoximine (BSO) es un inhibidor de la síntesis de GSH. El objetivo de nuestro estudio fue investigar el efecto de la NAC y la BSO de MRP1 mediada vincristina en la resistencia Humanos embrionarias Riñón (HEK293) y su MRP1 transfectadas 293MRP células. Embrionarias Humanas Riñón (HEK293) células fueron transfectadas con un plásmido codifica toda la gen MRP1. Tanto las células fueron incubadas con vincristina en la presencia o ausencia de NAC y / o BSO. La viabilidad de las dos células se determinó bajo diferentes condiciones de incubación. GSH, Glutatión S-Transferase (GST) y glutatión peroxidasa (GPx), se midieron los niveles en la célula extractos obtenidos de las dos células incubadas con diferentes drogas.

Resultados

N-acetilcisteína aumento de la resistencia de las células contra la vincristina y la disminución de BSO-NAC mayor MRP1 mediada vincristina resistencia, lo que indica que la inducción de la MRP1 mediada vincristina resistencia depende de GSH. Vincristina disminución de la concentración de GSH celular y el aumento de la actividad GPx. Glutatión S-Transferase actividad se redujo en NAC.

Conclusión

Nuestros resultados demuestran que la NAC y BSO tienen efectos opuestos en MRP1 mediada vincristina y resistencia BSO parece un prometedor agente de la mejora de la quimioterapia en las células tumorales MRP1 overexpressing.

Antecedentes

La adquisición de la resistencia a los agentes contra el cáncer utilizados en la quimioterapia es la principal causa de fracaso del tratamiento en los trastornos malignos, lo que provocó a convertirse en tumores resistentes durante el tratamiento, a pesar de que inicialmente responden a la misma [1 - 4]. La resistencia de las células cancerosas a una sola droga es generalmente acompañada de resistencia a otros fármacos con diferentes estructuras celulares y objetivos [3, 4]. Identificación de los mecanismos conducentes al intrínseco o adquirido multirresistencia (MDR) es importante en el desarrollo de terapias más eficaces. Por lo menos, dos proteínas son conocidas por causar MDR. Ambas proteínas, el gen MDR1-Pgp codificados y MRP1 son miembros de la ATP vinculante cassette transportista superfamilia. A pesar de su participación común en la MDR, hay claras diferencias en la función y la especificidad de sustrato de Pgp y MRP1 [5]. Pgp transporta neutral, o carga positiva, hidrofóbicas compuestos [5]. En cambio, MRP1 extrusión aniones orgánicos conjugados de las células y que se conoce como multispecific aniontransporter (MOAT) [4, 6, 7]. El mecanismo exacto de MRP1 participan multirresistencia sigue siendo desconocida, aunque GSH es probable que tenga un papel de la resistencia a ocurrir. Por lo tanto, clarificar el mecanismo de acción de MRP1 en líneas celulares ortumors overexpressing MRP1 y en la búsqueda de inhibidores del transporte de drogas puede dar nuevas perspectivas en el futuro experimentos y terapias.

La multirresistencia de proteínas (MRP1) mediada la resistencia a los medicamentos contra un amplio espectro de productos naturales como medicamentos vincristina, aunque los mecanismos no se han entendido con exactitud y no se ha podido demostrar que puede MRP1 activamente transporte sin modificar las formas de vincristina [8]. Vincristina es un vinca alcaloid tipo de drogas y un agente de quimioterapia ampliamente utilizado para el tratamiento de la leucemia aguda y tumores sólidos [9]. Flujo de salida de la hidrofóbicas producto natural medicamentos contra el cáncer, tales como los agentes de la vincristina de las células que expresan MRP1 Se cree que requieren GSH [10, 11]. La naturaleza de la participación de GSH no está totalmente aclarado, aunque co-transporte de GSH se cree ahora que se celebre [8, 10, 12]. GSH es el más abundante no contengan proteínas intracelulares compuestos tiol que es una molécula clave en MRP1 mediada MDR [3, 13]. Se demostró que la ATP-dependientes de la captación de vincristina por MRP-enriquecido, en el interior de las vesículas de membrana puede ser estimulada por concentraciones fisiológicas de GSH [14]. Se sugiere que el aumento de MRP1 expresión sin un aumento de la biosíntesis de GSH no habría producido ninguna resistencia a los medicamentos en las células tumorales, sino que daría lugar a la muerte celular [15]. GSH conjugados con drogas catalizada por la enzima GST y las causas de su posterior eliminación de las células [15]. BSO GSH inhibe la síntesis de la inhibición irreversible de γ-glutamil cisteína sintasa y no tiene efectos conocidos sobre otras células [3, 11, 16]. N-acetilcisteína es un tiol antioxidante y fuente de cisteína para la síntesis de GSH [17]. El estudio tenía por objeto definir el mecanismo de acción de vincristina y los efectos de la NAC y la BSO de MRP1 mediada vincristina en la resistencia Humanos embrionarias Riñón (HEK293) y su MRP1 transfectadas 293MRP células. Con este fin, HEK293 y 293MRP células fueron incubadas con vincristina en la presencia o ausencia de NAC y / o BSO. Vincristina citotoxicidad, la viabilidad celular y el efecto de la vincristina sobre los niveles de GSH celular, GST y GPx actividades enzimáticas se determinaron en los dos grupos de células en la presencia o ausencia de NAC en dos concentraciones diferentes.

Resultados

Western Blot análisis utilizando QCRL-1 monoclonal anti-MRP1 demostrado MRP1 expresión de anticuerpos en las células 293MRP, a diferencia de las células HEK293 (Fig 1].

Actividad citotóxica de vincristina

Los experimentos se repitieron 3 veces y los resultados obtenidos de estas repeticiones fueron en promedio. El efecto citotóxico de las distintas concentraciones de vincristina de las células HEK293 se muestra en la Figura 2. La concentración letal (DL 50), de vincristina se encontró como 0,156 μ g / ml en células HEK293 método utilizando cristal violeta (Fig 2]. Esta concentración de vincristina se aplicó para la incubación de las células.

Efectos de las NAC en vincristina citotoxicidad

La viabilidad de las células HEK293 y 293MRP tratados con vincristina fue significativamente inferior a las respectivas células control sin tratar (11,4 ± 2,3% y 52,4 ± 5,2%, respectivamente, p <0,5) (Fig. 3]. 293MRP células son más resistentes a la vincristina de las células HEK293. El nivel más bajo se observó la viabilidad celular en células HEK293. Ambas células se incubaron con 1 o 5 mM NAC en la presencia de vincristina. N-acetilcisteína en ambas concentraciones aumentado en forma significativa la resistencia de las células HEK293 y 293MRP contra vincristina citotoxicidad en comparación con sus respectivas células control sin tratar (p <0,05). La viabilidad de las células HEK293 aumentó significativamente (p <0,05) de 11,4 ± 2,3% a 31,1 ± 4,1% con 1 mM de NAC y 37,5 ± 4,7% con 5 mM NAC. La viabilidad de las células 293MRP aumentó significativamente (p <0,05) de 52,4 ± 5,2% a 57,2 ± 5,4% con 1 mM de NAC y al 70,1 ± 6,2% con 5 mM NAC. No hubo diferencias significativas entre la viabilidad de las células HEK293 tratados con dos concentraciones de NAC, pero NAC 5 mM fue más eficaz en 293MRP células frente a la NAC 1 mM (p <0,05).

Efecto de la BSO de vincristina citotoxicidad y la supervivencia de la promoción de la acción NAC

Las células fueron pretratadas con 100 μ M BSO durante 24 horas antes de los tratamientos medicamentosos. La viabilidad de las células HEK293 y 293MRP pretratadas con BSO no fue significativamente diferente (85 ± 5,3% y 93 ± 6,1%, respectivamente. P> 0,05) (Fig. 4]. Después de la inhibición de la síntesis de GSH con BSO, 293MRP células perdieron la vincristina resistencia significativamente de 52,4 ± 5,2% a 19,0 ± 1,9% (p <0,05) (Fig. 4]. El pretratamiento con BSO no afectará a la viabilidad de las células HEK293 tratados con vincristina (11,4 ± 2,3% vs 10,2 ± 1,2%). N-acetilcisteína, tanto en el aumento de las concentraciones significativamente la viabilidad de 293 MRP células pretratadas con BSO contra vincristina (de 19,0 ± 1,9% a 33,6 ± 5,4 con 1 mM de NAC y al 40,5 ± 6,2% con NAC 5 mM). Aumento similar se observó en células HEK293 en las mismas condiciones (del 10,2 ± 1,2% a 19,2 ± 2,4 con 1 mM de NAC y al 29,9 ± 3,2% con NAC 5 mM). El pretratamiento con BSO antagoniza parcialmente los aumentos de la viabilidad de las células causados por el tratamiento con NAC en comparación con los aumentos causados por NAC sola (Figura 3 y Figura 4]. En otras palabras, el aumento de NAC menos la viabilidad de las células pretratadas con BSO de las células tratadas con NAC sólo contra vincristina.

Efecto de la vincristina y la NAC sobre las concentraciones de GSH celular

GSH celular se midieron los niveles después de las 24 y 48 horas vincristina tratamientos en la presencia o ausencia de NAC en dos concentraciones diferentes. GSH concentraciones celulares no fueron diferentes en el control sin tratar HEK293 y 293MRP células (80,2 ± 4,6 μ g -1 mg de proteína y 84,6 ± 4,9 μ g mg proteína -1, respectivamente) (Fig. 5]. Disminución de los niveles de glutation no significativamente después de 24 - y 48-h vincristina tratamientos en células HEK293 de 80,2 ± 4,6 μ g mg proteína -1 a 75,9 ± 3,8 μ g -1 mg de proteína y 72,2 ± 3,5 μ g -1 mg de proteína (p> 0,05 ) Y en 293MRP células de 86 ± 4,9 μ g mg proteína -1 a 72,4 ± 3,4 μ g -1 mg de proteína y 64,9 ± 3,2 μ g -1 mg de proteína (p <0,05). N-acetilcisteína en ambas concentraciones causó un aumento significativo en las concentraciones de GSH en las células tratadas con vincristina por tanto los tiempos de incubación, en comparación con los no tratados de control de las líneas celulares y células tratadas con sólo vincristina (p <0,05) (Fig. 5].

Efecto de la vincristina y la NAC en la actividad celular de Glutatión S-Transferase y Glutation Peroxidase

Glutatión S-Transferase actividad de control sin tratamiento en ambas líneas celulares no fue significativamente diferente. 48 horas, pero no 24 horas de incubación con vincristina GST aumentó significativamente la actividad en las dos líneas celulares para la comparación de las correspondientes células control sin tratar (Fig. 6]. N-acetilcisteína (1 mM) durante 48 horas provocó una disminución significativa en la actividad de GST en 293MRP células HEK293 y en comparación con el control nontreated células y las células tratadas con vincristina sólo para los tiempos de incubación. 5 mM NAC, tanto en los tiempos de incubación causado una disminución significativa en la actividad de GST en las dos líneas de células en comparación con nontreated control de las células, las células tratadas con vincristina y sólo las células tratadas con vincristina + NAC (1 mM) en los dos tiempos de incubación (fig. 6].

No hubo diferencias significativas en la actividad GPx entre HEK293 y 293MRP células (2,4 ± 0,2 UI mg -1 proteína y 2,2 ± 0,1 UI mg proteína -1, respectivamente) (Fig. 7]. No significativo aumento de la actividad GPx se observaron después de la vincristina tratamiento para ambos los tiempos de incubación en HEK293 (2,8 ± 0,3 UI mg -1 proteína de 24 h de incubación y vincristina 3,1 ± 0,3 UI mg -1 proteína de 48 h de incubación vincristina) y células 293MRP (2,6 ± 0,2 UI mg -1 proteína de 24 h de incubación vincristina y 3,0 ± 0,3 UI mg -1 proteína de 48 h de incubación vincristina), en comparación con las células control sin tratar (p> 0,05). N-acetilcisteína (1 mM) de incubación de 24 y 48 horas GPx aumento de la actividad en ambas líneas celulares en comparación con las células control sin tratar. NAC 5 mM de incubación de 24 y 48 horas aumentó significativamente la actividad GPx en HEK293 y 293MRP células en comparación con los otros grupos de células (p <0,05) (Fig. 7].

Discusión

En nuestros experimentos, la viabilidad de las células transfectadas MRP1 (293MRP) de los tratados con vincristina fue superior a la de embriones humanos riñón (HEK293). Nuestros resultados están de acuerdo con O'Brien y los compañeros de trabajo que informó de que MRP1 confiere resistencia a la doxorrubicina, etopósido, vincristina y en fibroblastos NIH 3T3 línea celular [18]. Nuestros experimentos con N-acetilcisteína (NAC) y DL-Buthionine (S, R)-sulfoximine (BSO) mostró que MRP1 mediada vincristina resistencia depende en gran medida de GSH y esto es de acuerdo con los datos anteriores [3, 18, 19]. N-acetilcisteína, tanto en el aumento de las concentraciones de la tasa de supervivencia de vincristina tratados 293MRP células HEK293 y que ha aumentado los niveles de GSH que se confirma que la viabilidad depende del nivel de GSH (Figura 3 y Figura 4]. Después de la inhibición de la síntesis de GSH con BSO, 293MRP células perdieron la resistencia vincristina (Fig 4]. Resultados similares fueron descritos anteriormente en diferentes líneas celulares overexpressing MRP1 [3, 16].

Se comparó la viabilidad de las células tratadas con vincristina y NAC en la presencia y ausencia de BSO. N-acetilcisteína, tanto en el aumento de las concentraciones significativamente la viabilidad de las células HEK293 y 293MRP pretratadas con BSO contra vincristina, pero estos incrementos fueron menores en comparación con las correspondientes células no tratadas con BSO (Figura 3 y Figura 4]. El pretratamiento con BSO antagoniza parcialmente los aumentos de la viabilidad de las células causados por el tratamiento con NAC en comparación con los aumentos causados por NAC solo. En otras palabras, el aumento de NAC menos la viabilidad de las células pretratadas con BSO de las células tratadas con NAC sólo contra vincristina. Esto se podría explicar que el efecto BSO contrapesos de NAC como precursor de GSH. Esta es otra prueba de que la supervivencia de la promoción de la acción NAC depende de la síntesis de GSH y está de acuerdo con nuestros resultados anteriores con doxorubicina [1].

En nuestros experimentos, la concentración celular GSH disminuyó después de la vincristina tratamiento lo que podría deberse a eflujo de GSH (Fig. 5]. Mayor flujo de salida GSH ha reportado en las células que expresan MRP1 y este mayor flujo de salida puede ser inhibida por la indometacina y el probenecid [10]. Sugirieron que los cambios en las concentraciones de GSH y su forma oxidada GS-SG dentro de las células pueden influir en cada MRP1 mediada anión transporte. Además, la hipoxia o el estrés oxidativo puede causar el agotamiento de glutatión reducido (GSH). El aumento de estrés oxidativo ha informado de asociar a la tumorigénesis [20, 21], lo que puede desempeñar un papel en el agotamiento de GSH [22, 23]. Que a su vez puede afectar flujo de salida de las drogas. La mayor actividad GPx en células tratadas vincristina podrían ser un efecto compensatorio de las células contra el agotamiento de GSH (Fig. 6].

Se ha planteado la hipótesis de que la resistencia de vincristina myeloblasts es su degradación por mieloperoxidasa (MPO) [9]. Mieloperoxidasa (MPO) cataliza la formación de HOCl de H 2 O 2 y de iones de cloruro. Se demostró la oxidación por HOCl es el último paso en la degradación de vincristina en un sistema libre y de células en cultivos de líneas de células leucémicas. Oxidación de los fármacos anti-neoplásica puede causar una reducción de la eficacia o un aumento de la toxicidad. Esto podría conducir a una disminución en el índice terapéutico. La inhibición de la OPG en estos diferentes estados pudieran eliminar la enfermedad este intra y extracelular vía de la oxidación y podría aumentar el índice terapéutico.

La identificación de MRP1 como un importante glutatión-bomba de salida conjugada plantea la posibilidad de que MRP1 y GST pueden actuar en sinergia para conferir resistencia celular a algunos de estos compuestos [3, 14, 24, 25]. No está claro aún si es o glutatión co-transportados como SG-conjugado con vincristina o activa MRP1 vincristina para el transporte [4]. Los estudios hasta ahora mostró conjugación con GSH y extrusión no son la principal vía de [4]. Co-expresión con MRP1 de ninguna de las isoenzimas humanas GST A1-1, M1-1, o P1-1 no aumentar MRP1 asociada a la resistencia a los fármacos, incluyendo la doxorrubicina, vincristina, etopósido, mitoxantrona y [4, 24]. Esto podría ser una prueba de que no es vincristina conjugado con GSH, pero co-transportados con GSH en MRP1 mediada la resistencia a los medicamentos.

En nuestro estudio, la administración de suplementos de NAC GST disminuido el nivel de actividad en las dos líneas celulares (Fig. 7]. Esto se podría explicar que la NAC espontáneamente forma conjugados con vincristina, por lo tanto, disminuyendo la necesidad de que la actividad de GST conjugación. Aunque, no está claro si NAC espontáneamente conjugados con vincristina, se sabe que los ácidos mercapturic (N-acetilcisteína S-conjugados) se formaron espontáneamente, en libertad en la circulación y entregados a los de la excreción renal en la orina [26 - 28]. Del mismo modo, Weigand et al informaron de atenuación de la actividad GST después de la administración de suplementos de NAC [29].

Conclusión

Nuestros resultados demuestran que la NAC mejora la MRP1 mediada la vincristina y la resistencia de este efecto depende de la síntesis de GSH. DL-Buthionine (S, R)-sulfoximine parece un prometedor agente de la mejora de la quimioterapia en las células tumorales MRP1 overexpressing. Este hallazgo podría ser de interés y tener una implicación de los pacientes con cáncer sometidos a quimioterapia.

Métodos
Materiales

Dulbeccos' Modificado Eagles' Mediano (MEDM), NAC, BSO, geneticin, Feotal Suero Bovino (FBS), y otros productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich Corp St Louis, MO, EE.UU.. Vincristina se obtuvo del Departamento de Oncología del Hospital de la Universidad de Akdeniz. El plásmido (pcDNA3.1/MRPK) codificación de todo el gen MRP1 fue proporcionado amablemente por el Dr Susan Cole de Oueen's University, Ontario, Canadá. Kit de ensayo de proteínas se adquirió de Bio-Rad Laboratories Ltd, Herts, Reino Unido. Monoclonales anti-MRP1 QCRL-1 de anticuerpos se obtuvo de Centocor Inc, Malvern, PA, EE.UU.. Peroxidasa de rábano (HRP) conjugado coadyuvante de cabra anti-ratón de anticuerpos fue adquirido desde Santa Cruz de la Biotecnología Inc, Santa Cruz, CA, EE.UU..

Líneas celulares

De embriones humanos línea celular de riñón, HEK293, se cultiva en MEDM, complementado con 10% de SFB inactivado por calor, 2 mM L-glutamin, y un 1% de solución antibiótico-antimicótico. Los cultivos de células fueron mantenidas a 37 ° C en una atmósfera húmeda conteniendo 5% de CO 2.

Transfección

Células (1 × 10 6 células en el plato 100 mm) fueron transfectadas con el plásmido (pcDNA3.1/MRPK) codificación de todo el gen MRP1. La transfección se realizó conforme a la transfección método de fosfato de calcio [30]. Dieciséis horas después de la transfección, las células fueron alimentadas con MEDM complementado con 400 μ g / ml geneticin.

Preparación de la membrana y enriquecido fracciones immunoblotting

Por inmunotransferencia de la 293MRP y HEK293 células, la membrana enriquecido fracciones se prepararon de acuerdo a Grant et al [31]. En pocas palabras, pellet de células se resuspendió en la colección de amortiguación (10 mM Tris-HCL, pH 7,4, 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2 y los inhibidores de la proteasa), homogeneizada sobre el hielo en un Potter-Elvejhem tejido homogeneizadora. Las células intactas y núcleos fueron retirados por centrifugación a 800 g en +4 ° C, y el sobrenadante se centrifuga a 100000 g a +4 ° C durante 20 minutos para preparar la membrana enriquecido fracciones. El pellet se resuspendió en buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 125 mM sacarosa, y los inhibidores de la proteasa). La proteína se había mezclado con la suspensión solubilizing de amortiguación (4 M urea, 0,5% Sodiumdodecylsulphate (SDS), y 50 mM dithiotreitol), y cantidades iguales de proteínas fueron sometidos a SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide electroforesis en gel), el 7% geles de poliacrilamida, luego Transferir al nitrocelulosa hoja de la noche a la mañana a 40 voltios, y se analizaron por immunoblotting con MRP1 monoclonal anti-QCRL-1 anticuerpo.

Ensayos de viabilidad celular

Viabilidad celular fue ensayada mediante el método de cristal violeta [32]. 3 × 10 4 células fueron sembradas en un 96 y microplaca. Después de 24 horas, las células fueron incubadas con 0.06-1000 μ g / ml vincristina durante 72 horas. LD 50 de vincristina está decidido a ser 0,156 μ g / ml y esta dosis de vincristina se utilizó en el resto de los experimentos. Ambos HEK293 y 293MRP células fueron incubadas con vincristina (0,156 μ g / ml) en presencia o ausencia de NAC (1 y 5 mM) durante 72 horas a 37 ° C en una atmósfera húmeda conteniendo 5% de CO 2. Al final del período de incubación, el medio fue reemplazado por el 0,5% de cristal violeta-(w / v; en el 50% de metanol) solución. Las placas fueron incubadas durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavan con agua y colorante adsorbido se eluye con Na-citrato (0,1 M Na-citrato en el 50% de etanol, pH 4.2). Absorbancia, que es proporcional a la viabilidad de células, se medirá a una longitud de onda de 600 nm. Viabilidad celular se vigila como el porcentaje de células viables en comparación con el control, las células no tratadas. Por BSO experimentos, las células fueron pretratadas con 100 μ M BSO de 24 horas antes de incubar con vincristina con o sin NAC durante 72 horas, tal como se describe más arriba.

Preparación de la Célula Extracto de GSH y mediciones de Enzimas

Cell extractos se prepararon como se describe por Bravard et al con una ligera modificación [33]. 10 6 células fueron sembradas en un plato de cultivo de células y se incubaron durante 24 horas. Después de la incubación con vincristina en la presencia o ausencia de NAC durante 24 o 48 horas, fue dado de alta a medio y las células fueron lavadas con buffer fosfato salino (PBS), recogidos en buffer fosfato de potasio (50 mM, pH 7.4) con células rascador y repetidamente bloqueado Y descongelado en nitrógeno líquido para cuatro veces y, a continuación, se centrifuga a 10000 g durante 10 minutos a 4 ° C. El sobrenadante se utilizó para actividades de la enzima GSH y mediciones. Se determinaron las concentraciones de proteína utilizando proteínas Bio-Rad kit de ensayo. Todas las mediciones se ajustaron con dividiendo el contenido en proteínas de cada muestra.

Glutatión reducido de ensayo

Celular GSH Se determinaron las concentraciones de lo descrito por Virgilio et al [34]. En pocas palabras, el sobrenadante fue desproteinizado y GSH contenido fue supervisado por espectrofotometría con 5-5 'dithiobis (ácido 2-nitrobenzoic) (DTNB) a una longitud de onda de 412 nm. La concentración de GSH se evaluó utilizando un estándar de la curva conocida cantidades de GSH. Los resultados se expresan como μ g / mg de proteína.

Glutatión S-transferasa actividad de ensayo

Glutatión S-Transferase (GST), la actividad se midió en 340 nm de longitud de onda en presencia de 1-cloro-2 ,4-dinitrobenzene (CDNB), el GSH y buffer fosfato de sodio (pH 6.5) a 30 ° C durante 6 minutos [33, 35]. Los resultados se expresan como Δ OD / mg de proteína.

Ensayo de la actividad glutation peroxidasa

Glutation Peroxidase (GPx), la actividad se determinó a través de una modificación del método de Paglia y Valentine [36]. En una cubeta de mantenerse a 37 ° C, se vigila la actividad GPx en 340 nm de la absorbancia de nicotinamida adenina dinucleotide fosfato (NADPH) por 3 minutos en presencia de glutatión reductasa (0,5 UI), EDTA (0,3 mM) y t-butilados Hidroperóxido (0,4 mM). Los resultados se expresan en UI / mg de proteína.

Análisis Estadístico

El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Anova envasados programa SPSS para Windows, versión 10.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, EE.UU.). Todos los experimentos se repitieron tres veces. Los valores medios y las desviaciones estándar (media ± DE) fueron calculados para cada variable en cada grupo de células y se compararon entre los grupos. P <0,05 fue seleccionado como estadísticamente significativa.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

IA, SA y HA llevado a cabo el cultivo de células de estudios, transfección, immunoblotting, ensayos de viabilidad, y de la enzima GSH mediciones en la celda extractos. A BS y participó en el diseño del estudio y realizó el análisis estadístico, la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación de la Universidad de Akdeniz.