Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 7-7 (más artículos en esta revista)

Colocalización de TNF endógeno con un empalme forma funcional intracelular de los receptores de TNF humano tipo 2

BioMed Central
Christoph Scherübl (christoph.scheruebl @ klinik.uni-regensburg.de) [1], Wulf Schneider-Brachert (wulf.schneider @ klinik.uni-regensburg.de) [2], Stephan Schütze (schuetze@immunologie.uni-kiel . De) [3], Thomas Hehlgans (thomas.hehlgans @ klinik.uni-regensburg.de) [1], Daniela N Männel (daniela.maennel @ klinik.uni-regensburg.de) [1]
[1] Universidad de Regensburg, Instituto de Inmunología
[2-93042 Regensburg
[3] Hospital Universitario de Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Instituto de Inmunología, D-24105 Kiel, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Factor de necrosis tumoral (TNF) es una citocina pleiotrópica que participan en un amplio espectro de la respuesta inmune inflamatoria y la proliferación, diferenciación y muerte celular. Los efectos biológicos del TNF están mediadas a través de dos receptores de la superficie celular del TNF: p55TNFR (TNFR1; CD120a) y p75TNFR (TNFR2; CD120b). Formas solubles de los receptores de estos dos que consta de los dominios extracelulares son proteolytically cleaved de la membrana y actúan como inhibidores. Una novela p75TNFR isoforma generados por el uso de un nuevo sitio web inicial transcripcional ha sido descrito y que se denominó hicp75TNFR. Nos centramos en la caracterización de esta nueva isoforma de esta proteína pueden estar involucrados en los procesos inflamatorios crónicos.

Métodos

Líneas celulares fueron retroviraly transduced con hp75TNFR isoformas. Localización subcelular y colocalización con TNF estudios se realizaron mediante microscopía de fluorescencia incluidos exhaustiva fotón reasignación de software, citometría de flujo, y receptosome aislamiento por medios magneticos. Propiedades bioquímicas de la hicp75TNFR se determinó por cromatografía de afinidad, ELISA, y las técnicas occidentales blot.

Resultados

Se describe la localización y la activación de un diferencialmente empalmados y principalmente intracelularmente expresó isoforma de p75TNFR humanos, denominado hicp75TNFR. Expresión estudios con hicp75TNFR cDNA en diferentes tipos de células mostró la proteína resultante retenido en la red transeuropea de Golgi y en endosomes y colocalizes con TNF endógeno. Superficie expresó hicp75TNFR comporta como hp75TNFR demostrando sensibilidad para TACE inducida derramamiento NF κ B, y después de la activación de TNF vinculante.

Conclusión

Nuestros datos demuestran que intracelulares hicp75TNFR no es accesible para exógena TNF, pero siempre con colocalizes endógena producido TNF. Estos hallazgos sugieren un posible mecanismo de activación intracelular hicp75TNFR por TNF endógeno. Subsiguiente activación de NF κ B podría inducir apoptosis anti-TNF mecanismos para proteger las células productoras de efectos citotóxicos de TNF. Además, el intracelular y no TACE-empalme forma accesible de la hp75TNFR podría servir como un conjunto de preformados, hp75TNFR funcional.

Antecedentes

TNF es una citocina pleiotrópica que participan en un amplio espectro de la respuesta inmune inflamatoria y la proliferación y citotoxicidad incluidos en una variedad de diferentes tipos de células [1]. Dos receptores de las moléculas con una aparente masa molecular de 55 kDa (p55TNFR, TNFR tipo 1) y 75 kDa (p75TNFR, TNFR tipo 2) han sido identificados y sus correspondientes ADNc clonados [2 - 5]. El p55TNFR más bien se expresa constitutivamente en un amplio espectro de los diferentes tipos de células y se ha demostrado que mediar en la mayoría de los comúnmente conocidos efectos biológicos del TNF [6, 7]. En cambio, la expresión de la p75TNFR parece ser modulada por diversos estímulos. Sin embargo, hay sólo unas pocas respuestas celulares que se pueden atribuir exclusivamente a la señalización a través de la p75TNFR, por ejemplo, la proliferación de las células NK [8], células B [9], [10] timocitos, y madurar las células T [11], y GM - CSF secreción de los linfocitos T [12]. Además, la p75TNFR ha demostrado ser preferentemente activado por TNF membrana [13]. Aunque los dominios intracelular de los dos TNFR sólo muestran poca similitud que comparten actividades como la activación de NF κ B. Aunque p55TNFR es capaz de mediar estos efectos cuando se expresa en niveles fisiológicamente relevantes, la inducción de NF κ B, a través de la p75TNFR solas sólo se observó en células overexpressing este subtipo de receptor [14, 15].

El dominio extracelular de TNFR tanto es suceptible a la división proteolítica. Agentes como el ligando natural TNF, LPS, anticuerpos anti-CD3, y otros estímulos inducir una rápida derramamiento de receptores en varios tipos de células incluyendo los macrófagos, células T, y granulocitos [16 - 19].

Los altos niveles de p75TNFR solubles se encuentran en el suero de los pacientes que sufren de cáncer [20], [21] el VIH, sepsis [22], y varias enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide [23] y el lupus sistémico erythematodes [24]. Expresión de una isoforma p75TNFR solubles secretadas, generados por diferencial de empalme, recientemente se describió a ser elevados en la artritis reumatoide [25].

Una novela p75TNFR isoforma generados por el uso de un nuevo sitio web inicial transcripcional ha sido descrito y que se denominó hicp75TNFR [26]. Exón 1, que contribuye a la señal en el péptido humano p75TNFR se sustituirá por Exon1a que consiste en un elemento que se Alu exonized durante la evolución en ambos ratón y humanos [27]. Varias líneas celulares de macrófagos activados por ejemplo, expresar hicp75TNFR en paralelo a hp75TNFR [26] y hicp75TNFR mRNA upregulation se observó en el hígado del ratón después de la inyección de LPS en ratones sensibilizados con D-GalN (observaciones no publicadas). Si bien la pertinencia de soluble TNFR moléculas inhibitorias como es de aceptación general la función de un intracelular TNFR en procesos inflamatorios sigue siendo difícil de alcanzar. En este estudio se determinó la localización de hicp75TNFR y probado las posibles formas de activación por TNF exógenos y endógenos.

Métodos
Cultivo de células y reactivos

HEK 293 células y células 3T3 NIH se mantuvieron en la Dulbeccos Mod Eagle Mediano (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) suplementado con 10% de calor-suero de ternera fetal inactivado (PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Alemania) y 50 μ g / ml de gentamicina (PAA Laboratories, Linz, Austria). P55TNFR y p75TNFR doble déficit de fibroblastos (TNFR1 / 2) fueron generados en nuestro laboratorio por 40 grandes simiesco virus T-immortalization murino de fibroblastos de TNFR1 y TNFR2 doble ratones knock-out [28]. L929 células y TNFR1 / 2 knock-out fibroblastos son cultivados en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemania) suplementado con 10% de calor-fetal inactivado suero de ternera y 50 μ g / ml de gentamicina. El p75TNFR humanos específicos-80M2 anticuerpo monoclonal de ratón y conejo suero 80M [29] fueron amablemente proporcionados por Scheurich P. (Universidad de Stuttgart, Alemania). El mouse monoclonal anti-myc anticuerpos (9E10) se adquirió de Invitrogen (Karlsruhe, Alemania). Anticuerpos IgG policlonal de conejo anti-TNF humano eran de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Secundaria anticuerpos para inmunoticción: conejo anti-ratón FITC fue de DakoCytomation GmbH (Hamburgo, Alemania), y de cabra anti-conejo TRITC de Sigma-Aldrich.

Transfección y transducción

NIH 3T3 células fueron transfectadas transitoriamente con SuperFect transfección de Reactivos (Quiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Con el fin de producir retrovirus sobrenadante que contiene células HEK 293 fueron transitoriamente cotransfected con el embalaje construir pCl-10 A1 [30] y el vector retroviral pQCXIP (BD Biosciences Clontech, CA, EE.UU.) que contiene el gen de interés utilizando el HEPES de búfer salina de calcio Fosfato método [31]. Medio fue sustituido 5 h post transfección. Sobrenadantes fueron recolectados después de 2 días y filtrar a través de una baja unión a proteínas 0,45 μ m de tamaño de poro de filtro (filtro de jeringa Acrodisc, PALL Corporation, MI, EE.UU.), en presencia de 8 μ g / ml polybrene (Sigma-Aldrich). Objetivo células fueron infectadas durante 2 días por cambio de los virus que contenían el medio en 12 h después y medidas seleccionadas para positividad FACS-ya sea por la clasificación en el caso de las células fluorescentes o por puromycin (Sigma-Aldrich) selección.

Microscopía de fluorescencia

Transduced NIH 3T3 células fueron sembradas en Lab-Tek II Salón de diapositivas sistemas (Nunc GmbH & Co KG, Wiesbaden, Alemania). Al día siguiente se les fija 15 minutos con paraformaldehido 4% en buffer fosfato salino-permeabilized y con el 0,1% Tritón X-100 durante 5 min. Después de bloquear con el 1% de albúmina sérica bovina en buffer fosfato salino-primaria de anticuerpos (2 μ g / ml) se añadió seguido de un FITC o el TRITC etiquetados secundaria de anticuerpos. Antes de montar el coverslide con MoBiGLOW Montaje Mediano (MoBiTec GmbH, Göttingen, Alemania), los núcleos se tiñeron con Dapi (Sigma-Aldrich). Tinción de los diferentes compartimentos y se realizó en núcleos de las células vivas mediante la utilización Hoechst 33342, ER-Tracker Azul-Blanco DPX, GolgiTracker BODIPY TR C 5-ceramida, MitoTracker Roja CMXRos, LysoTracker Roja DND-99 (todos los de Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.), con arreglo a la instrucción de los fabricantes. El vector ENDO-eCFP se adquirió de BD Biosciences Clontech (CA, EE.UU.). Después de un lavado con buffer fosfato salino de las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% en buffer fosfato salino-a 4 ° C durante 5 min seguido de 10 minutos a temperatura ambiente. Coverslides fueron montadas con MobiGLOW de montaje. Fluorescente óptico secciones para cada color se obtuvieron con un microscopio convencional Zeiss Axiovert piezoeléctricos equipado con un eje z centrarse dispositivo (Physik Instrumente, Waldbronn, Alemania). Las imágenes fueron tomadas con un dispositivo acoplado por carga (CCD), de cámara (4096 niveles de gris, -15 ° C peltier enfriado, Princeton Instruments, Trenton, EE.UU.) y procesado por MetaMorph software (Universal Imaging Corp, West Chester, EE.UU.). La luz fluorescente por la bruma contribuido con etiqueta estructuras situadas por encima y por debajo del plano de la atención se centró matemáticamente óptima reasignado a su lugar de origen (EPR, exhaustiva Photon Reasignación de software Scanalytics, Massachusetts, EE.UU.), después de la caracterización precisa de la función de difuminación sistema óptico (Punto propagación función, PSF). Durante la restauración, la FSP EPR utilizado datos de la imagen para centrar de nuevo la luz y neblina en la imagen en bruto espécimen.

ELISA

Para detectar soluble extracelular dominios hicp75TNFR o de cualquiera de los hp75TNFR humanos p75TNFR (80 kDa) Módulo Conjunto (Bender MedSystems, Vienna, Austria), y humanos sTNFRII/TNFRSF1B Duo Set ELISA desarrollo (R & D Systems, MN, EE.UU.) se utilizaron. Células (4 × 10 4) Se sembró por triplicado en 48 pozos de placas de cultivo, y se incuba ya sea con hTNF, medio sola, o el inhibidor de TACE-TAPI-0 (Biomol, Hamburgo, Alemania), como se indica en las concentraciones. Después de 24 h sobrenadantes fueron recogidas y analizadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La OD de ABTS se determinó a 405 nm.

Citometría de flujo

Expresión de transduced hp75TNFR isoformas en la superficie de la célula fue detectada por citometría de flujo en un FACStar Plus (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) a través de la PE-junto rata específicos anti-humano p75TNFR anticuerpo monoclonal y PE-etiquetados rata IgG2b (ambos BD, Heidelberg, Alemania) como isotipo control. Por FACS análisis de las células (1 × 10 6 / tubo) se bloquearon con PBS con 10% FCS inactivado por calor durante 30 min en hielo y luego incubadas con 20 μ l de solución de anticuerpos en hielo durante 30 min. El YFP-proteínas de fusión fueron etiquetados directamente detectable en FL-1 sin ninguna medida adicional de la tinción. YFP-positivas células fueron ordenados mediante un FACStar Plus. Para la tinción intracelular FIX & PERM (Caltag, Hamburgo, Alemania) se utilizó.

Western Blot y Immunoprecipitation

Células (4 × 10 6) Se sembró en platos de 10 cm y aumentado la noche a la mañana. Después de 24 h las células fueron lavadas con helado de PBS y lisadas en 1 ml de buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 7.4,1 mM EDTA, 1% Tritón X-100, NP-40 1%, Na - Deoxycholate 0,25%), que contiene una mezcla de inhibidores de la proteasa (Complete ™ EDTA libre de comprimidos, Roche, Mannheim, Alemania). Después de la centrifugación lisados se precleared durante 4 h en 20 μ l de proteína G-Sepharosa (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), y immunoprecipitated con 80M2 (10 μ g / ml) un anticuerpo monoclonal de ratón contra el dominio extracelular de p75TNFR humanos [29] y 20 μ l de proteína G-Sepharosa durante 16 horas a 4 C. granulado se lavaron tres veces en PBS, resolvió el 8% SDS-PAGE en virtud de la reducción de las condiciones, y transferidos a membranas PVDF. Estas membranas fueron bloqueadas en el 1% de leche en polvo y detecta con un anticuerpo policlonal de conejo (0,1 μ g / ml), H-202 (Santa Cruz-Biotecnología, Inc, CA, EE.UU.) vinculantes para el dominio intracelular de hp75TNFR isoformas, Específicamente para detectar la proteína de longitud completa. Como una cabra secundaria de anticuerpos anti-IgG de conejo-HRP (1:2000 dilución, Sigma-Aldrich) se utilizó. Los blots fueron incubadas con el sustrato HRP (mejora de quimioluminiscencia sustrato NOWA solución AyB; MoBiTec GmbH, Alemania) y desarrollado por la exposición a la película (Hyperfilm; Amersham Biosciences).

Clonación

Mediante amplificación por PCR se realizó con los primers sentido para hicp75TNFR-myc (5'-AAAGGATCCCCCATGGCGAAACCCCTC-3 ') y para hp75TNFR-myc (5'-AAAGGATCCCCCATGGCGCCCGTCGCCGTC-3') y antisentido para los dos primers (5'GGGCTCGAGTCACAGATCCTCTTCTGAGAT-3 '). La plantilla en cada uno de los casos fue el myc-etiquetados cDNA en pcDNA 3,1 hygro (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Los productos resultantes de PCR fueron clonados utilizando BamHI / xhoI en un vector modificado proviral, pQCXIP (BD Biosciences Clontech, CA, EE.UU.), que contiene un nuevo xhoI sitio en el extremo 3 'de la clonación múltiple sitio. Para crear la etiqueta eYFP-proteínas de fusión de toda la supervisión, control y vigilancia pQCXIP (BD Biosciences Clontech, CA, EE.UU.) es sustituido por la supervisión, control y vigilancia de codificación y eYFP fragmento de pEYFP-N1 (BD Biosciences Clontech, CA, EE.UU.). En este vector modificado tanto myc-etiquetados de cDNA fueron clonados utilizando EcoRI / BamHI en el marco eYFP con sentido utilizando primers para hicp75TNFR-myc (5'-CCGAATTCCCAGCCATGGCGAAACCCCTC-3 ') y para hp75TNFR-myc (5'-CCCAAGCTTGAATTCCCAGCCATGGCGCCCGTCGCCGTC-3') y Antisentido para los dos primers (5'CGGGATCCCGCAGATCCTCTTCTGAGATG-3 '). Todas las construcciones de expresión han sido comprobados por secuenciación.

Aislamiento de magnéticamente etiquetados TNF receptosomes

Para aislar a los receptores de membrana plasmática de TNF después de la internalización de carácter vinculante y ligando con biotina TNF (Fluorokine-Kit, R & D Systems, Wiesbaden, Alemania) y etiquetados magnéticamente 50 nm MACS Estreptovidina Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y se utilizaron los receptosomes aisladas por magnética Después de medio tiempo diferentes puntos, tal como se describe recientemente [32]. Las células fueron incubadas en un volumen total de 250 μ l frío Dulbecco modificada de Medio Eagles (MEDM) complementado con 25 Mm HEPES (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con 100 μ l (400 ng) de biotina TNF por 1 h sobre hielo. Posteriormente, 200 μ l de la solución MACS Estreptovidina Microbeads se añadió las células y se incubaron durante 1 h en hielo. TNF receptor de la agrupación y la formación de TNF magnetizado receptosomes se logró por incubación a 37 ° C durante tiempos diferentes. Las células fueron etiquetados mecánicamente homogeneizada utilizando piedras de acero en un buffer 0.25M sacarosa, que se complementaron con 0.015M HEPES, 100 mg / L MgCl 2, pH 7,4 y los inhibidores de proteasa Conjunto de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania) a 4 ° C. Un posnucleares sobrenadante se presentó a la separación magnética de TNF receptosomes en un alto gradiente del campo magnético generado en una costumbre-construido de libre flujo magnético cámara (alemana de patentes en poder de S. Schütze).

Caracterización de TNF receptosome proteínas asociadas

Receptosome proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y analizada por Western Blot a la firma de las proteínas endocitosis y el tráfico vesicular por anticuerpos contra clathrin, (Transduction Lab., Lexington, Reino Unido), Rab5, Vti1b (StressGene Biotec. Corp Victoria, Canadá), Y catepsina D (Calbiochem-Novabiochem GmbH, Alemania), como se describe [32].

Cromatografía de afinidad

Purificada rhTNF (BASF, Ludwigshafen, Alemania) se ha unido a CNBr-activated Sepharosa 4B de acuerdo con el protocolo proporcionado por Amersham Biosciences (capacidad 16-32 mg / g) con las siguientes modificaciones: El gel de hinchada con 1 mM de HCl y lavado Tres veces por 5 minutos cada una, utilizando un total de 200 ml de HCl 1 mM / g de gel. RhTNF fue disuelto en 7,5 mg / 3 ml de solución salina de fosfato de búfer y dializados tres veces contra 500 ml de 0.1M NaHCO 3%, pH 8,3, 0,5 M NaCl. El volumen de la ligando se hizo hasta 5 ml con el mismo tampón y se mezclan con el lavado de gel (2,5 mg de rhTNF / ml de gel hinchado purines) girando suavemente la noche a 4 ° C. El exceso de ligando fue arrastrada con el mismo buffer, y los restantes grupos activos fueron bloqueados con 0.1M Tris-HCl, pH 8,0 durante 2 horas a temperatura ambiente. El gel fue lavado con 3 ciclos de alternancia de pH, el uso de tampón acetato de sodio 0.1M, pH 4,0, y 0.1M Tris-HCl, pH 8,0, cada uno con 0,5 M NaCl. El conjugado se almacenó en PBS a 4 ° C. Aclaró sobrenadante de transduced TNFR1 / 2 knock-out fibroblastos se precipitó con sulfato de amonio. El pellet fue resuspendet en PBS, dializados contra PBS y cargados en una columna rhTNF afinidad utilizando FPLC (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, EE.UU.). Después de un lavado con PBS, el material fue obligado eluye con 100 mM glicina, cloruro de sodio 100 mM, pH 2,6, en microcentrífuga tubos que contienen 1M Tris-HCl, pH 7,5. Las fracciones fueron analizadas por el 8% SDS-PAGE y después de la tinción de Coomassie Blue o Western Blot.

Determinación de la actividad citotóxica de TNF en células L929

Células (L929) Se sembró en 96-placas microtiter así en el 2,5 × 10 4 células /. Después de 24 h de diluciones seriadas rhTNF se añadieron en presencia de actinomicina D (2 μ g / ml). Después de 24 h, se evaluó la viabilidad celular mediante la adición de MTT (Sigma-Aldrich) durante 4 h. Las células fueron lisadas con SDS y se determinaron OD a 450 nm.

Resultados
Localización de la etiqueta humanos p75TNFR isoformas

Para obtener una imagen detallada de la localización subcelular de la hicp75TNFR hemos utilizado YFP-etiquetados receptor construye y en comparación con la tinción fluorescente compartimento específico de seguimiento. Como se muestra en la Fig. 1, la gran barril YFP estructura de la proteína no es alterar el patrón de tinción de la proteína hp75TNFR en comparación con el relativamente pequeño-myc etiqueta. Si bien el hp75TNFR manchados en la forma típica de una membrana de la proteína localizada, la hicp75TNFR exhibió una marcada, de la vesícula como patrón localizado perinuclearly y en el citoplasma. Además, también las células transfectadas con las correspondientes ADNc tanto transitoria y estable para descartar posibles epiphenomena creado por transducción viral. Los datos obtenidos por transfección estaban en consonancia con los obtenidos por transducción (datos no presentados).

Localización subcelular de los humanos icp75TNFR

Cuando TNFR localización se comparó con diferentes compartimentos celulares ninguna de las dos variantes hp75TNFR co-localizado con la ER (Fig. 2A, 2B], mitocondrias (Fig. 2E, 2F], o lisosomas (Fig. 2G, 2H]. Tanto los receptores de las formas colocalized con el aparato de Golgi (Fig. 2C, 2D]. Una clara discriminación de colocalización con perinuclear budded endosomes parecido a la red transeuropea de golgi (TGN) se observó tinción hp75TNFR cuando se comparó con hicp75TNFR tinción. Considerando que la hp75TNFR fue rápidamente guiará a través de este compartimiento (Fig. 2I] parecía que la mayor parte de las moléculas de hicp75TNFR-YFP se almacenan en endosomal estructuras como lo demuestra la fuerte colocalización de hicp75TNFR con ENDO-eCFP (Fig. 2J].

Superficie celular de la expresión humana p75TNFR isoformas

Aunque transfectadas hicp75TNFR no detectables microscópicamente, se utilizó citometría de flujo para determinar si se convierte en hicp75TNFR detectable en la membrana celular después de la transducción.

Fig. 3A muestra que ambos L929 líneas celulares ya sea transduced con hp75TNFR o hicp75TNFR expresó el mismo número de los respectivos hp75TNFR isoforma. Después de la fijación y permeabilización un PE-etiquetados de anticuerpos contra un epitopo presente en ambos hp75TNFR y hicp75TNFR manchado la transduced L929 líneas celulares con la misma intensidad (Fig. 3A], que demuestra que el anticuerpo ha utilizado la misma afinidad a ambas isoformas y de las células que expresan Una cantidad comparable de este epítopo. Sin permeabilización de células hp75TNFR isoformas expuestos en el exterior del membrana celular se convirtió detectables que está en consonancia con las observaciones microscópicas (Fig. 2]. Sorprendentemente, hicp75TNFR moléculas también fueron teñidas en la membrana celular, sin embargo en menor medida que hp75TNFR moléculas (Fig. 3B].

Soluble ectodominio de humanos p75TNFR isoformas

Formas solubles de los receptores de TNF se describen, que consiste en arrojar los dominios extracelulares de la p55TNFR o p75TNFR, respectivamente. La puesta en libertad se puede mejorar la estimulación con TNF, LPS, o éster de forbol y puede ser inhibida por TAPI (TNF-α inhibidor de la transformación). Este evento se lleva a cabo principalmente en la superficie de la célula y es causada por metalloproteases [33].

Hemos probado transduced L929 células ordenados por comperable hp75TNFR-YFP y hicp75TNFR-YFP expresión relativas a la liberación de los receptores solubles por ELISA (Fig. 4A]. L929 células transduced con hp75TNFR-YFP, así como hicp75TNFR-YFP-transduced L929 células liberados hp75TNFR soluble en el sobrenadante (Fig. 4A]. Más soluble hp75TNFR se midió a más soluble hicp75TNFR. En el sobrenadante de células L929 control transduced con YFP no soluble TNFR se encontró. Estos datos indican que hicp75TNFR es menos afectada por el derramamiento. En ambas líneas de células derramamiento TACE dependen de los productos básicos fue a lo señalado por su inducibility con rhTNF y su atenuación con el inhibidor específico TACE TAPI. TNF está aumentando el derramamiento en un 25% en el hicp75TNFR tranductants y en un 30% en el hp75TNFR transductants. TAPI reducido rhTNF derramamiento inducido al 58% en el hicp75TNFR transductants y al 60% en el hp75TNFR transductants, lo que demuestra que actividad de TACE es igual en ambas líneas celulares y, por tanto, no la razón de la baja solubilidad de hicp75TNFR en el sobrenadante.

Cuando el soluble hp75TNFR del sobrenadante de hicp75TNFR-YFP transduced L929 células se probó en un ensayo de citotoxicidad del TNF en células L929 (Fig. 4B] de la actividad inhibidora de la shedded dominio extracelular de la hicp75TNFR se demostró. Esto indica que el ectodominio de hicp75TNFR es biológicamente activa y vinculante en la neutralización de TNF.

Caracterización bioquímica de los humanos icp75TNFR

El exón 1 bis de hicp75TNFR no codificar un péptido señal típica y, por lo tanto, no cleaved despegue en el proceso de biosíntesis de las peptidasas señal en contraste con la secuencia codificada por el exón 1 de hp75TNFR. Para comprobar si esto se traduce en un peso molecular aparente diferentes, aislados longitud completa de la proteína total de lisados de las células 3T3 NIH transduced ya sea con hp75TNFR o hicp75TNFR, respectivamente, por immunoprecipitation con un anticuerpo monoclonal de ratón planteado contra el dominio extracelular de hp75TNFR (80M2) .

Immunodetection se hizo con una fracción de IgG policlonal de conejo (sc-7862) la detección de hp75TNFR dominio intracelular. A la escuela para pedir madura proteína resultante de hicp75TNFR cDNA dispone de 85 kDa, que es alrededor de 10 kDa más de la masa molecular aparente de hp75TNFR (Fig. 5A]. Además, el hp75TNFR también aparece como una tenue banda con cerca de 50 kDa como ya se ha descrito anteriormente como posiblemente diferente glicosilada hp75TNFR especies [34, 35]. Un doble banda también fue manchado en el caso de hicp75TNFR en alrededor de 50 kDa, posiblemente, indicando diferentes masas moleculares de las moléculas icp75TNFR resultado de las potenciales O-glicosilación en sitios threonin 7 y serin 11 de la hicp75TNFR específicos de exón 1 bis (inédito observación).

Para determinar si la diferencia en el peso molecular aparente se debe a la presencia de la presequence adicionales en el dominio extracelular, soluble en el dominio extracelular de hicp75TNFR fue purificado de cultivo de células sobrenadante por cromatografía de afinidad. Para evitar la contaminación con arrojar ratón TNFR hemos utilizado TNFR1 / 2 knock-out fibroblastos transduced con hicp75TNFR. El purificada soluble hicp75TNFR teñido con antisuero anti-hp75TNFR (80M) y mostró una sola banda en cerca de 50 kDa (Fig. 5B]. Desde la hp75TNFR soluble se ha publicado con un aparente peso molecular de 40kDa [36, 37] estos datos indican que la mayor masa molecular de hicp75TNFR podría ser el resultado de los otros 24 aminoácidos en el extremo N-terminal codificada por Exon1a y / o diferentes Glicosilación.

Activación de humanos icp75TNFR

Internalización de p55TNFR después exógenos vinculante de TNF se ha publicado [38]. Para probar si exógenos TNF hicp75TNFR interactúa con un nuevo método recientemente descrito por Schneider-Brachert et al. Se utilizó [32]. Receptosomes Estamos aislados en diferentes puntos de tiempo en un campo magnético y seguida de la maduración resultante endosomes con pruebas para diferentes proteínas de contratación marcador a los complejos (Fig. 6A].

Con el tiempo después de vinculante, clathrin como un marcador para la endocitosis está disminuyendo, así como los principios de Rab4 marcador endosomal. Después de 30 minutos de la tarde endosomes fusible con vesículas de la TGN, como ha sido documentado por una cantidad cada vez mayor de Vti1. Aunque este podría ser el momento en que el TNF puede ser exógeno pasó de la interiorizado TNF-p55TNFR complejo a la hicp75TNFR, hicp75TNFR no se aisló en receptosomes después de 30 minutos lo que indica que no pasa ligando intracelular está ocurriendo. Después de 60 minutos el receptosomes acabar en lisosomas indicado por Catepsina D tinción.

Para evaluar una posible activación intracelular de forma endógena con hicp75TNFR producido TNF L929 transfectadas establemente con los de larga duración, transmembrana TNF se transduced con hicp75TNFR (Fig. 6B]. Después de la doble tinción colocalización de TNF humano endógeno y hicp75TNFR se observó en compartimentos intracelulares perinuclear TNF endógeno que indica que podría activar la hicp75TNFR.

Discusión

TNF ejerce pleiotrópica actividades biológicas que afectan a la proliferación, diferenciación, o funciones en una amplia variedad de tipos de células interactuando con sus dos receptores p55TNFR y p75TNFR [17, 18]. Los receptores solubles del TNF, ya sea generados por la división proteolítica [16 - 19] o diferencial de empalme [25] contribuir a la balanza de TNF-mediada por la neutralización de los efectos del ligando. La función biológica de una isoforma expresada principalmente intracelularmente de hp75TNFR no estaba claro. Hicp75TNFR Dado que se carece de un típico líder en la secuencia N-terminal que utiliza YFP-etiquetados receptor construye para investigar si la proteína está dirigida a un determinado compartimiento intracelular. Localización de la YFP-etiquetados hicp75TNFR no era diferente de la correspondiente etiquetado hicp75TNFR-myc. De este modo no es necesario llevar a cabo medidas de incubación y permeabilización, que probablemente podría alterar la estructura 3D de las células en el compartimiento de colocalización con estudios específicos de los tintes. En caso de la hp75TNFR-YFP la espera de un patrón típico de la membrana plasmática-receptor se vio obligado, comparables a los nativos p75TNFR expresión en la vena umbilical humana células endoteliales [39].

El hicp75TNFR-YFP proteína no fue retenido en la sala de emergencia. Además, este receptor no es una proteína mitocondrial, como ha sido descrito por crossreaction con un anticuerpo anti-hp75TNFR [40]. Exógena añadió TNF interioriza tras su unión a la p55TNFR y se transporta a los lisosomas [38, 41]. El hicp75TNFR no colocalize con lisosomas y no se encontró a interactuar con endocytosed exógenos TNF.

Además de ser enriquecido en el último compartimiento, sobreexpresa las proteínas celulares se suelen observar en el aparato de Golgi. El hicp75TNFR firmemente colocalized con el aparato de Golgi y con gemación endosomal vesículas de la red transeuropea de Golgi (TGN), como se indica por el coexpression etiquetados con un marcador endosomal. No hicp75TNFR tinción se observó en la membrana plasmática o cualquier otro compartimiento intracelular.

Las limitaciones de la sensibilidad de la microscopía fluorescente hecho evidente considerando la membrana intracelular, pero no manchas de p55TNFR por microscopía confocal. Este es también TNFR que predomina en el TGN [39, 42], a pesar de que es un bien caracterizado membrana plasmática de proteínas. Flujo cytometrical análisis confirmó que efectivamente ambas isoformas de la hp75TNFR se pueden encontrar en la superficie de la célula con mayor expresión de la hp75TNFR frente a la isoforma hicp75TNFR. Hicp75TNFR recuerda a la expresión de los receptores de transferrina humano que también es sintetizada sin un típico líder de la secuencia y, por lo tanto, predominantemente localizados dentro de la célula. Sólo una pequeña cantidad se localiza en la membrana plasmática [43], donde la proteína actúa como un receptor. Se ha demostrado que un dominio transmembrana es suficiente para trasladar las proteínas en la membrana de la sala de emergencia, desde donde viajará a la membrana plasmática a través de la vía secretora [43, 44].

Como consecuencia directa de la superficie de la célula se convierte en expresión de la hicp75TNFR accesibles al TNF-α convertase (TACE/ADAM-17), un transmembrana disintegrin ADAM metaloproteinasas de la familia de las proteasas. El ADAM-17-dependencia en el derramamiento de dominio extracelular de hicp75TNFR queda demostrado por el TNF y la reducción de derramamiento inducibility en presencia del inhibidor específico TACE TAPI. En general, la reducción de las cantidades de hicp75TNFR solubles se detectaron en sobrenadante de células en comparación con transduced soluble hp75TNFR. Estos datos indican que la hicp75TNFR nuevas moléculas en la membrana celular no se comportan de manera diferente a la hp75TNFR moléculas. La piscina de hicp75TNFR intracelular no parece verse afectada por derramamiento de que se lleva a cabo en la membrana celular. Dado que después de la estimulación de las células se agotan TNFR [33] restauración de la superficie de la célula con preformados funcional TNFR es un mecanismo muy rápido sin la necesidad de neo-biosíntesis de proteínas. Esa teoría de la almacenados TNFR también se ha discutido p55TNFR intracelular de las moléculas [45].

La soluble hicp75TNFR es biológicamente activa y competitiva en condiciones de obligar TNF. De longitud completa p55TNFR es liberado en exosome-como vesículas como recientemente publicado [46]. Podríamos excluir esta posibilidad para el hicp75TNFR debido a la clara TACE dependen de los productos básicos y el derramamiento de peso molecular aparente de longitud completa y purificado por afinidad hicp75TNFR soluble. El hicp75TNFR soluble mostró una clara banda de ~ 50 kDa mientras longitud completa hicp75TNFR aparece en ~ 85 kDa, que es en ambos casos alrededor de 10 kDa más de la forma de los respectivos hp75TNFR [37]. Este aumento de peso molecular se puede explicar por la adicionales secuencia N-terminal de 24 aminoácidos codificados por el exón 1 bis.

Abordar la cuestión de si exógenos TNF podría activar el hicp75TNFR hemos utilizado la receptosome elegante método de aislamiento [32]. Los resultados muestran que internalizado TNF no fue aprobado el relevo de la interiorizado p55TNFR a hicp75TNFR. Debido a la mayor afinidad de TNF soluble a la p55TNFR que a la p75TNFR [47] tal que pasa es bastante más improbable. Por otro lado, la afinidad de hp75TNFR de membrana del TNF es relativamente alta [10]. Por lo tanto, la segunda posibilidad de la interacción de los TNF endógeno con hicp75TNFR fue probado usando L929 células que expresan establemente 26 kDa pre-TNF y transduced con hicp75TNFR. Sobreexpresión de ambos ligando del receptor y fue necesario porque la producción de TNF-líneas de células como los macrófagos no se puede transduced eficientemente con hicp75TNFR expresión construcciones. El patrón de distribución de sobreexpresa TNF endógeno es similar a la producida por los macrófagos TNF a la estimulación LPS [48]. Borrar colocalización de TNF endógeno y localizados intracelularmente hicp75TNFR se detectó. Activación de hicp75TNFR por TNF endógeno en el TGN es difícil de demostrar de manera inequívoca debido a la presencia de TNF soluble y la membrana de la célula localizada hicp75TNFR en este sistema. Por intracelular p55TNFR ya se ha demostrado que la activación no se produce por exógena añadió TNF [42]. Paralelamente expresión del ligando del receptor y de la misma célula puede dar lugar a los complejos intracelulares que son rápidamente degradados [49]. Alternativamente, la activación intracelular de la hicp75TNFR por endógena TNF no se puede excluir.

Expresión de TNF, así como hicp75TNFR por células como los macrófagos activados podría conducir a la activación de NF κ B intracelular de las vías y de la expresión de NF-κ B dependientes de las proteínas anti-apoptóticas. La importancia de NF κ B en la prevención de la apoptosis ha sido claramente demostrado en fibroblastos de ratones p65/RelA-deficient son altamente susceptibles a la apoptosis inducida por TNF [50] y las células que expresan el mutante dominante negativo de I κ B son también muy sensibles a la apoptosis inducida por TNF-[51 , 52]. Por lo tanto, ese mecanismo de activación intracelular hicp75TNFR por TNF endógeno, con la consiguiente NF-κ B dependientes de la activación de los mecanismos anti-apoptóticos TNF podría proteger las células productoras de efectos citotóxicos de TNF. Como resultado de ello, la supervivencia de las células inmunes activadas podría ser así sostenido.

Activación intracelular de la p75TNFR por TNF endógeno parece especialmente interesante a la luz de la reciente publicación por El y Kim [53] demuestra estimuladoras p75TNFR función de la activación de células T de activación. Así, el TNF no sólo sirve como un mediador central de la inmunidad innata mediante la activación de la p55TNFR sino también por la estimulación de la p75TNFR contribuye a la inducción de la respuesta inmune adaptativa.

En conclusión, los resultados de este estudio muestran que la alternativa de empalme de la variante humana p75TNFR está fuertemente retenido en el TGN en el que podría funcionar como una piscina de almacenamiento de preformados p75TNFR que no se ve afectado por derramar. Una vez que salen de la superficie de la célula hicp75TNFR es funcionalmente ya no distinguen de hp75TNFR. Las consecuencias de hicp75TNFR colocalización con TNF endógeno para hicp75TNFR señalización en células productoras de TNF que queda por analizar.

Conclusión

Los resultados de este estudio muestran que la alternativa de empalme de la variante humana p75TNFR está fuertemente retenido en el TGN donde colocalizes con TNF endógeno. Las consecuencias de esta colocalización de TNF hicp75TNFR señalización en la producción de células aún no se ha analizado. Una vez que salen de la superficie de la célula hicp75TNFR es funcionalmente ya no distinguen de hp75TNFR. El hicp75TNFR podría funcionar como una piscina de almacenamiento de preformados p75TNFR que no se ve afectado por derramar. Potencial de activación intracelular de hicp75TNFR por TNF endógeno podría dar lugar a elevados niveles de NF κ B, y finalmente la producción de TNF-proteger las células de TNF inducida por la muerte de la célula.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

CS participó en el diseño experimental, llevó a cabo la mayoría de los procedimientos experimentales y de poner juntos el manuscrito. WS-B establecido en el protocolo de transducción retroviral y siempre vectores esenciales. SS llevaron a cabo la receptosome isoloation y de la correspondiente transferencia Western-Blots. TH participó en el diseño experimental, la clonación y los debates. DNM participó en el diseño del estudio y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Eva Pocsik de la prestación de los L929 células transfectadas establemente con el TNF humano, y Peter Scheurich para el anti-humano p75TNFR anticuerpos 80M y 80M2. Esta investigación fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA760/13-1). CS es un miembro asociado de la Graduiertenkolleg GRK 760