Kinetoplastid Biology and Disease, 2005; 4: 4-4 (más artículos en esta revista)

Aplicación de Direct Agglutination Test (DAT) y Fast Agglutination Screening Test (FAST) para el diagnóstico serológico de la leishmaniasis visceral en el área endémica de Minas Gerais, Brasil

BioMed Central
Eduardo Silva S (biologia@funedi.edu.br) [1], Gerard J Schoone (g.schoone @ kit.nl) [2], Celia MF Gontijo (gontijo@cpqrr.fiocruz.br) [3], Reginaldo P Brasil (rpbrazil@ioc.fiocruz.br) [4], Raquel Pacheco S (rpacheco@ioc.fiocruz.br) [4], Henk DFH Schallig (H. Schallig @ kit.nl) [2]
[1] Universidade do Estado de Minas Gerais, Fundação Educacional de Divinópolis, Divinópolis, MG, Brasil
[2] KIT (Koninklijk Instituut voor de Tropen / Royal Tropical Institute) KIT Investigación Biomédica, Meibergdreef 39, 1105 AZ Amsterdam, Países Bajos
[3] Centro de Pesquisas René Rachou-Fiocruz, Belo Horizonte, MG, Brasil
[4] Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, IOC / Fiocruz, Río de Janeiro, RJ, Brasil

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Resumen
Antecedentes

La prueba de aglutinación directa (DAT) ha demostrado ser una importante herramienta de diagnóstico serológico de la combinación de altos niveles de validez intrínseca y la facilidad de la ejecución. De lo contrario, la prueba de detección de aglutinación rápida (FAST) utiliza sólo una dilución de suero de toma de la prueba muy adecuado para el cribado de grandes poblaciones.

Resultados

Hemos probado FAST y DAT para la detección de anticuerpos anti-Leishmania en muestras de suero de pacientes con American visceral (AVL) y la leishmaniasis cutánea (ACL), en Minas Gerais, Brasil. El DAT en suero y muestras de sangre de pacientes confirmados AVL encuentran todas las muestras positivas en una dilución de suero de ≥ 1:800. Esta dilución se utiliza como valor de corte en el estudio. La sangre y las muestras de suero de estos pacientes confirmados también podría leerse claramente FAST utilizando una dilución 1:100 con la misma alta sensibilidad. DAT FAST y no fueron capaces de detectar cantidades significativas de anticuerpos en muestras de los pacientes y la lista de control de acceso no son adecuadas para el diagnóstico de esta manifestación de la enfermedad.

Conclusión

Sugerimos que tanto DAT y FAST son muy prácticos instrumentos de diagnóstico para el diagnóstico serológico de la AVL en virtud de las condiciones rurales como pruebas serológicas no requieren equipo sofisticado, una cadena de frío y son muy sencillos de realizar.

Antecedentes

American leishmaniasis visceral (AVL) a la enfermedad causada por el protozoo Leishmania chagasi parásitos, constituye un importante problema de salud en el Brasil. En los últimos años el número de casos humanos de la AVL en la región metropolitana de Belo Horizonte (MRBH), estado de Minas Gerais, Brasil ha aumentado, lo que indica una elevación en la tasa de transmisión de la enfermedad [1]. Los perros y zorros se consideran los principales depósitos de acogida para este parásito [2, 3]. El diagnóstico de la AVL se basa en características clínicas y epidemiológicas, por microscópico demostración del parásito en biopsias de aspirados, indirectamente por pruebas serológicas y los cultivos o métodos moleculares como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) [4 - 6]. Varias técnicas pueden ser utilizadas para el diagnóstico serológico de la AVL. La técnica de fluorescencia indirecta (IFI) es la técnica de elección hasta 1974 [7, 8]. Desde entonces contra el actual inmuno-electroforesis y ensayo inmunoenzimático (ELISA) han demostrado ser herramientas poderosas para el diagnóstico serológico de la leishmaniasis [9]. Además, otras pruebas serológicas se han desarrollado. La prueba de aglutinación directa (DAT) ha demostrado ser una importante herramienta de diagnóstico serológico de la combinación de altos niveles de validez intrínseca y la facilidad de ejecución [10 - 12]. La prueba utiliza su conjunto, manchados promastigotos ya sea como suspensión o en una forma liofilizada [10, 11, 13, 14]. Al utilizar el antígeno liofilizada, problemas logísticos, como la necesidad de una cadena de frío para el almacenamiento de antígeno, se evitan, con lo que la DAT muy adecuado para su uso en condiciones de campo.

A pesar de que la prueba de aglutinación directa (DAT) para el diagnóstico serológico de la leishmaniasis visceral tiene una alta sensibilidad y especificidad [6, 13, 14], que todavía tiene algunas limitaciones, como la relativa a largo tiempo de incubación (18 h) y la necesidad de una serie Diluciones de la sangre o suero. Con el fin de evitar estos problemas Schoone et al. [15] desarrolló una aglutinación rápida de la prueba de cribado (FAST) para la detección rápida de anticuerpos anti-Leishmania en muestras de suero y en la sangre recogida sobre papel de filtro. El FAST utiliza sólo una dilución de suero (resultado cualitativo) y requiere de 3 horas de incubación. Esto hace que la prueba muy adecuado para el cribado de grandes poblaciones.

La creciente importancia de la AVL en el hombre y su alta tasa de letalidad en la Región Metropolitana de Belo Horizonte (MRBH) indican que una rápida y relativamente sencillo método que se necesita para el diagnóstico de rutina de esta enfermedad. El objetivo de este estudio fue evaluar y DAT FAST AVL como posibles métodos de diagnóstico utilizando muestras clínicas de esta región de Brasil.

Materiales y métodos
Las muestras de suero

Este estudio se llevó a cabo utilizando muestras de suero de los diferentes grupos de pacientes de la región metropolitana de Belo Horizonte (MRBH), Minas Gerais Estado y de algunas muestras de control de otras regiones (véase más adelante). Las muestras y la información de los pacientes (edad, sexo, sintomatología, clínica, dirección) se enviaron al laboratorio a través de los actuales sistemas de atención de salud de MRBH, Minas Gerais, Brasil. Se obtuvo el consentimiento por escrito del paciente o de su familiar para este estudio.

Los siguientes grupos de muestras se incluyeron en el presente estudio:

1. Las muestras de suero de los pacientes AVL confirmado parasitológicamente (examen microscópico de los frotis aspirado de médula ósea) (n = 16).

2. Las muestras de suero de pacientes con sospecha clínica de la AVL (fiebre, bazo ampliación, palidez, pérdida de peso), pero no confirmado parasitológicamente (n = 99).

3. Las muestras de suero de pacientes con leishmaniasis cutánea activa las lesiones (n = 85).

4. Las muestras de suero de los pacientes confirmados con la enfermedad de Chagas (n = 12)

5. Las muestras de suero de los pacientes (Uganda) confirmó con tripanosomiasis africana (n = 5)

6. Las muestras de suero de los pacientes con (Kenya) confirmó p. El paludismo por Plasmodium falciparum (n = 5)

7. Las muestras de suero de los pacientes confirmó la toxoplasmosis (Los Países Bajos) (n = 5)

8. Las muestras de suero de individuos aparentemente sanos de una región endémica AVL en Brasil (n = 19)

9. Las muestras de suero de los donantes de sangre sanos de una organización no endémicas de la región (Países Bajos; n = 5)

Serología

La presencia de anticuerpos contra Leishmania en todas las muestras de suero se determinó por FAST y DAT. Un subconjunto de las muestras (grupos 1 - 3) También se analizaron con IFAT. Antígeno para FAST DAT y se prepararon como se describe anteriormente [13, 15]. El FAST se realizó de acuerdo al protocolo descrito anteriormente [15]. En resumen, las muestras de suero se diluyeron 1:100 en suero fisiológico (NaCl 0,85%) a los que 0,78% β - mercaptoetanol se añadió en una forma de "V" placa de microtitulación (Greiner, Alemania). A continuación, 20 μ l de esta dilución 1:100 fue transferida a otro y de la forma de "V" y la placa de microtitulación 20 μ l FAST antígeno (2 × 10 8 promastigotes / ml) se añadió. La placa fue sacudido con cuidado, cubierto con una tapa y se permite que se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente después de que se leyeron los resultados. Proceda controles positivos y negativos siempre fueron incluidos en cada plato.

El DAT se realizó fundamentalmente a lo descrito previamente por [10, 13]. En breve, las muestras fueron diluidas en suero fisiológico (0,9% NaCl), que contiene 0,78% β - mercaptoetanol. Dos veces la serie de dilución de los sueros fueron hechas en una forma de "V" placa de microtitulación, a partir de una dilución de 1:100 (paso 1) y va hasta un máximo dilución de suero de 1:102.400 (paso 11). Bueno 12 se utilizó como control negativo. Cincuenta μ l DAT antígeno (concentración de 5 × 10 7 parásitos por ml) se añadió a cada pozo que contenía 50 μ l diluido en suero y los resultados fueron leídos después de 18 horas de incubación. El valor de corte de la DAT se fijó en> 1:800.

La IFAT es, debido a problemas logísticos, sólo realizó una selección de las muestras de suero utilizando un kit comercial para el diagnóstico de la leishmaniasis humana (Fiocruz / Bio-Manguinhos, Río de Janeiro, Brasil). IFAT se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante para la detección de anticuerpos en el suero diluido desde 1:40 hasta 1:640.

Análisis estadístico

La sensibilidad y especificidad de la DAT y FAST en el presente estudio se calcularon de la siguiente manera: Sensibilidad = TP / (TP + FN) × 100% y especificidad = TN / (TN + FP) × 100%. Cuando TN representa cierto negativo, TP verdaderos positivos, falsos negativos y FN FP falsos positivos. La sensibilidad de ambas pruebas, FAST y DAT, fue evaluada con sueros de los pacientes confirmó AVL (n = 16). Sera de los controles (n = 24) y sueros de pacientes con otras enfermedades confirmado (n = 112) fueron utilizadas para determinar la especificidad de DAT y FAST.

El grado de acuerdo entre FAST, DAT y IFAT se determinó mediante el cálculo de Kappa (κ) con valores de los intervalos de confianza del 95% usando Epi-Info versión 6. Kappa valores más allá de expresar el acuerdo de cambio y un valor κ de 0,21 - 0,60 representa un acuerdo justo a moderada, un valor κ de 0,60 - 0,80 representa un acuerdo sustancial y una κ> 0,80 representa casi perfecta más allá del acuerdo de cambio [16]. El cálculo del grado de acuerdo entre DAT y FAST se basa en todas las muestras de suero, mientras que los valores de κ DAT-IFAT y FAST - IFAT sólo se basa en los resultados obtenidos con los confirmados y sospechosos AVL muestras de suero.

Resultados

Los resultados de los análisis serológicos con DAT y FAST se presentan en las tablas 1 y 2, respectivamente. La sensibilidad de la DAT, en el presente estudio se calculó a ser del 100% y la especificidad 97,8% (3 falsos positivos). El FAST presentó una sensibilidad del 100% y una especificidad del 92,5% (11 falsos positivos). Los resultados de las pruebas de IFAT se presentan en la Tabla 3. La sensibilidad y especificidad de la IFAT no puede ser calculado de manera adecuada como un número suficiente de muestras negativas no fue analizado con esta prueba. Cabe señalar que la prueba IFAT 1 confirmado AVL paciente negativos y 7 pacientes sólo tenían un bajo IFAT título. En cambio, IFAT encontró un 50% de los pacientes confirmados de listas de control de seropositivos, mientras que ni DAT FAST ni fue capaz de detectar estos anticuerpos en muestras de suero. El DAT encontrado 77 de los 99 muestras de pacientes sospechosos (aunque no confirmado parasitológicamente) de la AVL positivo. Se observó que los pacientes fueron 79/99 y 84/99 FAST positivo IFAT pacientes fueron positivos con diluciones de suero que van de 1:40 a 1:640.

Un alto grado de acuerdo (96%) se observó entre FAST y DAT (Cuadro 4a]. El acuerdo más allá de cambio (valor κ) fue de 0,92. Además, se observó un acuerdo sustancial entre DAT y IFAT (93%; Cuadro Cuadro 4b] o FAST y IFAT (94%; Cuadro Cuadro 4c], con κ valores de 0,75 y 0,80, respectivamente.

Discusión

En vista de la importancia para la salud pública de la AVL y las dificultades inherentes de las técnicas de diagnóstico convencionales, evaluados en el presente estudio el desempeño de las pruebas de diagnóstico serológico, DAT y FAST. Tanto los ensayos muestran una muy alta sensibilidad y especificidad corroborar con estudios anteriores [10, 13 - 15]. Se observa que la sensibilidad de DAT y FAST observada en el presente estudio se determinó a través de un número relativamente escaso de pacientes confirmados, y, por tanto, una sensibilidad de 100% no es reclamado.

El antígeno DAT y en la que se basan FAST es una cepa de L. Donovani, mientras humana y canina de la leishmaniasis visceral en el Brasil es causada por Leishmania chagasi, ambos pertenecientes a la especie L. Donovani complejo. Aparentemente, el uso de un antígeno heterólogo no afectó el desempeño de ambas pruebas para la detección de anticuerpos anti-Leishmania en pacientes brasileños AVL. El DAT encontrado todas confirmado parasitológicamente AVL pacientes positivos a una dilución de suero de ≥ 1:800, que posteriormente fue utilizado como el corte de dilución en el presente estudio. Esta dilución de suero es comparable a la corte diluciones encontrado en otros estudios [13, 14]. El FAST también se encuentran todos los casos confirmados positivos, lo que debería ser el caso ya que esta prueba es como una prueba de selección que no debe perderse cualquier AVL paciente. Este resultado es aún mejor que la anterior evaluación de la FAST en el que se perdieron algunos casos [15].

También hemos comparado el rendimiento de IFAT DAT con FAST y en muestras séricas de la AVL casos confirmados y sospechosos. La IFAT perdido confirmó un paciente que tuvo una muy alta DAT suero de dilución. Por otra parte, IFAT encontrado algo más sospechosos ALV pacientes positivos (84/99) que en DAT (77/99) o FAST (79/99) lo hizo. Sin embargo, hubo en general un muy buen acuerdo entre los resultados de las tres pruebas con respecto a la seo-diagnóstico de la AVL. Por el contrario, tanto FAST y DAT encontró sólo un número muy limitado de ACL casos seropositivos. IFAT encuentra aproximadamente el 50% de estos casos positivos, en general, aunque con muy bajas concentraciones séricas de títulos. DAT y FAST basado en L. Donovani antígeno no son adecuadas para el diagnóstico serológico de la lista de control de acceso [13].

Conclusión

Como observaciones finales, podemos concluir que DAT y FAST son herramientas muy adecuadas para el diagnóstico serológico de la AVL. Ambas pruebas son fáciles de interpretar, además de ser sensibles y específicos. El DAT es muy práctica bajo condiciones de campo o zonas rurales, ya que no se requiere equipo especializado ni una cadena de frío es necesario para el almacenamiento de antígeno. Además, el FAST requiere sólo una dilución de suero y los resultados se pueden leer dentro de las 3 horas. El FAST se puede utilizar para pantalla de gran población, por ejemplo, en situaciones como las epidemias, donde gran número de sospechosos son vistos en la clínica o los casos en que el tratamiento inmediato es necesario.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

ES Silva realizó los trabajos prácticos como parte de su estudio de doctorado, en parte en Brasil y en parte en los Países Bajos, escribió el concepto del papel. Schoone GJ técnico de la investigación realizada parte de la muestra y análisis de datos, producida y DAT FAST antígeno e inventó la prueba FAST. Gonijo CMF participó en el diseño del estudio, el trabajo práctico supervisado en Brasil y ayudó a escribir el concepto del papel. Pacheco RS y Brasil RP ex supervisores de Silva ES participó en el diseño del estudio. Schallig HDFH supervisó el trabajo práctico en los Países Bajos, el análisis de datos, preparación final del manuscrito, autor de

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación Hubrecht-Janssen (Amsterdam, Países Bajos). Esta investigación recibió apoyo financiero del PNUD / Banco Mundial / OMS Programa Especial para Investigación y Capacitación en Enfermedades Tropicales (TDR), la concesión de 10245 Director del Fondo de Iniciativa.